私たちは、FACSサービスのためのモナッシュ大学のhESCラインとフローコア施設の提供のためのモナッシュ大学のステムコア施設に感謝します. この研究は、オーストラリア幹細胞センター、ニューサウスウェールズ州、ビクトリア州政府幹細胞研究助成プログラムの研究助成金によって支援されました。ALLは、オーストラリア幹細胞科学に関するオーストラリア研究評議会(ARC)特別研究イニシアチブのパートナー研究者です。

以下のプロトコルは、モナッシュ大学(メルボルン)のStemCore施設が提供するhESC-MEL111標準バルク培養を使用して実行されました。この細胞株は、bFGF補充hESC/KOSR培地7における有数体不活性化マウス胚性線維芽細胞(MEF)の層上で日常的に培養され、それぞれ5〜7日の酵素解離(コラゲナーゼ)を有する。75cm2(T75)フラスコで約80%の合流性に成長したhESC培養物は、このプロトコルの入力集団として使用される。以下に説明するすべての細胞操作手順は、HEPA濾過クラスIIバイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行う必要があります。
TG30/GCTM-2 FACSアッセイを行う2日前に、FACS後に回収された細胞の再培養に使用されるT75培養プレート(セクション1に記載)を準備する(セクション4に記載)。
1. MEFの播種とMEF条件培地の調製
1.1 DAY -2: T75フラスコへのMEFのめっき
<ol><li>ピペット10 mlの0.1%w/vゼラチンを各T75フラスコに入れ、表面を均等にコーティングするために傾ける。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネットで室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>吸引ゼラチン溶液。</li>
	<li>フラスコに20mlのMEF培地を加え、細胞培養インキュベーターで30分間37°C/5%CO2に事前平衡化する。 </li>
	<li>次の密度で調製フラスコにマイトチーム不活性化MEFをプレートします。1/3 MEF密度シード1.4 x 104セル/cm 2(T75= 1 x 106 MEF)の場合。フル密度 MEF シード 5.3 x 104セル/cm2 (T75 = 4 x 106 MEF) の場合。</li>
</ol>注:γ照射によってマイト的に不活性化されたMEFを日常的に使用しています。γ照射されたMEFの準備のためのプロトコルは、ミハルスカ12で見つけることができます。
<ol start="6"><li>インキュベートは、一晩で37°C/5%CO2でMEF培養物を照射した。1/3フラスコは、MEF培地交換なしで1〜4日間インキュベートすることができます。これらのフラスコは、FACS後細胞の再めっきに使用されます(プロトコル4のように)。フルMEFフラスコは、ステップ1.2の下記のようにCMを生成するために一晩インキュベートされる。</li>
</ol>1.2 日 -1: MEF コンディショム付き培地 (CM) の調製
<ol><li>フルMEF T75フラスコからMEF培地を吸引する。</li>
	<li>T75フラスコあたり5 ng / mlヒトFGF-2を添加した事前平衡化された25 ml hESC/KOSR培地を加えます。37 °C/5%CO2 で 24 時間インキュベートします。</li>
	<li>MEFコンディションの培地(CM)を無菌組織培養チューブに集め、10 ng / mlのヒトFGF-2でCMを補充し、0.22 μmのポリエーテルサルホンフィルターを使用してフィルターを行います。</li>
	<li>CM を追加するには、同じ MEF カルチャで 1 週間ステップ 1.2.2 と 1.2.3 を繰り返します。</li>
</ol>TG30/GCTM-2アッセイを行う日に、1/3 MEF T75フラスコのMEF培地をCMに交換し、以下に説明するように手順から回収したhESCまたはhESC誘導細胞を播種する前に少なくとも30分間平衡化します。CMは、新鮮な使用されるか、または最大2週間4°Cで保存されます。CMは、我々の手の中で、非条件のメディアと比較してFACS後の細胞の生存率を増加させるように、このプロトコルで使用されます(結果は示されていません)。
2. TG30/GCTM-2 FACSアッセイの実行:単一細胞へのhESCバルク培養の解離
注:プレチル20%FBS/DMEM-F12培地4°Cで。
<ol><li>培養したhESCラインを持つ2つのT75フラスコからhESC/KOSRメディアを吸引する。</li>
	<li>各T75の細胞を10mlDPBSでリンスし、吸引して除去する。</li>
	<li>T75フラスコに3mlのトリプルエクスプレス解離液を加えます。37 °C/5%CO2 で5分間インキュベートします。</li>
	<li>フラスコの側面をバンプして、細胞の完全な剥離を得る。顕微鏡で確認してください。細胞が容易に外れてしまう場合は、さらに2〜3分間、37°C/5%CO2でインキュベートする。</li>
	<li>各T75フラスコに10ml20%FBS/DMEM-F12(4°Cに保つ)を加えます。滅菌10mlピペットを用いて、フラスコ壁に対して解体細胞を数回穏やかに三分し、主に単一細胞懸濁液を達成する。</li>
	<li>70 μmのセルストレーナーを50mlの滅菌ポリプロピレンチューブに置きます。滅菌10mlピペットを使用して、2つのT75フラスコからストレーナーを介してプールされたhESC単細胞懸濁液を強制します。</li>
	<li>細胞ストレーナーを廃棄し、チューブ蓋を交換し、2分間1,000 x gでプールしたhESC懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットを10ml20%FBS/DMEM-F12(4°Cでプレチル)に緩やかに再懸濁して細胞を洗います。</li>
	<li>2分間1,000xgで2回目の遠心を行います。</li>
	<li>上清を捨て、10ml 20%FBS/DMEM-F12(4°Cでプレチル)を加え、穏やかに三分を加え、細胞を再懸濁させます。50mlのチューブを氷の上に置きます。このチューブは、下記の 並べ替え サンプル 免疫染色手順に使用されます。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを用いた細胞数カウント用にhESC単細胞懸濁液(ステップ2.10)を20μlとします。T75フラスコ当たり1000万~1500万個の細胞の収量を期待する必要があります。</li>
</ol>注: FBS は、FACS 後のセルの生存率を高めるために、プロトコルのこの部分で使用されます。
3. 細胞表面抗原TG30およびGCTM-2の免疫蛍光染色
<ol><li>アリコート150μl(約100,000細胞)のhESC単細胞懸濁液(ステップ2.11から)の6つのマイクロ遠心分離管のそれぞれ1.5ml。これらの6つのアリコートは、FACSマシン上のアッセイを校正するために必要な染色制御に使用されます。残りの〜9ml細胞懸濁液は、表1および2に従って、解約培養物がTG30およびGCTM-2の検出のためにコスタインされるあなたのソートサンプルである。</li>
	<li>20%FBS/DMEM-F12で 一次抗体 の結合反応を行う。最終的な反応量は、ソートサンプルでは〜9 ml、コントロールでは200 μlである必要があります。アイソタイプコントロールを一次抗体として含める。氷の上に水平にチューブを置き、揺れるプラットフォーム上で30分間穏やかに混ぜます。</li>
	<li>遠心分離機一次抗体反応は1,000xgで2分間行う。</li>
	<li>上清を捨て、ペレットを20ml 20%FBS/DMEM-F12(4°Cでプレチル)で再懸濁して細胞を洗浄し、並べ替えサンプル用に200 μlを使用します。</li>
	<li>2分間、1,000 x g で 2 回目のスピンを行います。</li>
	<li>20%FBS/DMEM-F12で 二次抗体 の結合反応を行う。最終的な反応量は、ソートサンプルでは2.5ml、コントロールでは200 μlである必要があります。この段階でPE抗マウスCD90.2反応管を準備します。氷の上に水平にチューブを置き、揺れるプラットフォーム上で30分間穏やかに混ぜます。</li>
</ol>注: このインキュベーション時間中に CM を収集し、セクション 1.2 のように CM で 1/3 MEF T75 フラスコを準備すると便利です。
<ol start="7"><li>遠心分離機二次抗体反応は1,000xgで2分間行う。</li>
	<li>上清を捨て、20ml 20%FBS/DMEM-F12(4°Cでプレチル)でペレットを再懸濁して細胞を2回洗浄し、コントロール用に200μlを選別します。</li>
	<li>1,000 x g で 1,000 x g の各洗浄に続いて 2 分間スピンを行い、チューブを氷の上に置きます。</li>
	<li>上清を捨て、20%FBS/DMEM-F12で細胞ペレットを廃棄し、プロピジウムヨウ化素(PI)を0.3 μg/mlで補充します。ソートサンプルには2~3 ml、コントロールには300 μlを使用します。</li>
</ol>注: 未染色セルを持つコントロールチューブに PI を追加しないでください。
<ol start="11"><li>P1000マイクロピペットを使用して、個々のセルサスペンションを35μmの蓋セルストレーナーを通して、5mlチューブポリスチレンラウンドボトム試験管に結合します。</li>
	<li>50 g/min で遠心分離機をストレーナーのふたの残余細胞懸濁液を通して強制する。</li>
	<li>各単一セルの懸濁液をチューブの側面をタップして再中断し、氷の上に置きます。これで、セルは FACS の準備が整いました。すぐに進んでください。</li>
</ol>4. 75 cm2 (T75) フラスコにおける TG30/GCTM-2 亜折細胞のポスト FACS 培養
<ol><li>我々は以前にTG30/GCTM-2免疫プロファイリング7のためのFACSマシンを設定する方法を報告しました。この手順により、MEFを含まない実行可能な単一のhESCを回復し、P4(TG30ネグ-GCTM-2ネグ)、P5(TG30低-GCTM-2低)、P6(TG30Mid-GCTM-2Mid)およびP7(TG30Hi-GCTM-2Hi)のゲート内で回復 することができます。前回のレポートと同様に、TG30/GCTM-2 FACS 用の FACS マシンをセットアップして、次に使用するセルの亜折を回復します。</li>
	<li>ステップ1.2のように調製した1ml CMを、FACSマシンから細胞を収集する前に2つの5mlポリスチレンラウンドボトム試験管のそれぞれに加えます。氷の上に置きます。</li>
	<li>TG30/GCTM-2 FACSを用いて、分化P4(TG30陰-GCTM-2陰)および多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)からそれぞれ400,000個の細胞を回収する。</li>
	<li>1,000 x gで5分間のコレクションチューブを遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引する。P1000マイクロピペットを使用して各細胞ペレットを再懸濁するために、1 mlの予入37°C/5%CO2 CMを加えます。CMで事前に平衡化された1/3 MEF T75フラスコに各分数の細胞を播種する(ステップ1.2に従って準備する)</li>
	<li>細胞培養インキュベーターで37°C/5%CO2で24時間培養する。 </li>
	<li>毎日CMを吸引し、約2週間、(ステップ1.2のように)作りたてのCMに交換してください。多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞の培養は、1週間後にヒトの幹様コロニーを示し、9-11日で約80%の合流に達する。P4(TG30陰-GCTM-2陰)細胞の培養は、主に11-13日で合流に達する線維芽細胞様細胞の芝生として増殖する。この段階では、必要に応じて、P4およびP7細胞培養をTG30/GCTM-2 FACS媒介したP4またはP7亜分数の連続的な再培養に使用することができる(図2および3を参照)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pera, M. F., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+regulation+of+pluripotent+stem+cells.">Extrinsic regulation of pluripotent stem cells.</a> Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines.">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li><li>Polanco, J. C., Laslett, A. L., Lenka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+Assessment+of+Reprogrammed+Cells+Prior+to+Clinical+Applications:+Potential+Approaches+to+Eliminate+Teratoma+Formation.">Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation.</a> Pluripotent Stem Cells. , (2013).</li><li>Laslett, A. 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開示するものは何もありません。

臨床文脈では、分化された体細胞タイプは移植および治療用途のための最終的な望ましい産物であり、hPSCは、実験室でそれらの体細胞またはそれらの前駆細胞を生成する自己更新およびスケーラブルなソースである。奇形腫形成の可能性を有する残存未分化のhESCの存在は、患者への移植のためのhESC由来の体細胞を考慮する際の安全上のリスクである。これおよび細胞療法に関連する他のリスクのレビューについては、Sharpeらをご覧ください。16したがって、このような応用を実現するためには、研究者が多能性幹細胞を含まない標的細胞集団を生成することを目指することが不可欠である。この目的に向けて、TG30/GCTM-2 FACSの方法論を用いて、細胞集団を区別する多能性細胞(TG30 Hi-GCTM-2Hi)の存在を監視し、FACS後に濃縮および再培養できる生存可能なhESC分化誘導体を得ることができることを示す。プロトコルの単一パスで100%多能性幹細胞を得ることができないが、濃縮されたhESC誘導体を再培養し、連続通過後100%体細胞純度を達成することができる。FACS後の拡張のための体細胞の実証された生存率はまた潜在的な移植療法に適した細胞の十分な数の生産を可能にする。
この試験研究の励ましの結果は、いくつかのヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)行15との比較研究において、TG30/GCTM-2プロトコルを用いてより包括的な調査を行うよう促した。その研究では、TG30/GCTM-2 FACSプロトコルを用いて得られた多能性幹細胞フリーサンプルは、免疫奪われたマウスに移植しても奇形腫を生成しないことがわかった。したがって、このin vitroプロトコルを使用することで、多能性TG30 Hi-GCTM-2Hi細胞が生体内で奇形腫を発症しないと判断した初期段階の分化細胞培養を自信を持って述べることができる。これは、臨床応用におけるhPSC由来細胞の使用前に奇形腫形成のリスクを排除する潜在的なアプローチを提供し、我々のアッセイの堅牢性を強く支持する。
逆に、TG30/GCTM-2 FACSアッセイは、これら2つの表面抗原の発現レベルの高い多能性細胞集団を取り出すために使用できることを示している(TG30 Hi-GCTM-2Hi)。これまでの研究では、TG30Hi-GCTM-2Hi細胞が OCT4hi発現と最も高い相関を示し、hESC様コロニーの数が5,6,13,15の最も多い。そこで、多能性ネットワークがTG30 Hi-GCTM-2Hi発現細胞の最大レベルで活性化される理由です。TG30/GCTM-2 FACSプロトコルを用いて、P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞を取得することで、分化アッセイへの入力として、濃縮された生きたhESC培養物の大規模な精製が可能になる可能性があると考えています。
結論として、我々は、表面抗原TG30とGCTM-2の両方のhESCのパージと濃縮の組み合わせに基づくFACSアッセイの可能性をここで示す。hPSCの指向分化のためのプロトコルを用いた今後の研究も、この可能性に関する有益なものである可能性が高い。我々は、分化hESC誘導体がTG30(CD9)またはGCTM-2を一時的に発現するアッセイでは、アッセイ6の特定の時点で多能性細胞を分化した集団から多能性細胞をパージするのに適切ではないか、または十分でない可能性があることを認識している。したがって、いくつかの分化された細胞タイプとの交差反応の可能性のある限界を克服するために、生きたhESCを特異的に認識する新規抗体を見つける必要が続いています。

HPSC(hPSC)は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)を含む。HPSCは、適切な培養条件で「多能性」と呼ばれる能力を失うことなく、無期限に自己更新することができます。多能性は、細胞が本質的に3つの胚性生殖細胞層のそれぞれを代表する細胞を含む任意の体細胞系統に分化する可能性と定義される。hPSCの顕著な可能性は、治療オプションを含む細胞ベースの多種多様なアプリケーションのための手段を提供する。例えば、心不全、脊髄損傷、糖尿病、パーキンソン病、いくつかの癌、および他の臨床病理のように、人体の細胞の正常な機能が損なわれる細胞死および変性を伴う障害がある。これらの状態に苦しむ患者は、実験室でhPSCに由来した健康で機能的な体細胞を移植することによって治療される可能性がある。しかし、現在のhPSC分化プロトコルは、100%効率的ではなく、分化された標的とオフターゲットの細胞タイプの混合物を得るだけでなく、分化を受けていない残留hPSCを、代わりに自己更新1-3に続ける。患者への移植を目的としたhPSC由来の体細胞のサンプル中に少数のhPSCが存在することは、これらの細胞が固有の性質によって3つの胚性胚層の組織を形成することによって、奇形腫として知られている腫瘍の一種を 生体内に 形成する可能性があるため、深刻な臨床リスクを構成する可能性がある。したがって、多能性幹細胞を含まないと判断された標的細胞集団のみが、患者への移植に対して安全であると考えることができる。分化後の残留hPSCのパージを達成する可能性があると報告されているいくつかのアプローチがあります(レビューについては、ポランコとラスレット4を参照してください)。我々は、多能性幹細胞を同定し、hESCライン5-7の培養において早期分化を受けている細胞からそれらを区別するために蛍光活性化細胞選別(FACS)に結合したモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用を以前に報告した。
抗体を使用して細胞表面抗原を検出する利点の1つは、標的細胞が通常、抗体結合および/または標識後に生存可能である点である。したがって、抗体標識後に標的細胞を回収し、移植前に拡大およびさらなる適用のために再培養することができる。hPSC上で発現される細胞表面抗原の注意点の1つは、多能性の段階に排他的ではなく、多くの場合、開発中に一時的に再発現され、したがっていくつかの分化された細胞タイプで検出されることである。したがって、ヒト多能性細胞を検出し、それらをhPSC由来細胞のサンプルからパージするために抗体を使用することを目的とする場合、選択された抗体は、移植を目的とした特異的分化細胞タイプ上の抗原とも反応してはならない。残念ながら、生きたhPSC 4上の細胞表面マーカーを検出する抗体の数は限られており、選択の選択肢は限られています。さらに、いくつかの研究は、1つの単一の細胞表面マーカーの検出がすべてのhPSCを排除するのに十分ではないことを指摘しており、hPSC 9-10で発現する異なるエピトープを検出する2つ以上の抗体を使用する方法に依存すべきであることを示唆している。前述のように、多能性幹細胞集団として決定できるhPSC由来細胞のみがヒト移植に適している。このレベルのストリンジェンシーに到達することは、抗体媒介細胞選別技術を介した単一の通過では達成できない可能性がある。分化された標的細胞の富化集団の再培養および細胞選別のその後のラウンドは、多能性幹細胞フリーサンプルを確実に得るために必要とされ得る。
当研究室では、生きた多能性細胞の検出のために、2つのhES細胞表面抗体TG30(CD9)とGCTM-2を広範囲に特徴づけている。我々の研究は、TG30とGCTM-2の両方を組み合わせた検出が、hESC行5-7における正規多能性関連遺伝子の発現と強く相関することを示している。TG30/GCTM-2 FACS免疫プロファイリングは、hESC培養がTG30/GCTM-2発現5-7の定量的連続勾配を構成することを一貫して示している。このTG30/GCTM-2勾配内の細胞の4つの集団(P)を任意に確立しました: P4 (TG30ネグ-GCTM-2ネグ), P5 (TG30低-GCTM-2低), P6 (TG30ミッド-GCTM-2ミッド) およびP7 (TG30Hi-GCM-2 Hi-Hi-Hi- Hi-2Hi-7)これらのP4、P5、P6およびP7細胞集団の特徴は、P6およびP7亜分数が多数の多能性関連遺伝子を発現し、FACS後2-3を再培養したときにステム様コロニーを効率的に形成することを示している。一方、P4(TG30陰-GCTM-2Neg)細胞は、多数の分化マーカーを発現し、hESC行5~6行の培養物の拡大に典型的に生じる自発的分化細胞型を構成する。初期段階の分化後の残留hPSCの選択的排除、および多能性幹細胞集団の濃縮に関するTG30/GCTM-2 FACSの可能性を試験することにしました。以下に説明するプロトコルは、多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)のパージを達成するために、FACS後の分化P4(TG30Neg-GCTM-2陰性)細胞を収集および再培養する方法を示す。また、多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞の回収・再培養を説明し、多能性細胞の培養物を豊富に得るとともに、その後、定義された入力集団として使用して分化アッセイの効率と一貫性を高める可能性を説明します。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Short Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Long Name </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320082</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOSR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Long Name: Knockout Serum Replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Long Name: GlutaMAX supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td>Long Name: 2-Mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604039</td>
			<td>Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-488</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21131</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF-647</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21238</td>
			<td>Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-anti IgG2a</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P21139</td>
			<td>Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (&#947;2a) Conjugate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Long Name: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15230-089.</td>
			<td>Long Name: Sterile Distilled Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P4864</td>
			<td>Long Name: Propidium iodide solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>12203C</td>
			<td>Long Name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G-1890</td>
			<td>Long Name: Gelatin from porcine skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003AF-100UG</td>
			<td>Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>Long Name: Stericup-GP, 0.22 &#956;m, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td>Long Name: Cell strainer with 70 &#956;m Nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 &#956;m Lid cell strainer, 5 ml tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352235</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 &#956;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene round bottom test tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352054</td>
			<td>Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG2a Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554126</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM Isotype Control</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553472</td>
			<td>Long Name: Purified Mouse IgM, &#954; Isotype Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD90.2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>553014</td>
			<td>Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-peaks calibration</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>559123</td>
			<td>Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile Polypropylene tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TG30</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4427</td>
			<td>Long Name: TG30 Antibody, clone TG30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB4346</td>
			<td>Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. List of materials and reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS machine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACSVantage SE with FACSDiva option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. List of equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and purging of human embryonic stem cells by detection of cell surface antigens using the monoclonal antibodies tg30 and gctm-2

ヒト胚性幹細胞(hESC)は、インビトロで無期限に自己更新することができ、適切な手がかりを持つ可能性のあるすべての体細胞系統に分化するように誘導することができる。分化されたhESC誘導体は、移植療法で様々な細胞変性疾患を治療するために使用される可能性がある。しかし、hESC分化プロトコルは通常、異分化された標的細胞とオフターゲット細胞タイプの混合物と、残存未分化細胞を生じる。分化したhESC誘導体を研究室からクリニックに翻訳する場合、未分化(多能性)と分化細胞を区別し、これらの集団を分離する方法を生成できることが重要です。hESC由来の体細胞タイプの安全な適用は、移植後に奇形腫として知られている腫瘍を誘発する可能性があるため、多能性幹細胞フリー集団でのみ達成できる。この目的に向けて、多能性TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCsを同定するための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介してモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2を用いて多能性関連細胞表面抗原を検出する方法論を説明する。TG30/GCTM-2 FACSの手法で負の選択を行い、非常に初期段階の分化を行っている集団の未分化のhESCを検出およびパージすることができました(TG30Neg-GCTM-2Neg)。さらなる研究では、当社のTG30/GCTM-2 FACSプロトコルを使用して選択された分化TG30陰細胞-GCTM-2陰性細胞の多能性幹細胞フリーサンプルは、一度免疫不全マウスに移植されたテラトマを形成せず、当社のプロトコルの堅牢性を支えた。一方、TG30/GCTM-2 FACSは、富化多能性TG30 Hi-GCTM-2HihESCsの連続的な受架は、インビトロで自己更新する能力またはその固有の多能性に影響を与えなかった。したがって、当社のTG30/GCTM-2 FACS方法論の特性は、分化アッセイの入力としてhPSCの高濃縮集団を得て、誘導細胞集団から潜在的に腫瘍性(または残留)hESCを取り除くために、敏感なアッセイを提供します。

多能性幹細胞フリーであるhESC誘導体は、P4(TG30陰性-GCTM-2陰性)亜分光から細胞を連続的に通過させることによって得ることができる。
これまでの報告では、hESC標準培養において、多能性5,6,13に関連する遺伝子の発現勾配を示す亜集団の混合物が共存することが確立されている。TG30(CD9)およびGCTM-2のような細胞表面抗原の組み合わせ検出は、幹細胞マーカーおよび系統特異的転写因子5,6,13の発現によって示されるように、多能性段階および早期分化の様々な段階での細胞の多数のサブセットの識別を可能にする。これまでの報告に同意して、P4(TG30ネグ-GCTM-2ネグ)、P5(TG30低-GCTM-2低)、P6(TG30ミッド-GCTM-2Mid)、およびP7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞を判別することができました(図1)。この結果から、下記の研究で、分化P4(TG30陰-GCTM-2陰)細胞および多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞の採取を進めた。
我々は、陰性選択アプローチを用いて、非常に初期段階の分化を受けている細胞集団から未分化のhESCをパージできるかどうかを調べた(TG30Neg-GCTM-2Neg)。FACS後に連続して培養したP4(TG30陰-GCTM-2陰)細胞の数を約2週間使用し、各通路で再めっきする前にTG30/GCTM-2 FACSを用いて再分析した。結果は、連続通過後のTG30陰性-GCTM-2陰性分化細胞型に対するP4亜画が富化し、最初の通路でのP7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞のマイナーな存在(図2A、パッセージ1)がさらに通過した後に消失し、多能性幹細胞フリーサンプルとなったことを示した(図2A、パッセージ3)。
多能性hESC細胞の濃縮は、TG30 Hi-GCTM-2Hi細胞の細胞の収集によって達成することができる。
このアッセイを用いた以前の観測に基づき、hESCコロニーを形成するはずのP7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞を収集することで、多能性のhESCの充実が期待されます。そこで、TG30/GCTM-2多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞の連続通過をFACS媒介した細胞についても調べた。これらのP7培養において、TG30/GCTM-2 FACS免疫プロファイリングは、各通路で細胞を再めっきする前に行い、P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞のみを再培養した。このように、多能性に関連する亜屈折(P6およびP7)に大部分の細胞が位置し、P4(TG30陰-GCTM-2陰性細胞)を分化して生成する能力も維持している多能性細胞の濃縮を示す(図3A)。さらに、P7細胞の培養物は、通過時に多数のhESC様コロニーを示し(図3B)、多能性状態の維持も示す。
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig1.jpg"> 図 1.TG30/GCTM-2 FACS亜折を得るための代表的な選別戦略。(A):解談されたhES細胞懸濁液は単一細胞としてソートされ、潜在的な塊またはダブレットは高さおよび面積(FSC-HおよびFSC-A)の前方散乱でゲートアウトされる。(B):潜在的な破片はFSC-AおよびSSC-Aで除去され、無傷の細胞だけがさらに分類される。(C):非生存細胞は、ヨウ化プロピジウム(PI)蛍光(FSC-AおよびFL3-A)に基づいて除外される。(D):MEFフィーダー細胞は、マウスCD90.2-PE(FL2-AおよびSSC-A)の発現に基づいて陰性選択によってゲートアウトした。(E):MEFフィーダーを含まない単離された生存可能hESC分率は、最終的にP4(TG30ネグ-GCTM-2ネグ)、P5(TG30低-GCTM-2低)、P6(TG30 Mid-GCTM-2Mid)、およびP7(TG30Hi-GCTM-2Hi)の亜集団に分画される。負のゲート(TG30Neg-GCTM-2Neg、P4という名前)は、未染色細胞のバックグラウンド自己蛍光に応じて設定され、またアイソタイプコントロールに設定されました。(F):TG30/GCTM-2 フローサイトメトリー解析に典型的な異なるゲートサブ集団の割合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig1large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな図が表示されます</a>。
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig2.jpg"> 図 2.hESC-MEL1株から自発的に分化したP4(TG30陰性-GCTM-2陰性)細胞の代表的な連続培養。(A):代表的なTG30/GCTM-2 FACSプロットは、TG30およびGCTM-2細胞表面マーカーの検出発現のレベルによって識別される細胞(P4、P5、P6およびP7)のゲートサブセットを示す。P4(TG30陰-GCTM-2陰性)を示す400,000hESC誘導体の初期集団は、hESC−MEL1ラインのバルク培養物から収集される。これらのP4(TG30陰-GCTM-2陰細胞)細胞は、合流(11〜13日間)に達するまで、T75フラスコにおけるhESC再生を支持する条件でFACS後に連続的に継代される。各通路の前に、TG30/GCTM-2 FACSは、P4(TG30陰性-GCTM-2陰性)分化された細胞タイプのみを収集および再培養するために行われる。(B):14日後の分化P4(TG30陰-GCTM-2陰性)細胞の芝生の典型的な形態。(C):14日後に見られる散発性hESC様コロニーは、P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)の芝生と混ざり合って、通過1のみで、P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞を汚染することによって発生する可能性が最も高い。スケールバー= 200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig2large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな図が表示されます</a>。
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50856/50856fig3.jpg"> 図 3.P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)hESCラインに由来する細胞は、その固有多能性特性を失うことなく、FACS後連続的に継代することができる。TG30/GCTM-2 FACSの代表的な免疫プロファイリングは、異なる連続した通路の、TG30およびGCTM-2の発現レベルに従って細胞の判別サブセット(P4、P5、P6、およびP7)を示す。(A):P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)特性を示す400,000個の細胞の開始集団は、hESC-MEL1ラインのバルク培養物から取得される。多能性P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)細胞は、T75フラスコにおけるhESC再生を支持する条件でFACS後に連続的に継代され、〜80%の合流度(9-11日)に達するまでである。TG30/GCTM-2 FACS免疫プロファイリングは、各通路で細胞を再めっきする前に行われ、P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞のみが再培養されます。結果は、P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)細胞が、その後の過渡と共に多能性特性を保存することを示し、 FACSの各勾配における(TG30 Hi-GCTM-2Hi)発現の保存、hESC様コロニー (B)の形成、および区別P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)の小分画の要約から推測できるように区別する能力を維持することを含む。スケールバー= 200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50856/50856fig3large.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな図が表示されます</a>。
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>サンプル(反応量)</td>
			<td>一次抗体</td>
			<td>二次抗体</td>
			<td>PEラットアンチマウスCD90.2 b</td>
			<td>ヨウ化プロピジウム c</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソートサンプル(プライマリABの場合は約9ml、セカンダリABの場合は2.5ml)</td>
			<td>(TG30 + GCTM-2) a
</td>
			<td>AF 488ヤギアンチマウスIgG2a + AF 647ヤギアンチマウスIgM</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール1:TG30(200 μl)</td>
			<td>TG30</td>
			<td>AF 488ヤギアンチマウスIgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール-2:GCTM-2(200 μl)</td>
			<td>GCTM-2</td>
			<td>AF 647 ヤギ アンチマウス IgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール3:アンチマウスCD90.2(200 μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール4:フィコエリエリン(PE)(200 μl)</td>
			<td>マウス IgG2a アイソタイプ</td>
			<td>R-フィコエリスリンヤギ抗マウスIgG2a</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール5:マウス免疫グロブリンアイソタイプ(200 μl)</td>
			<td>マウス IgG2a アイソタイプ + IgM アイソタイプ</td>
			<td>AF 488ヤギアンチマウスIgG2a + AF 647ヤギアンチマウスIgM</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>コントロール6:染色されていない細胞(200μl)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.FACS の並べ替えのサンプルとコントロールを並べ替えます。a並べ替えサンプルは、TG30およびGCTM-2抗体と同時に免疫染色される。 bPE-アンチマウス CD90.2 は、マウス細胞を認識し、FACS14の間に hESC から MEF を除去するために使用されます。 c非生存細胞は、0.3 μg/mlの最終濃度でヨウ化プロピジウムを使用して除外されます。試薬を加えた(+)、反応管に添加しない(-)
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>抗体 </td>
			<td>ホスト</td>
			<td>アイソタイプ</td>
			<td>ワーキング希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>TG30 (1.4 mg/ml)</td>
			<td>鼠</td>
			<td>イググ2a</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>GCTM-2 (ハイブリドーマ上清)</td>
			<td>鼠</td>
			<td>イグム</td>
			<td>1:5 ~ 1:10 a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 488ヤギアンチマウスIgG2a</td>
			<td>山羊</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>AF 647 ヤギ アンチマウス IgM</td>
			<td>山羊</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-フィコエリスリン (PE) ヤギ抗マウス IgG2a</td>
			<td>山羊</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>アンチマウス CD90.2</td>
			<td>鼠</td>
			<td>イググ2b</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>精製マウス IgG2a、 κ アイソタイプコントロール</td>
			<td>鼠</td>
			<td>イググ2a</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
<tr>
<td>精製マウス IgM、κ アイソタイプコントロール</td>
			<td>鼠</td>
			<td>イグム</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.FACS分類のための抗体の詳細および希釈。hESCの細胞表面上のGCTM-2の発現が極めて高いため、この抗体では飽和状態に達することは不可能です。GCTM-2ハイブリドーマ上清の各バッチは、標準的なコントロールまたは以前のバッチに対して、スケールのhESCと同様の結果を得るために、染色を避けるために滴定する必要があります。
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>メディアの名前</td>
			<td>組成</td>
		</tr>
<tr>
<td>hESC/KOSR培地</td>
			<td>ダルベッコの修飾イーグル培地:栄養素混合物F-12(DMEM/ F-12)は、20%ノックアウト血清置換術(KOSR)、2mMグルタマックス、1%MEM非必須アミノ酸、0.1 mM 2-Mercaptoエタノール、10ng/mlヒト線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)およびペン/ストレプトで補った。</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEF培地</td>
			<td>ダルベッコの修飾イーグルミディアム、高グルコース(DMEM)は10%の胎児血清(FBS)、2 mMグルタマックス、ペン/ストレップ1xで補った。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3.培養培地の構成。

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Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

我々は、正の選択を用いた生きたヒト胚性幹細胞(hESC)の同定および濃縮のための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介した細胞表面抗原の複合検出のためのモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用と、混合細胞集団からのhESCCをパージするための否定的選択の使用について述べた。

モノクローナル抗体TG30およびGCTM-2を用いた細胞表面抗原の検出によるヒト胚性幹細胞の濃縮とパージ

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

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