Nous remercions l’installation StemCore de l’Université Monash pour la fourniture de lignes hESC et l’installation FlowCore de l’Université Monash pour les services FACS. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l’Australian Stem Cell Centre, du New South Wales and Victorian Government Stem Cell Research Grant Program à ALL. ALL est chercheur partenaire de l’Initiative de recherche spéciale en science des cellules souches de l’Australian Research Council (ARC), Stem Cells Australia.

Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de cultures en vrac standard hESC-MEL111 fournies par l’installation StemCore de l’Université Monash (Melbourne). Cette lignée cellulaire est systématiquement cultivée sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) inactivés mitotiquement dans des milieux hESC/KOSR complétés par bFGF7 et est maintenue avec dissociation enzymatique (collagénase) tous les 5-7 jours8. Les cultures de cseh cultivées à une confluence d’environ 80 % dans des fioles de 75 cm2 (T75) sont utilisées comme populations d’entrée pour ce protocole. Toutes les procédures de manipulation cellulaire décrites ci-dessous doivent être effectuées dans des conditions aseptiques dans une enceinte de biosécurité de classe II filtrée par HEPA.
Deux jours avant d’effectuer un essai TG30/GCTM-2 FACS, préparer les plaques de culture T75 (décrites à la section 1) qui doivent être utilisées pour la reculture des cellules récupérées après le FACS (décrites à la section 4).
1. Ensemencement des CMF et préparation du milieu conditionné par le MEF
1.1 JOUR -2: Placage des CGEM dans des fioles T75
<ol><li>Pipetter 10 ml de gélatine à 0,1 % p/v dans chaque fiole T75 et incliner la surface uniformément.</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à température ambiante dans une armoire de biosécurité.</li>
	<li>Aspirer la solution de gélatine.</li>
	<li>Ajouter 20 ml de milieu MEF dans le ballon et pré-équilibrer à 37 °C/5 % deCO2 pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Plaque mitotiquement inactivée MEFs sur fiole(s) préparée(s) aux densités suivantes. Pour 1/3 MEF densité graine 1,4 x 104 cellules/cm2 (T75= 1 x 106 MEF). Pour les semences MEF pleine densité 5,3 x 104 cellules/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF).</li>
</ol>Remarque: Nous utilisons par habitude les MEFs qui ont été mitotically inactivés par γ-irradiation. Un protocole pour la préparation des CMF irradiés par γ se trouve dans Michalska12.
<ol start="6"><li>Incuber les cultures de MEF irradiées à 37 °C/5 % deCO2 pendant la nuit. Les fioles 1/3 peuvent être incubées pendant 1-4 jours sans changement mef-moyen. Ces fioles sont utilisées pour la reformulation des cellules post-FACS (comme dans le protocole 4). Les fioles pleines de MEF sont incubées pendant la nuit pour générer du CM comme suit à l’étape 1.2 ci-dessous.</li>
</ol>1.2 JOUR -1: Préparation du milieu conditionné par le MEF (CM)
<ol><li>Aspirer le milieu MEF à partir de fioles T75 pleines de MEF.</li>
	<li>Ajouter un milieu hESC/KOSR prééquilibré de 25 ml complété par 5 ng/ml de FGF-2 humain par fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % deCO2 pendant 24 heures.</li>
	<li>Recueillir le milieu conditionné par le MEF (CM) dans un tube de culture de tissu stérile, compléter fraîchement le CM avec 10 ng/ml de FGF-2 humain et filtrer à l’aide d’un filtre en polyéthersulfone de 0,22 μm.</li>
	<li>Pour produire un CM supplémentaire, répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 quotidiennement sur la même culture MEF pendant une semaine.</li>
</ol>Le jour de l’exécution d’un essai TG30/GCTM-2, remplacer le milieu MEF dans des fioles T75 1/3 MEF par du CM et pré-équilibrer pendant au moins 30 min avant d’ensemencer les CSEh ou les cellules dérivées du CSEh récupérés de la procédure décrite ci-dessous. Le CM est utilisé frais ou conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Cm est utilisé dans ce protocole car dans nos mains il augmente la viabilité des cellules post-FACS par rapport aux milieux non conditionnés (résultats non montrés).
2. Exécution d’un test FACS TG30/GCTM-2 : Dissociation de cultures en vrac de cseh en cellules individuelles
Remarque : Prechill 20 % FBS/DMEM-F12 milieu à 4 °C.
<ol><li>Aspirer le support hESC/KOSR à partir de deux fioles T75 avec une ligne hESC cultivée.</li>
	<li>Rincer les cellules de chaque T75 avec 10 ml de DPBS et aspirer à les éliminer.</li>
	<li>Ajouter 3 ml de solution de dissociation TrypLE Express dans chaque fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % deCO2 pendant 5 min.</li>
	<li>Heurter le côté des fioles pour obtenir un délogement complet des cellules. Vérifier au microscope. Si les cellules ne se délogent pas facilement, incuber pendant encore 2-3 min à 37 °C/5 % deCO2.</li>
	<li>Ajouter 10 ml à 20 % de FBS/DMEM-F12 (maintenus à 4 °C) dans chaque fiole T75. À l’aide d’une pipette stérile de 10 ml, triturer doucement les cellules dissociées plusieurs fois contre la paroi du ballon pour obtenir une suspension principalement unicellulaire.</li>
	<li>Placer une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube stérile en polypropylène de 50 ml. Utilisez une pipette stérile de 10 ml pour forcer les suspensions monocellulaires hESC regroupées à partir des deux fioles T75 à travers la passoire.</li>
	<li>Jetez la passoire cellulaire, remplacez le couvercle du tube et centrifugez la suspension hESC en commun à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver les cellules en remettez doucement le culot dans 10 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C).</li>
	<li>Effectuer une deuxième centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, ajouter 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (préchilled à 4 °C) et triturer doucement pour ressusciter les cellules. Placez le tube de 50 ml sur de la glace. Ce tube sera utilisé pour la procédure d’immunomarquage de l’échantillon de tri décrite ci-dessous.</li>
	<li>Prendre 20 μl de la suspension monocellulaire hESC (étape 2.10) pour compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Vous devriez vous attendre à un rendement de 10-15 millions de cellules par flacon T75.</li>
</ol>Remarque: Fbs est employé dans cette partie du protocole pour augmenter la viabilité de cellules post-FACS.
3. Coloration immunofluorescente des antigènes de surface cellulaire TG30 et GCTM-2
<ol><li>Aliquote de 150 μl (~100 000 cellules) d’une suspension monocellulaire hESC (à partir de l’étape 2.11) dans chacun des six tubes microcentrifugés de 1,5 ml. Ces six aliquotes seront utilisées pour les contrôles de coloration nécessaires à l’étalonnage de l’essai sur la machine FACS. La suspension cellulaire restante d’environ 9 ml sera votre échantillon de tri dans lequel la culture dissociée sera cosinté pour la détection de TG30 et GCTM-2, selon les tableaux 1 et 2.</li>
	<li>Effectuer des réactions de liaison des anticorps primaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être d’environ 9 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Inclure les témoins d’isotypes comme anticorps primaires. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.</li>
	<li>Centrifuger les réactions d’anticorps primaires à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jetez le surnageant et lavez les cellules en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.</li>
	<li>Effectuer un deuxième tour à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Effectuer des réactions de liaison d’anticorps secondaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être de 2,5 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Préparez le tube de réaction PE-anti-souris CD90.2 à ce stade. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.</li>
</ol>Remarque: Pendant cette période d’incubation, il est pratique de collecter le CM et de préparer 1/3 de fioles MEF T75 avec du CM comme dans la section 1.2.
<ol start="7"><li>Centrifuger les réactions d’anticorps secondaires à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver les cellules DEUX FOIS en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.</li>
	<li>Effectuer un spin à 1 000 x g pendant 2 min après chaque lavage et placer des tubes sur de la glace.</li>
	<li>Jeter les surnageants et les pastilles cellulaires remises en suspension dans 20 % de FBS/DMEM-F12 complétés par de l’iodure de propidium (IP) à 0,3 μg/ml. Utilisez 2-3 ml pour l’échantillon de tri et 300 μl pour les contrôles.</li>
</ol>Remarque: NE PAS ajouter PI au tube de commande avec des cellules non colorées.
<ol start="11"><li>Utilisez une micropipette P1000 pour forcer chaque suspension cellulaire individuelle à travers une passoire de cellule de couvercle de 35 μm, couplée à des tubes à essai ronds en polystyrène à tube de 5 ml.</li>
	<li>Centrifuger à 50 g/min pour forcer à travers la suspension cellulaire résiduelle sur les couvercles de la crépine.</li>
	<li>Ressusciter chaque suspension à cellule unique en tapotant les côtés des tubes et la placer sur de la glace. Vos cellules sont maintenant prêtes pour le FACS. Je vous en prie, continuez tout de suite.</li>
</ol>4. Culture post-FACS de cellules de subfraction TG30/GCTM-2 dans des fioles de 75 cm2 (T75)
<ol><li>Nous avons précédemment rapporté comment mettre en place une machine FACS pour l’immunoprofilage TG30 /GCTM-2 7. La procédure permet la récupération de css uniques viables, exempts de CEM, et à l’intérieur des portes de P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)- voir figure 1E. Configurez la machine FACS pour le FACS TG30/GCTM-2 comme dans notre rapport précédent pour récupérer les sous-propriétés cellulaires à utiliser ensuite.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de CM, préparé comme à l’étape 1.2, à chacun des deux tubes à essai ronds de fond en polystyrène de 5 ml avant de prélever les cellules de la machine FACS. Placer sur la glace.</li>
	<li>Récupérez 400 000 cellules chacune à partir de sous-fractions de cellules P4 différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)et pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS.</li>
	<li>Centrifuger les tubes de collecte à 1 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirez les surnageants. Ajouter 1 ml préquilibré à 37 °C/5 % deCO2 CM pour ressusciter chaque pastille cellulaire à l’aide d’un micropipettor P1000. Ensemencer les cellules de chaque fraction sur une fiole prééquilibrée de 1/3 MEF T75 avec cm (préparée conformément à l’étape 1.2)</li>
	<li>Culture à 37 °C/5 % deCO2 pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Aspirer le CM tous les jours et le remplacer par du CM fraîchement préparé (comme à l’étape 1.2) pendant environ deux semaines. Les cultures de cellules P7 pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)montrent des colonies humaines ressemblant à des tiges après une semaine et atteignent une confluence d’environ 80% à 9-11 jours. Les cultures de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)se développent principalement comme une pelouse de cellules ressemblant à des fibroblastes qui atteint la confluence à 11-13 jours. À ce stade, si nécessaire, les cultures cellulaires P4 et P7 peuvent être utilisées pour la reculture consécutive médiée par TG30/GCTM-2 FACS de sous-propriétés P4 ou P7 (voir les figures 2 et 3).</li>
</ol>

<ol>
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Rien à divulguer.

Dans le contexte clinique, les types de cellules somatiques différenciés sont le produit final souhaité pour la transplantation et les applications thérapeutiques, et les hPSC sont une source auto-renouvelée et évolutive pour générer ces cellules somatiques ou leurs progéniteurs en laboratoire. La présence de CSEh indifférenciés résiduels avec un potentiel inhérent pour la formation de tératome est un risque pour la sécurité en considérant les cellules somatiques hESC-dérivées pour la transplantation dans les patients. Pour un examen de ce risque et d’autres risques associés à la thérapie cellulaire, veuillez consulter Sharpe et coll. 16 Par conséquent, pour réaliser de telles applications, il est impératif que les chercheurs visent à générer des populations de cellules cibles qui sont également exemptes de cellules souches pluripotentes. À cette fin, nous démontrons ici qu’en utilisant notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2, il est possible de surveiller la présence de cellules pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)dans une population de cellules différenciantes et d’obtenir des dérivés viables différenciés par hESC qui peuvent être enrichis et recultures post-FACS. Bien qu’il ne soit pas possible d’obtenir des échantillons 100% sans cellules souches pluripotentes avec un seul passage de notre protocole, les dérivés hESC enrichis peuvent être recultured et après un passaging consécutif 100% pureté des cellules somatiques est atteint. La viabilité démontrée des cellules somatiques pour l’expansion post-FACS permet également potentiellement la production d’un nombre adéquat de cellules adaptées aux thérapies de transplantation potentielles.
Les résultats encourageants de cette étude pilote nous ont incités à effectuer une enquête plus complète en utilisant notre protocole TG30/GCTM-2 dans une étude comparative avec plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)15. Dans cette étude, nous avons constaté que les échantillons sans cellules souches pluripotentes obtenus à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 ne généraient pas de tératomes lorsqu’ils étaient transplantés chez des souris privées d’immunité. Par conséquent, nous pouvons affirmer avec confiance qu’avec l’utilisation de ce protocole in vitro, les cultures cellulaires de différenciation à un stade précoce déterminées comme étant exemptes de cellules pluripotentes TG30 Hi-GCTM-2Hi ne développent pas de teratomas in vivo. Cela soutient fortement la robustesse de notre test, fournissant une approche potentielle pour éliminer le risque de formation de tératomes avant l’utilisation de cellules dérivées de hPSC dans des applications cliniques.
A l’inverse, nous montrons également que le test FACS TG30/GCTM-2 peut être utilisé pour récupérer une populationcellulaire pluripotente avec un niveau d’expression élevé de ces deux antigènes de surface (TG30 Hi-GCTM-2Hi). Des études antérieures ont montré que les cellules TG30Hi-GCTM-2Hi présentent la corrélation la plus élevée avecl’expression de l’oct4 hi et forment le plus grand nombre de colonies de type hESC5,6,13,15. Nous pensons donc que le réseau de pluripotence estactivé à ses niveaux maximaux dans les cellules exprimant TG30 Hi-GCTM-2Hi. Nous considérons que l’utilisation de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 et la récupération des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)pourraient permettre une purification à grande échelle des cultures hESC vivantes enrichies, en tant qu’entrées dans les tests de différenciation.
En conclusion, nous démontrons ici la potentialité de nos essais FACS basés sur l’expression combinée des antigènes de surface TG30 et GCTM-2 pour la purge et l’enrichissement des cseh. Les études futures avec des protocoles pour la différenciation dirigée des hPSCs sont susceptibles d’être également informatives concernant cette potentialité. Nous sommes conscients que dans certains essais où les dérivés hESC différenciés expriment temporellement TG30 (CD9) ou GCTM-2, ces deux anticorps pourraient ne pas être appropriés ou suffisants pour purger les cellules pluripotentes d’une population différenciée à un moment donné dans l’essai6. Par conséquent, il existe un besoin continu de trouver de nouveaux anticorps qui reconnaissent spécifiquement les CSEh vivants pour surmonter la limitation possible de la réaction croisée avec certains types de cellules différenciées.

Les CHP (CSEh) comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes d’origine humaine (CSEh). Le HPSC peut s’auto-renouveler indéfiniment dans des conditions de culture appropriées sans perdre sa capacité connue sous le nom de « pluripotence ». La pluripotence est définie comme le potentiel d’une cellule à se différencier en essentiellement n’importe quelle lignée cellulaire somatique, y compris les cellules représentatives de chacune des trois couches de cellules germinales embryonnaires. Le potentiel remarquable de l’hPSC fournit un moyen pour une grande variété d’applications cellulaires, y compris des options thérapeutiques. Par exemple, il existe des troubles impliquant la mort cellulaire et la dégénérescence, où la fonctionnalité normale des cellules dans le corps humain est compromise, comme dans l’insuffisance cardiaque, les blessures à la colonne vertébrale, le diabète, la maladie de Parkinson, certains cancers et d’autres pathologies cliniques. Les patients souffrant de ces conditions pourraient potentiellement être traités en transplantant des cellules somatiques saines et fonctionnelles qui ont été dérivées de l’hPSC en laboratoire. Cependant, les protocoles actuels de différenciation hPSC ne sont pas efficaces à 100% et donnent un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés, ainsi que de hPSCs résiduels qui n’ont pas subi de différenciation, continuant plutôt à s’auto-renouveler1-3. La présence même d’un petit nombre de hPSC dans un échantillon de cellules somatiques hPSC-dérivées destinées à la transplantation dans les patients constitue un risque clinique sérieux car ces cellules par leur nature inhérente pour former des tissus des trois couches germinales embryonnaires, pourraient potentiellement former in vivo un type de tumeur connu sous le nom de teratoma. Par conséquent, seules les populations de cellules cibles jugées exemptes de cellules souches pluripotentes peuvent être considérées comme sûres pour la transplantation chez les patients. Plusieurs approches ont été signalées pour réaliser potentiellement la purge des CSHS résiduelles après la différenciation (pour un examen, voir Polanco et Laslett4). Nous avons précédemment rapporté l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 couplés au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour identifier les cellules souches pluripotentes et les distinguer des cellules subissant un stade précoce de différenciation dans les cultures de lignéeshESC 5-7.
L’un des avantages de l’utilisation d’anticorps pour détecter les antigènes de surface cellulaire est que les cellules cibles sont généralement viables après la liaison et/ou le marquage des anticorps. Par conséquent, les cellules cibles peuvent être collectées après le marquage des anticorps et reculture pour l’expansion et d’autres applications avant la transplantation. Une mise en garde pour les antigènes de surface cellulaire exprimés sur hPSC est qu’ils ne sont pas exclusifs au stade pluripotent et sont dans de nombreux cas ré-exprimés temporellement pendant le développement et seront donc détectés dans certains types de cellules différenciées. Par conséquent, si l’objectif est d’utiliser des anticorps pour détecter des cellules pluripotentes humaines et les purger d’un échantillon de cellules dérivées de l’hPSC, les anticorps sélectionnés ne devraient pas également réagir avec des antigènes sur les types de cellules différenciés spécifiques destinés à la transplantation. Malheureusement, il existe un nombre limité d’anticorps qui détectent les marqueurs de surface cellulaire sur les hPSCs vivants 4, ce qui limite les options de sélection. En outre, quelques études ont souligné que la détection d’un seul marqueur de surface cellulaire n’est pas suffisante pour éliminer toutes les HPSC, suggérant que toute tentative d’éliminer toutes les sous-populations pluripotentes hPSC devrait s’appuyer sur des méthodes qui utilisent deux anticorps ou plus détectant différents épitopes exprimés par hPSCs 9-10. Comme mentionné ci-dessus, seules les cellules dérivées du CHSP qui pourraient être déterminées comme des populations de cellules souches pluripotentes exemptes de cellules sont appropriées pour la transplantation humaine. Atteindre ce niveau de rigueur peut ne pas être atteint avec un seul passage à travers une technologie de tri cellulaire à médiation anticorps. La reculture de la population enrichie de cellules cibles différenciées et les cycles ultérieurs de tri cellulaire peuvent être nécessaires pour obtenir définitivement des échantillons pluripotents sans cellules souches.
Dans notre laboratoire, nous avons largement caractérisé deux anticorps hES de surface cellulaire, TG30 (CD9) et GCTM-2, pour la détection de cellules pluripotentes vivantes. Nos études ont montré que la détection combinée de TG30 et GCTM-2 est fortement corrélée avec l’expression de gènes associés à la pluripotence canonique dans les lignées hESC 5-7. L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS a constamment montré que les cultures hESC constituent un gradient continu quantitatif de l’expression TG30/GCTM-2 5-7. Nous avons arbitrairement établi quatre populations (P) de cellules dans ce gradient TG30/GCTM-2 : P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Notre caractérisation de ces populations de cellules P4, P5, P6 et P7 a montré que les sous-fractions P6 et P7 expriment un grand nombre de gènes associés à la pluripotence et forment efficacement des colonies en forme de tige lorsqu’elles sont recultured post-FACS 2-3. D’autre part, les cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)expriment un grand nombre de marqueurs de différenciation et constituent les types de cellules spontanément différenciés qui se produisent généralement dans les cultures en expansion des lignées hESC 5-6. Nous avons décidé de tester la potentialité de notre FACS TG30/GCTM-2 pour l’élimination sélective des hPSCs résiduels suite à une différenciation précoce, et aussi pour l’enrichissement des populations de cellules souches pluripotentes. Le protocole décrit ci-dessous montre comment collecter et reculturer des cellules P4 différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)post-FACS pour accomplir la purge de P7 pluripotent (TG30Hi-GCTM-2Hi). En outre, nous expliquons également la collecte et la reculture de cellules pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)pour obtenir une culture enrichie de cellules pluripotentes, qui pourraient ensuite être utilisées comme population d’entrée définie pour augmenter potentiellement l’efficacité et la cohérence des tests de différenciation.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Short Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Long Name </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320082</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Long Name: Knockout Serum Replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Long Name: GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Long Name: 2-Mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21131</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-647</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21238</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-anti IgG2a</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P21139</td>
			<td>Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (&#947;2a) Conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15230-089.</td>
			<td>Long Name: Sterile Distilled Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4864</td>
			<td>Long Name: Propidium iodide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12203C</td>
			<td>Long Name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-1890</td>
			<td>Long Name: Gelatin from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003AF-100UG</td>
			<td>Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>Long Name: Stericup-GP, 0.22 &#956;m, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td>Long Name: Cell strainer with 70 &#956;m Nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#956;m Lid cell strainer, 5 ml tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352054</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG2a Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554126</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553472</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgM, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD90.2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553014</td>
			<td>Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-peaks calibration</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>559123</td>
			<td>Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG30</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4427</td>
			<td>Long Name: TG30 Antibody, clone TG30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4346</td>
			<td>Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. List of materials and reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACSVantage SE with FACSDiva option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. List of equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and purging of human embryonic stem cells by detection of cell surface antigens using the monoclonal antibodies tg30 and gctm-2

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent s’auto-renouveler indéfiniment in vitroet, avec les indices appropriés, peuvent être induites pour se différencier en potentiellement toutes les lignées cellulaires somatiques. Les dérivés différenciés de hESC peuvent potentiellement être utilisés dans les thérapies de transplantation pour traiter une variété de maladies cellulaires dégénératives. Cependant, les protocoles de différenciation hESC produisent généralement un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés ainsi que de cellules indifférenciées résiduelles. Pour la traduction des dérivés hESC différenciés du laboratoire à la clinique, il est important de pouvoir distinguer les cellules indifférenciées (pluripotentes) et différenciées, et de générer des méthodes pour séparer ces populations. L’application sûre des types hESC-dérivés de cellules somatiques peut seulement être accomplie avec les populations cellules-libres de tige pluripotentes, car les hESCs résiduels pourraient induire des tumeurs connues sous le nom de teratomas après la transplantation. Vers cette fin, nous décrivons ici une méthodologie pour détecter la pluripotence associée aux antigènes de surface cellulaire avec les anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification des CSEh TG30 pluripotentsHi-GCTM-2Hi en utilisant la sélection positive. En utilisant la sélection négative avec notre méthodologie TG30/GCTM-2 FACS, nous avons pu détecter et purger les CSEh indifférenciés dans les populations subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30Neg-GCTM-2Neg). Dans une autre étude, des échantillons pluripotents sans cellules souches de cellules TG30Neg-GCTM-2Neg différenciées sélectionnées à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 n’ont pas formé de teratomes une fois transplantés chez des souris immunodéprimées, ce qui a soutenu la robustesse de notre protocole. D’autre part, le passaging consécutif médié par le TG30/GCTM-2 FACS du TG30Hipluripotent enrichi -GCTM-2Hi hESCs n’a pas affecté leur capacité à s’auto-renouveler in vitro ou leur pluripotence intrinsèque. Par conséquent, les caractéristiques de notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2 fournissent un test sensible pour obtenir des populations hautement enrichies de hPSC comme intrants pour les tests de différenciation et pour débarrasser les hESC potentiellement tumorigènes (ou résiduels) des populations de cellules dérivées.

Les dérivés hESC qui sont exempts de cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus par passaging consécutif de cellules de la sous-fraction P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg).
Des rapports précédents ont établi que dans les cultures standard hESC coexistent un mélange de sous-populations présentant un gradient d’expression de gènes associés à la pluripotence5,6,13. La détection combinée d’antigènes de surface cellulaire comme TG30 (CD9) et GCTM-2 permet la discrimination d’un certain nombre de sous-ensembles de cellules au stade pluripotent et à divers stades de différenciation précoce, comme l’indique leur expression de marqueurs de cellules souches et de facteurs de transcription spécifiques à la lignée5,6,13. En accord avec les rapports précédents, nous avons pu distinguer les cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)dans la ligne hESC-MEL1 utilisée pour cette étude(figure 1). Avec ce résultat, nous avons procédé à la collecte différenciée P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)cellules et pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)cellules pour la culture ultérieure dans les études décrites ci-dessous.
Nous avons étudié si, en utilisant une approche de sélection négative, nous pouvions purger les CSEh indifférenciés des populations cellulaires subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30Neg-GCTM-2Neg). Nous avons utilisé un nombre défini de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)qui ont été successivement cultivées post-FACS(figure 2A)pendant environ deux semaines, et réanalysées à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS avant de replater à chaque passage. Les résultats ont montré que la P4-subfraction enrichie pour TG30Neg-GCTM-2Neg différenciait les types de cellules après passaging consécutif, et une présence mineure de cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)au passage initial(Figure 2A,Passage 1) a finalement disparu après un nouveau passaging, devenant des échantillons pluripotents sans cellules souches(Figure 2A,Passage 3).
L’enrichissement des cellules hESC pluripotentes peut être réalisé par la collecte des cellules TG30Hi-GCTM-2Cellules Hi.
Sur la base d’observations antérieures utilisant ce test, nous nous attendrions à un enrichissement des CSEh pluripotents en collectant des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)qui devraient former des colonies de CSEh. Par conséquent, nous avons également étudié le passaging consécutif facs-négocié par TG30/GCTM-2 des cellules pluripotentes P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Dans ces cultures P7, TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling a été exécuté avant de replating des cellules à chaque passage et seulement des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)ont été recultured. De cette façon, nous avons observé que la majorité des cellules étaient situées dans les sous-fractions associées à la pluripotence (P6 et P7), indiquant un enrichissement des cellules pluripotentes qui maintenaient également une capacité à différencier et à générer un petit pourcentage de cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)(Figure 3A). En outre, les cultures de cellules P7 ont montré un grand nombre de colonies de type hESC pendant le passaging(figure 3B),indiquant également le maintien de l’état de pluripotence.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> Figure 1. Stratégie de tri représentative pour obtenir des sous-fractions FACS TG30/GCTM-2. (A): Les suspensions de cellules hES dissociées sont triées comme des cellules simples et les touffes ou doublets potentiels sont fermées avec la dispersion vers l’avant pour la hauteur et la surface (FSC-H et FSC-A). (B) : Les débris potentiels sont éliminés avec FSC-A et SSC-A, et seules les cellules intactes sont triées. C) : Les cellules non viables sont exclues en fonction de la fluorescence de l’iodure de propidium (PI) (FSC-A et FL3-A). (D) : Des cellules d’alimentation de MEF ont été fermées par sélection négative basée sur l’expression de cd90.2-PE de souris (FL2-A et SSC-A). (E) : La fraction hESC viable isolée, exempte de mangeoires MEF, est finalement fractionnée en sous-populations P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30Low-GCTM-2Low),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)et P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). La porte négative (TG30Neg-GCTM-2Neg,nommée P4) a été réglée en fonction de l’autofluorescence de fond pour les cellules non souillées et également des contrôles d’isotype. (F) : Pourcentages des différentes sous-populations fermées typiques d’une analyse cytométrique en flux TG30/GCTM-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> Figure 2. Cultures consécutives représentatives de cellules P4 spontanément différenciées (TG30Neg-GCTM-2Neg)de la ligne hESC-MEL1. (A) : Graphiques facs représentatifs TG30/GCTM-2 montrant des sous-ensembles de cellules fermées (P4, P5, P6 et P7) discriminés par le niveau d’expression détecté des marqueurs de surface cellulaire TG30 et GCTM-2. Une population initiale de 400 000 dérivés hESC présentant une immunoprofilage P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)est recueillie à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Ces cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)sont successivement passageées post-FACS dans des conditions favorables au renouvellement du cseh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre la confluence (11-13 jours). Avant chaque passage, le FACS TG30/GCTM-2 est effectué pour collecter et reculturer uniquement les types de cellules différenciés P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg). (B) : Morphologie typique de la pelouse des cellules différenciées P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)après 14 jours. C) : Des colonies sporadiques de type hESC vues après 14 jours mélangées à la pelouse des cellules P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)au passage 1 seulement, sont très probablement générées par la contamination des cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi). Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> Figure 3. Les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)dérivées de raies hESC peuvent être successivement passées post-FACS sans perdre leurs propriétés pluripotentes intrinsèques. Immunoprofilage représentatif TG30/GCTM-2 FACS des différents passages consécutifs, montrant les sous-ensembles discriminés de cellules (P4, P5, P6 et P7) selon le niveau d’expression de TG30 et GCTM-2. (A) : Une population de départ de 400 000 cellules montrant des caractéristiques P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)est récupérée à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Les cellules P7 pluripotentes (TG30Hi-GCTM-2Hi)sont successivement croisées après facs dans des conditions favorables au renouvellement de la CSEh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre une confluence d’environ 80 % (9 à 11 jours). L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS est effectué avant de replater les cellules à chaque passage et seules les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)sont recultures. Les résultats montrent que les cellules P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)conservent leurs caractéristiques pluripotentes avec un passaging ultérieur, y compris la conservation de l’expression (TG30Hi-GCTM-2Hi),formant des colonies de type hESC (montrées en B)et maintenant la capacité de différencier comme on peut le déduire de la récapitulation d’une petite fraction de P4 différencié (TG30Neg-GCTM-2Neg)dans chacun des gradients FACS. Barre d’échelle = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la silhouette.</a>
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Échantillon (volumes de réaction)</td>
			<td>Anticorps primaires</td>
			<td>Anticorps secondaire</td>
			<td>PE Rat Anti-Souris CD90.2 b</td>
			<td>Iodure de propidium c</td>
		</tr>
<tr>
<td>Échantillon de tri (~ 9 ml pour les ABs primaires, 2,5 ml pour les ABs secondaires)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) a
</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 1 : TG30 (200 μl)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 2 : GCTM-2 (200 μl)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Contrôle-3 : CD90.2 anti-souris (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 4 : Phycoérythrine (EP) (200 μl)</td>
			<td>Isotype IgG2a de souris</td>
			<td>R-phycoérythrine chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Contrôle 5 : Isotype de l’immunoglobuline de souris (200 μl)</td>
			<td>Isotype IgG2a de souris + isotype IgM</td>
			<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Témoin 6 : Cellules non colorées (200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1. Exemple de tri et contrôles pour le tri FACS. a L’échantillon de tri est immunostained simultanément avec des anticorps TG30 et GCTM-2. b PE-anti-souris CD90.2 est utilisé pour reconnaître les cellules de souris et supprimer les MEF des hESCs au cours de FACS14. c Les cellules non viables sont exclues à l’aide d’iodure de propidium à une concentration finale de 0,3 μg/ml. Réactif ajouté (+), non ajouté (-) au tube de réaction.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>anticorps </td>
			<td>hôte</td>
			<td>Isotype</td>
			<td>Dilution de travail</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1,4 mg/ml)</td>
			<td>souris</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (hybridome surnageant)</td>
			<td>souris</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:5 ~ 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488 chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 chèvre anti-souris IgM</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-phycoérythrine (PE) chèvre anti-souris IgG2a</td>
			<td>chèvre</td>
			<td>Polyclonale</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD90.2 anti-souris</td>
			<td>rat</td>
			<td>IgG2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Souris purifiée IgG2a, κ Contrôle d’isotype</td>
			<td>souris</td>
			<td>IgG2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgM de souris purifiée, κ Contrôle d’isotype</td>
			<td>souris</td>
			<td>Igm</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Détails et dilutions d’anticorps pour le tri FACS. a En raison de l’expression extrêmement très élevée de GCTM-2 sur la surface cellulaire des CSEh, il n’est pas possible d’atteindre la saturation avec cet anticorps. Chaque lot de surnageant d’hybridome GCTM-2 doit être titré par rapport à un témoin standard ou à un lot précédent afin d’obtenir des résultats similaires avec des CSEh à l’échelle et d’éviter les taches excessives.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Nom du support</td>
			<td>composition</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR moyen</td>
			<td>Milieu Eagle modifié de Dulbecco: Mélange de nutriments F-12 (DMEM / F-12) complété par 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Acides aminés non essentiels, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ ml facteur de croissance des fibroblastes humains 2 (FGF-2) et Pen / Strep à 1x.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milieu MEF</td>
			<td>Le produit Modified Eagle Medium, high glucose (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de GlutaMAX et Pen /Strep à 1x.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3. Composition des milieux de culture.

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Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Nous décrivons l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 pour la détection combinée des antigènes de surface cellulaire par l’intermédiaire du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification et l’enrichissement des cellules souches embryonnaires humaines vivantes (hESC) utilisant la sélection positive et également l’utilisation de la sélection négative pour purger hESCs d’une population mélangée de cellules.

Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

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7.7K vues.  CSIRO. Nous décrivons l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 pour la détection combinée des antigènes de surface cellulaire par l’intermédiaire du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification et l’enrichissement des cellules souches embryonnaires humaines vivantes (hESC) utilisant la sélection positive et également l’utilisation de la sélection négative pour purger hESCs d’une population mélangée de cellules.

Vidéo: Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.