Nous tenons à remercier Mme Christine A. Winters pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par le Programme de neurosciences de base du Programme de recherche intra-muros NINDS, NIH (Z01 NS002610).

L&#39;approche décrite ici a été développé en utilisant des instruments, des outils et des logiciels. Parce que les laboratoires ne seront pas utiliser le même dispositif expérimental de la démarche est généralisée, si possible. Une. La congélation rapide La méthode d&#39;analyse d&#39;être décrite est tout à fait dépendante de méthodes cryogéniques pour: 1) la &quot;cryofixation&quot; des cellules ou des tissus d&#39;une manière qui préserve quantitativement la distribution des composants des tissus diffusibles et éléments chimiques comme ils l&#39;étaient dans des cellules vivantes à l&#39;instant de congélation et 2) la préparation d&#39;ultramince cryosections approprié pour l&#39;imagerie et l&#39;analyse dans un TEM. Ces techniques sont brièvement décrites ici, mais les détails nécessaires pour reproduire ces procédures dans d&#39;autres laboratoires sont au-delà de la portée de cet article. Les lecteurs intéressés sont appelés à d&#39;excellents articles récents 9,14. Attention: Cette section décrit l&#39;utilisation de savon mouéthane efied, qui est hautement inflammable et potentiellement explosif; précautions appropriées devraient être prises. L&#39;opérateur doit également se familiariser avec de l&#39;azote liquide (LN2) les mesures de sécurité, y compris couche protectrice de laboratoire, des lunettes et des gants cryoresistant. Remarque: Ici comme partout, tous les outils (pinces, etc) utilisés pour manipuler les échantillons congelés doivent être pré-refroidies dans LN 2 avant utilisation pour éviter la décongélation accidentelle. Les cellules cultivées sur des lamelles couvre <ol><li> Préparer un dispositif de gel profond par condensation de l&#39;éthane gazeux à -160 ° C dans la LN puits central 2 refroidi. Remplir à la marque et couvrir le puits avec le couvercle pivotant en aluminium lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. </li><li> En utilisant des cales de papier-filtre, tache lamelles en plastique de cellules cultivées dans des conditions appropriées expérimentalement à un film aqueux mince. Éponger à partir du bord de façon à éviter de toucher le tissu, le film résiduel idéal, déterminé par essai-erreur, est aussi mince que possible, mais pas si edans d&#39;évaporer et de permettre le séchage de la surface du tissu. </li><li> En tenant la lamelle couvre-objet par le bord avec une pince de serrage, rapidement plonger dans de l&#39;éthane liquide, soit manuellement, soit à l&#39;aide du piston de la gravité alimenté. </li><li> Placer la lamelle congelé dans un bol en polystyrène expansé à proximité de LN 2, assez grand pour manipuler le nombre souhaité de lamelles couvre-objet dans des récipients de stockage à long terme. boîtes à bouchon à vis en aluminium qui ne saisissent pas sous LN2 sont recommandés. </li></ol> Congélation rapide des tranches de cerveau de culture <ol start="5"><li> Sous un microscope de dissection, vue et orienter une tranche de l&#39;hippocampe organotypique, intact et toujours attaché à l&#39;insert de membrane de culture. Placez points repères sur la membrane près du bord de la tranche avec un stylo Sharpie black-type et la photographie. </li><li> Encore sous le microscope, couper env. 5 x 5 mm carrés de membranes avec des tranches individuelles centrées sur les places. Évitez de toucher la tranche ou la flexion du membrane. </li><li> Monter une tranche de membrane soutenu, amortie par un ¼ dans la garniture de gélose de diamètre, sur un disque en aluminium conçu sur mesure pour s&#39;adapter à un cryoultramicrotome (décrit ci-dessous). Rapidement geler la tranche par pneumatique projetant contre un bloc de saphir LN 2-refroidi au moyen d&#39;un dispositif sur mesure &quot;claquement de congélation&quot;. </li><li> Déplacer vers stockage comme décrit pour les cellules en culture. </li></ol> 2. Cryosectioning MISE EN GARDE: produire avec succès des rubans de coupes ultrafines sec coupées, tandis que simple et logique, une formation, de la patience et beaucoup de pratique. <ol><li> Cuire un cryoultramicrotome équipé d&#39;un cryoattachment et laisser refroidir à -135 ° C. </li><li> Couper des lamelles congelés dans env. 3 x 3 cases mm en utilisant un pointu, scalpel préalablement refroidi. Incluez morceaux avec des cultures vers le haut dans un liquide &quot;cryoglue&quot; visqueux (un mélange 01:06 d&#39;éthanol et de 2-propanol 11), type sur 3mm broches d&#39;aluminium de diamètre conçu pour s&#39;adapter à l&#39;échantillon mandrin microtome. Éviter les fuites cryoglue sur la surface de culture. Solidifier cryoglue en abaissant la température de cryobox à ≤ 160 ° C. <ul class="lalpha"><li> Pour des tranches de cerveau congelés, fixer les disques directement à un échantillon mandrin sur-mesure au moyen d&#39;un collier à vis. </li></ul></li><li> Coupez des régions choisies des échantillons congelés - par exemple les zones riches cellules de pièces de lamelle ou domaines identifiés de tranches - une env. Face de bloc de 250 x 250 um et environ 100 um de profondeur à l&#39;aide d&#39;un outil de coupe au diamant. </li><li> Rubans sec coupe de lames minces à ca. -160 ° C en utilisant un diamant cryoknife 35 °, essentiellement comme décrit dans Références d&#39;4, 9. Vitesse de coupe et angle de dégagement du couteau sont déterminées de manière empirique, un bon point de départ est de 0,4-0,6 mm / sec à 9 °. L&#39;épaisseur nominale, c&#39;est à dire spécimen avance, des articles hydratés is typiquement 80 nm, bien que les articles sont en fait de 1,5 2.0x plus épais, principalement due à la compression. Pour sectionnement satisfaisante, un dispositif antistatique est essentiel. Placez la pointe ionisante des périphériques de 0,5-1 cm du bord de couteau et régler la puissance de sortie jusqu&#39;à rubans satisfaisantes des articles sont produits. </li><li> Préparer des sondes de cils par collage (époxy) cils de bois bâtons applicateurs. En utilisant une telle sonde, ramasser et sections de transfert de l&#39;arrière de la lame sur des films de soutien pioloform revêtues de carbone lueur déchargée exprimés plus de 100 mailles des grilles de cuivre de pliage et reposant sur une indium enveloppe d&#39;aluminium plié en deux sur une étagère de travail derrière le couteau. Replier la moitié supérieure de la grille et l&#39;enveloppe, la presse avec un outil pression à froid. </li><li> Transfert grilles enveloppés dans une boîte de grille pratique et la ranger dans un aluminium peuvent, comme décrit dans l&#39;étape 1.4. </li></ol> 3. Cryotransfert des échantillons à la microscope électronique L&#39;instrument de base pour EPMAdans ce laboratoire est un microscope électronique analytique fonctionnant à 120 kV et équipé pour cryo-microscopie, qui est, conçu avec un vide propre, spécimen anticontaminator-zone, une haute sensibilité appareil photo numérique 2k x 2k et cryotransfert support de spécimen. Vérifier au préalable l&#39;alignement du microscope et des conditions de fonctionnement dans les deux modes à faible et à fort grossissement et confirmer un vide de la colonne satisfaisante, idéalement ≤ 10 -7 Torr. Tune up si nécessaire. <ol><li> Confirmer que l&#39;isolation sous vide de la composante de la cryoholder Dewar est satisfaisante. Pompe selon les besoins. </li><li> Refroidir le cryoholder à sa température minimum, au moins 160 ° C, tandis que sous vide poussé dans la platine du microscope, détachez le câble reliant le titulaire à son boîtier de commande. Inclinez le goniomètre 45 ° vers la droite avant de retirer le support de minimiser LN 2 répandre sur les surfaces de l&#39;opérateur et du microscope. </li><li> Préparer la cryoworkstation de paillasse par le refroidissement de la isoler intégranted tasse à ≤ 160 ° C. </li><li> Transfert (quickly!) le cryoholder refroidi de microscope à Cryo poste de travail. Rétracter gel bouclier de la porte. </li><li> Récupérer sous LN 2, un sandwich au réseau de stockage et de place sur la table de travail de la cryoworkstation. Un anneau de retenue pour l&#39;échantillon le puits de la titulaire est également mis sur la table. </li><li> Ouvrez l&#39;enveloppe d&#39;indium et déplacer la grille de pliage ci-joint pour le bien de l&#39;échantillon de la cryoholder. Fixez la grille avec la bague de retenue en utilisant l&#39;outil de clé fournie et fermer l&#39;écran de gel. </li><li> Enlever rapidement la cryoholder du cryoworkstation et l&#39;insérer dans le sas du microscope et de passer par la séquence de pompage le plus rapidement possible. Lors de l&#39;insertion, il devrait y avoir une interruption minimale du vide de la colonne. </li><li> Goniomètre revenir à 0 ° d&#39;inclinaison. Rebranchez et redynamiser le boîtier de commande et de confirmer que la température de l&#39;échantillon est ≤ 150 ° C. </li><li> Remplir le Dewar de laporte-échantillon et permettent vide et la température se remettre complètement. </li></ol> 4. Enquête visuelle des sections <ol><li> Rentrer le bouclier de gel de la porte pour exposer spécimen et tourner sur le faisceau d&#39;électrons. </li><li> Évaluer visuellement l&#39;échantillon à faible grossissement, généralement 250X, et un éclairage faible. Comme illustré sur la figure 1, les sections doivent être minces et lisses, non pliée ou en chevauchement, plane et bien attaché à la feuille de support, et généralement pas obscurcie par les barres de la grille. </li><li> Éventuellement photographier sections choisies. (REMARQUE: Réduire l&#39;exposition au faisceau, depuis les coupes congelées hydraté sont très sensibles aux dommages induits par faisceau.) Utilisez la platine de goniomètre numérique automatisé pour stocker les coordonnées des articles sélectionnés. </li></ol> 5. La lyophilisation des articles <ol><li> Lyophiliser sections en augmentant la température de titulaire à ca. 100 ° C pendant environ 30 min. </li><li> Recool support à -160 ° C ou moins. </li><li&gt; Avant imagerie, éteignez l&#39;unité de contrôle de cryoholder et câble de contrôleur physique déconnexion pour éviter la dérive de l&#39;image due à un cycle thermique et / ou des vibrations ramassage. </li></ol> 6. Imagerie des cellules et des organites Images structurels des articles lyophilisés sont obtenus à ca. -160 ° C, à faible dose, les images sans perte enregistrés numériquement à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD à balayage lent 2k x 2k contrôlé par un logiciel approprié. <ol><li> Activez l&#39;EM en mode salut-mag. </li><li> Choisissez et de l&#39;image à ~ 2000 X (comme TIFF, voir la figure 2) cellules sélectionnées et les zones sub-cellulaires d&#39;intérêt dans les sections de haute qualité dont les emplacements ont déjà été enregistrées et stockées. (NOTE: Les sections sèches sont maintenant beaucoup moins fragile et moins sensible aux électrons du faisceau dommages. </li><li> Évaluer images afin de sélectionner des régions d&#39;intérêt (ROI) pour analyse aux rayons X. Cette étape peut éventuellement être effectuée hors ligne, auquel cas l&#39;EM peut être tournéet hors de l&#39;échantillon laisse se réchauffer à la température ambiante. </li></ol> 7. Acquisition de rayons X Spectra Spectres de rayons X peut être enregistré en utilisant n&#39;importe quel de plusieurs commerciale conçue sur mesure ou X-ray systèmes d&#39;analyse minimum consistant en un X (EDX) détecteur à dispersion d&#39;énergie, l&#39;électronique impulsion processeurs et logiciels associés d&#39;acquisition et d&#39;affichage compatible. (Le système utilisé dans ces travaux est décrit dans le tableau 1.) <ol><li> Configurer l&#39;EM pour l&#39;acquisition de rayons X par l&#39;insertion, le détecteur EDX dans la colonne (si nécessaire), le retrait de l&#39;ouverture objectif, et l&#39;insertion et le centrage des ouvertures de rayonnement parasite. Ajuster le cryoholder à la plus basse température à laquelle le gel contamination de l&#39;échantillon est évitée, mais au moins au-dessous de -100 ° C. </li><li> Incliner le support à 20 ° vers le détecteur. </li><li> Dans des conditions de formation d&#39;image à grand champ, et en supposant que l&#39;on envisage d&#39;analyser la matrice d&#39;un individual mitochondries, choisissez une mitochondrie pour l&#39;analyse, le déplacer vers le centre du champ et de se concentrer. </li><li> Passer en mode spot (sur certains microscopes juste converger le faisceau en utilisant deuxième foyer du condenseur) et augmenter le courant de faisceau à ca. 3 nA (mesurée avec une cage de Faraday ou similaire) dans un endroit 100 nm. </li><li> Lancez le logiciel d&#39;acquisition de spectre et de commencer à 100 acquisitions sec, qui peut être consulté temps en direct sur l&#39;écran d&#39;affichage. Enregistrer spectre enregistré (Figure 2). Le format EMSA standard de l&#39;industrie est préférable. </li><li> Arrêtez l&#39;EM et transférer le fichier (s) multi-spectres à un (offline) analyse poste de travail. </li></ol> 8. Analyse des rayons X Spectra L&#39;analyse qualitative Un spectre EDX (figure 2, en médaillon) est essentiellement un complot xy de l&#39;intensité des rayons X vs énergie. Spectra contiennent des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de til a analysé volume, en ce que l&#39;énergie &quot;caractéristique&quot; d&#39;un pic identifie l&#39;élément donnant lieu à ce que l&#39;intensité maximale alors que reflète la quantité de cet élément. Les pics caractéristiques montent au-dessus d&#39;un fond lentement variable, le &quot;continuum&quot;. (La légende de la figure 2 présente en outre des détails importants sur les spectres EDX). L&#39;énergie des collecteurs de pointe pour l&#39;ensemble du tableau périodique sont définis par la structure électronique bien connue d&#39;éléments, donc tous les liens de logiciels EDX à une base de données qui identifie automatiquement les éléments de un analyte. Dans un contexte physiologique, éléments d&#39;intérêt général qui sont bien adaptées à l&#39;analyse EDX comprennent Na (K α à 1,04 keV), P (2,01 keV), K (3,31 keV) et Ca (3,69 keV). <ol><li> Profitez de base de données de logiciels disponibles et routines pic correspondant à identifier les éléments majeurs dans les spectres. Dans un échantillon biologique s&#39;attendre à trouver des pics de Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et. (ATTENTION:Les deux derniers éléments se superposent!) </li></ol> Analyse quantitative L&#39;analyse quantitative des spectres EDX consiste à extraire l&#39;aire intégrée des pics identifiés, et la conversion de cette valeur à une concentration. Pour l&#39;analyse biologique, la méthode est la méthode établie pic / continuum salle 4,7,10, qui tire parti du fait que l&#39;intensité du continuum (défini ci-dessus et sur ​​la figure 2) est proportionnelle à la masse sèche du volume analysé . Ainsi, le rapport du pic de la zone / zone continuum, par rapport au même rapport dans les spectres de normes de composition connue, indique la concentration dans le compartiment cellulaire ciblée. Notez que cette approche fournit des concentrations en unités de moles par poids, généralement exprimées en mmol / kg de poids sec. Cette unité est inhabituel et d&#39;interprétation peut exiger la conversion supplémentaire, par exemple, mmol / L poids humide ou mmol / mg de protéine, comme décrit elsewhere 4,10. <ol start="2"><li> Extraire des zones de pointe (et des estimations d&#39;erreur) d&#39;éléments biologiques entre Z = 10 à 20 (0,5 à 4,0 keV), à savoir Na, Mg, P, S, Cl, K, Ca et, avec l&#39;une des routines de montage intégrée dans le logiciel d&#39;analyse (voir le tableau 1, en ​​particulier la note 4). Ce laboratoire utilise Simplex ou plusieurs places-moins approprié. Notez que cette mise en place nécessite une attention particulière à la résolution du chevauchement entre K et Ca pics (voir la figure 2). </li><li> Intégrer le continuum entre 1,45 à 1,61 keV. Régions sans interférences alternatives peuvent être utilisées. </li><li> Le calcul des ratios de pointe / continuum puis concentrations par rapport aux normes. Propager des erreurs tout au long de l&#39;analyse. </li><li> Utiliser des logiciels et des formules statistiques standard pour estimer les moyennes qui reflètent la variabilité biologique. </li></ol>

<ol>
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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons.">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li></ol>

Les auteurs rapportent aucun conflit d&#39;intérêt.

La méthode analytique basée microscope à électron présenté ici permet la détection, l&#39;identification et la quantification de plusieurs éléments d&#39;intérêt biologique, notamment Na, K, P, Ca et surtout. Ces analyses peuvent être effectuées à subcellulaire, soit intra-organite, la résolution en raison de la capacité de localiser et d&#39;identifier les structures d&#39;intérêt dans les images de haute qualité de cryosections préparés à partir de spécimens congelés rapidement. Notez ...

Les ions calcium sont sans doute entité de signalisation cellulaire le plus important et polyvalent en biologie, en jouant un rôle essentiel dans les processus normaux aussi divers que la transmission synaptique et l&#39;expression des gènes. D&#39;autre part, le calcium est également important dans la mort cellulaire. En particulier, la déréglementation de calcium est un facteur clé dans les lésions neuronales dans l&#39;AVC, la maladie de Parkinson, la maladie d&#39;Alzheimer et autres maladies neurodégénératives 3,5. Ainsi, il est important de comprendre quantitativement comment le calcium est distribué dans les cellules, et comment cela change suivant stimuli physiologiques ou physiopathologiques. Ce but est compliquée par le fait que le calcium est distribué de façon dynamique entre les deux états physiques - libres en solution ou lié à un substrat - et que les concentrations en calcium cellulaire changé au cours de plusieurs ordres de grandeur à la suite d&#39;une stimulation. Bien qu&#39;il existe plusieurs méthodes avancées disponibles pour l&#39;analyse de free calcium intracellulaire, la détermination des concentrations totales de calcium dans les compartiments intracellulaires définies est réaliste limitée à une approche, à savoir, microsonde électronique (EPMA). EPMA est une technique qui couple un spectromètre à rayons X à un microscope électronique à transmission (MET). Le canon à électrons de TEM se concentre une sonde électronique fixe, submicronique sur une région subcellulaire d&#39;intérêt et les rayons X spécifiques à un élément émis à la suite d&#39;un bombardement d&#39;électrons sont recueillies et analysées (voir les références 7, 4 pour les examens techniques détaillées). Avantages de l&#39;EPMA comprennent résolution unique au niveau de l&#39;organite et sensibilité submillimolar. En pratique, cependant, EPMA nécessite cryotechniques spécialisées et de l&#39;instrumentation pour la préparation et l&#39;analyse spécimen. Ici, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour les mesures de calcium intracellulaire utilisant EPMA sont décrits. Calcium intramitochondrial est de i spécialentérêt en raison du rôle crucial que joue la surcharge de calcium mitochondrial dans les maladies neurodégénératives.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS/MATERIALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermanox plastic coverslips</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>72280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353090</td>
			<td>For 6-well plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryopins</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>16701952</td>
			<td>Grooved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood applicators</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>72300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folding EM grids</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>4GC100/100</td>
			<td>100 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium foil</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>13982</td>
			<td>0.25 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge freezing device</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>KF-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slam freezing device</td>
			<td>LifeCell</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoattachment for microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>FC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryotrimming tool</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryotrim 45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond cryoknife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Cryo 35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antistatic device</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Hauf Static Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo electron microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>EM912 Omega</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM cryo specimen holder</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>CT3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slow-scan CCD camera, 2k x 2k</td>
			<td>Troendle (TRS)</td>
			<td>Sharpeye</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Olympus SIS</td>
			<td>iTEM suite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ED x-ray detector</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>Linksystem Pentafet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulse Processor</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>XP-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCI backplane card</td>
			<td>4pi Systems</td>
			<td>Spectral Engine II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Any OS9-compatible model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray analysis software</td>
			<td>NIST</td>
			<td>DTSA, DTSA II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<ol>
				<li>The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.</li>
				<li>A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at <a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li>
				<li>The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.</li>
				<li>The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of total calcium in neurons by electron probe x-ray microanalysis

Dans cet article, les outils, les techniques et les instruments appropriés pour des mesures quantitatives de contenu élémentaire intracellulaire en utilisant la technique dite de la microsonde électronique (EPMA) sont décrits. Calcium intramitochondrial est une attention particulière en raison du rôle essentiel que la surcharge calcique mitochondriale joue dans les maladies neurodégénératives. La méthode est basée sur l&#39;analyse des rayons X générés dans un microscope électronique (EM), par l&#39;interaction d&#39;un faisceau d&#39;électrons avec l&#39;échantillon. Afin de maintenir la distribution d&#39;éléments native diffusibles dans les échantillons en microscopie électronique, EPMA nécessite &quot;cryofixation&quot; du tissu suivie de la préparation de coupes cryogéniques ultraminces. La congélation rapide des cellules en culture ou des cultures de tranches organotypiques est effectuée par congélation plonger dans de l&#39;éthane liquide ou un gel par le claquement contre un bloc de métal froid, respectivement. Cryocoupes nominalement 80 nm d&#39;épaisseur sont coupées à sec avec un couteau de diamant à ca. -16076, C, monté sur carbone / grilles de cuivre pioloform revêtu, et cryotransferred dans un cryo-EM en utilisant un support de cryospecimen spécialisé. Après inspection visuelle et la cartographie de l&#39;emplacement à une température ≤ 160 ° C et une faible dose d&#39;électrons, cryosections congelés-hydraté sont lyophilisés à -100 ° C pendant ~ 30 min. les images au niveau des organites de cryosections séchées sont enregistrées, également à faible dose, au moyen d&#39;une caméra CCD à balayage lent et les régions sous-cellulaires d&#39;intérêt sélectionné pour analyse. les rayons X émis par ROI par une sonde fixe, concentré, à haute intensité électrons sont collectés par un X-ray à dispersion d&#39;énergie (EDX) spectromètre, traitée par l&#39;électronique associée, et présenté comme un spectre de rayons X, qui est un terrain de l&#39;intensité des rayons X vs énergie. Logiciel supplémentaire facilite: 1) l&#39;identification des composants élémentaires par leur énergie et leur empreinte digitale de pointe «caractéristiques», et 2) l&#39;analyse quantitative par extraction de zones de pic / fond. Ce document se termine par deux exemples qui illustrent typiqueApplications EPMA, celui dans lequel l&#39;analyse du calcium mitochondrial fourni des informations essentielles sur les mécanismes de blessures excitotoxic et un autre qui a révélé la base de la résistance à l&#39;ischémie.

Les cellules du cerveau subissent généralement des blessures excitotoxic à la suite de la libération de neurotransmetteurs pathologique qui se produit dans des conditions ischémiques. EPMA était essentiel pour découvrir comment la capacité des mitochondries neuronales pour séquestrer des quantités massives de calcium sous-tend le mécanisme de la blessure. La micrographie électronique de la figure 3 illustre l&#39;aspect des mitochondries dans les cryosections lyophilisées de neurones d&#39;...

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Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Ce document décrit l&#39;application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies.

Mesure du calcium total dans les neurones par sonde électronique X-ray microanalyse

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K vues.  National Institutes of Health.  Ce document décrit l'application de la microscopie électronique cryoanalytical à la mesure quantitative de la teneur en calcium total et la répartition à la résolution subcellulaire dans des échantillons biologiques physiologiquement définies. 

Vidéo: Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

À grande échelle d&#39;enregistrement des neurones par des sondes de silicium mobiles à se comporter Rongeurs

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Préparation de neurones primaires pour visualiser Neurites à l&#39;état congelé-hydraté utilisant microscopie cryo-électronique

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Phosphate de calcium transfection de primaire neurones de l&#39;hippocampe

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de souris

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.