Ces méthodes permettent d’évaluer rapidement si une manipulation expérimentale, une protéine responsable de la maladie ou de l’ARN peut avoir un impact sur les processus synaptiques et si les composés thérapeutiques peuvent restaurer la fonction. Ces techniques fournissent une lecture fiable de la fonction synaptique d’un groupe de neurones dans un laps de temps relativement court par rapport à l’électrophysiologie. Ce protocole peut être appliqué à toute maladie de développement neuronal ou de dégénérescence.
Cela fonctionne bien pour les cultures neuronales primaires de rongeurs et pour les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Pour commencer, optimisez les paramètres d’acquisition d’image à l’aide d’un logiciel d’acquisition d’imagerie confocale. Maintenez le temps d’exposition de la puissance d’excitation, le gain du détecteur et la fréquence d’images constants sur tous les échantillons.
Pour l’imagerie en accéléré, sélectionnez un rapport d’aspect de 512 par 512 et une fréquence d’images de deux images par seconde pour minimiser le blanchiment des colorants. Sélectionnez ensuite les combinaisons d’excitation de fluorescence, de dichroïque et de filtre d’émission pour GCaMP six M/GCaMP trois avec Fitzy et le colorant stéaroyle avec Trixi. Pour éviter la dérive Z pendant l’imagerie en accéléré, utilisez la fonction de mise au point parfaite du logiciel d’acquisition d’imagerie confocale.
Ensuite, sélectionnez l’onglet temporel dans le panneau d’acquisition d’image. Pour la première phase, définissez l’intervalle de 500 millisecondes et la durée de trois à cinq minutes. Et pour la phase deux, définissez l’intervalle 500 millisecondes et la durée, cinq minutes.
Ensuite, pour assembler l’appareil de perfusion par gravité pour le liquide céphalo-rachidien artificiel ou ACSF, chargez le tampon ACSF à haute teneur en chlorure de potassium dans une seringue de 50 millilitres au sommet de l’appareil et réglez le débit à un millilitre par minute. Ensuite, chargez une boîte en verre de 35 millilitres contenant des neurones sur l’étage d’imagerie confocale avec l’extrémité du tube de perfusion placée au bord de la boîte et choisissez le champ d’imagerie. 48 heures après la transfection, incuber les neurones corticaux ou moteurs primaires dans un tampon ACSF à faible teneur en chlorure de potassium pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius.
Ensuite, retirez le tampon par aspiration et à l’aide d’une pipette, chargez les neurones dans l’obscurité sur une boîte de Petri à fond de verre remplie d’ACSF contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium et 10 micro-molaires de colorant styryl. Après cinq minutes, retirez la solution de chargement et baignez les neurones dans un tampon ACSF à faible teneur en chlorure de potassium à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour éliminer la charge de colorant non spécifique. Placez ensuite la parabole sur l’étage d’imagerie du microscope confocal inversé et observez les cellules sous un objectif 20 fois aérien ou 40 fois un objectif d’immersion dans l’huile.
Excitez le colorant en acier à l’aide d’un laser de 546 nanomètres et collectez les émissions à l’aide d’un filtre passe-bande de 570 à 620 nanomètres. Après avoir sélectionné le champ d’imagerie et effectué une mise au point parfaite, prenez une seule image fixe avec un champ lumineux, un Trixi et des canaux marqueurs de fluorescence pour marquer les limites neuronales. Ensuite, lancez Run Now dans le logiciel d’acquisition et effectuez l’enregistrement basal pendant trois à cinq minutes pour exclure les variations d’intensité du colorant.
Juste au passage à la phase deux, déclenchez le bouton d’activation du système de perfusion et perfuser constamment du chlorure de potassium de 50 millimolaires aux neurones pour faciliter le déchargement du colorant. Effectuez les enregistrements pendant cinq minutes, puis déclenchez l’interrupteur d’arrêt du système de perfusion. Enregistrez l’expérience pour une analyse ultérieure des données à l’aide du logiciel confocal.
48 heures après la transfection avec GCaMP six M, incuber les neurones corticaux primaires des rongeurs avec un faible taux de chlorure de potassium ACSF pendant 15 minutes. Montez ensuite la parabole sur la plate-forme d’imagerie et visualisez la fluorescence GCaMP six M à l’aide d’un filtre Fitzy et d’un objectif 20 fois ou 40 fois. Après avoir sélectionné le champ d’imagerie et effectué une mise au point parfaite, prenez une seule image fixe avec des canaux de marqueurs de champ lumineux, de Fitzy et de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
Ensuite, lancez Run Now dans le logiciel d’acquisition et effectuez l’enregistrement de base pendant trois à cinq minutes. Ensuite, perfuser ACSF contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium aux neurones comme démontré précédemment et enregistrer pendant cinq minutes. Lorsque l’acquisition d’image s’arrête, enregistrez l’expérience et passez à l’analyse des données à l’aide du logiciel confocal.
Pour l’analyse d’image, ouvrez les images en accéléré dans le logiciel confocal et alignez les images en cliquant sur Image, suivi du traitement, suivi de l’alignement du document actif, puis sélectionnez Aligner sur la première image. Sélectionnez les régions d’intérêt le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection du retour sur investissement et marquez également un retour sur investissement représentant l’intensité de fluorescence de fond. Ensuite, lancez la fonction de mesure à partir du panneau de mesure du temps pour mesurer la fluorescence brute au fil du temps pour les rois sélectionnés.
Après la mesure, exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur. Les neurones corticaux primaires de rat cultivés chargés de colorant styryl sont montrés ici. La spécificité de la charge en colorant a été déterminée par co-marquage avec la synaptophysine marqueur de la vésicule synaptique et la majorité des colorants stériles positifs sont co positifs pour ce marqueur.
L’analyse des valeurs d’intensité brute sur toute la période d’imagerie révèle que la synaptophysine et l’intensité restent constantes tandis que l’intensité du colorant styryl diminue après la stimulation. Pour les neurones témoins transfectés de protéines fluorescentes vertes, la libération réussie de vésicules synaptiques a entraîné une perte frappante de fluorescence des colorants lors d’une dépolarisation élevée du chlorure de potassium. Cette vidéo représentative montre un neurone déchargeant sélectivement un colorant styryl dans une nouvelle région droite après une stimulation.
En revanche, dans les neurones transfectés avec un C neuf ORF 72 lié à la construction de répétition peptidique de colorant à GA 50, la transmission synaptique altérée est représentée par une fluorescence de colorant retenue même après une dépolarisation élevée du chlorure de potassium. Des images de fluorescence représentatives de neurones corticaux transfectés avec GCaMP six M avant et après la dépolarisation au chlorure de potassium sont montrées ici. L’augmentation des valeurs de fluorescence et les neurones corticaux transfectés avec GCaMP six M indiquent une entrée de calcium dans les neurites après une dépolarisation induite par le chlorure de potassium.
À la fin de la période d’enregistrement de base, les neurones ont exprimé GCaMP six M avec une faible fluorescence. Une augmentation spectaculaire de la fluorescence est alors observée au début de la stimulation. Assurez-vous que les enregistrements de référence de fluorescence pour le colorant styryl et le GCaMP sont stables.
Utilisez toujours une mise au point parfaite pour éviter la dérive de l’image, ce qui rendrait le traitement des données post-image difficile. Une culture supplémentaire des neurones n’est pas recommandée, car les plats sont exposés à l’air pendant la profusion. Cependant, la coloration immunologique ou l’extraction de protéines ou d’ARN peut évaluer les causes potentielles des altérations synaptiques.
