MS et YZ sont pris en charge par KCL KCL et la Chine bourses de doctorat. MO a été financée par une bourse d&#39;études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Masaru Okabe et Jun-ichi Miyazaki pour le plasmide pCX-EGFP et Alain Chedotal et Athena Ypsilanti pour de précieux conseils sur l&#39;électroporation.

Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales. Une. Postnatale électroporation 1.1. Préparation de verre capillaires, de l&#39;ADN de solutions et Electroporator <ol><li> Préparer des capillaires de verre tiré (DO: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) pour l&#39;injection d&#39;ADN. (Paramètres indicatifs pour un capillaire extracteur Sutter P-97 sont: chaleur 283; Tirer 50; Velocity 90; heure 50). Faire une marque sur le capillaire correspondant à un volume d&#39;environ 2 pl. </li><li> Régler la tension de la électroporateur à 5 impulsions carrées, 50 ms / impulsion à 100 V, avec 850 intervalles ms (100 V, impulsion ON 50 ms, impulsion OFF 850 ​​ms, impulsion 5). </li><li> Diluer à haute pureté (DO 260/280&gt; 1,80) de l&#39;ADN plasmidique à l&#39;endotoxine libre à une concentration finale de 1 à 2 ug / ulavec une endotoxine libérer un tampon Tris-EDTA ou du PBS. Il est recommandé d&#39;ajouter 0,1% de vert de production rapide de la solution d&#39;ADN (le colorant doit se propager dans le ventricule lorsqu&#39;il est injecté avec succès). </li><li> Préparer les électrodes 5-7 mm, le gel de l&#39;électrode et réchauffer le coussin chauffant. </li></ol> 1.2. Électroporation <ol><li> Suppression d&#39;un jour 2 chiot postnatal de la souris de cage et anesthésier par inhalation d&#39;isoflurane (à un débit de ~ 0,6 L / min). </li><li> Après environ 1 minute, de déterminer l&#39;état de l&#39;anesthésie à l&#39;aide de la réponse du pied presseur. Si aucun mouvement n&#39;est détecté, procéder à l&#39;injection intraventriculaire. </li><li> Charger aiguille capillaire avec 1-2 pl de l&#39;ADN en utilisant un tube d&#39;aspiration relié au tube capillaire. </li><li> Sous une source de lumière froide, tenir la tête du chiot entre le pouce et l&#39;index de votre main moins dominante. Tirez légèrement la peau du dos de la tête pour aider à l&#39;identification du point d&#39;injection à droite. </li><li> Considérons une ligne virtuelle entre l&#39;œil et til craniométriques repère lambda (figure 1A). Insérer l&#39;aiguille capillaire à environ un tiers de la longueur de cette ligne à partir de la lambda (environ 1 mm à partir du point médian de la ligne 15). Insérer le capillaire sur 2 mm de profondeur, en veillant à éviter une pénétration profonde dans le cerveau. </li><li> Injecter lentement plasmide par soufflage à travers la bouche (une seringue connectée au capillaire peut également être utilisé). Au cours de cette procédure, assurez-vous que vos doigts ne sont pas appliquer trop de pression sur le cerveau, car cela peut empêcher l&#39;injection de plasmide succès. </li><li> Arrêter l&#39;injection lorsque la quantité minimale de solution d&#39;ADN est laissé dans le capillaire. Il est recommandé d&#39;injecter à moins de 1 ul d&#39;éviter l&#39;augmentation de la pression intracrânienne délétère. </li><li> Manteau deux électrodes avec du gel et placez-les avec le côté positif sur la face latérale de l&#39;hémisphère où l&#39;ADN a été injecté (figure 1A). Pour l&#39;incorporation d&#39;ADN dans la SVZ rostrale, place des électrodes peu rostrale à lapoint d&#39;injection. Faire varier la position de l&#39;électrode peut obtenir une spécificité régionale de l&#39;électroporation dans différents domaines de la SVZ 22,25. </li><li> Initier le transfert en cours en appuyant sur la pédale impulsion de pédale. Lorsque l&#39;électroporation est terminée, vérifier la tension sur l&#39;écran de électroporateur (valeurs de tension ne doit pas être inférieure à 90 V, car les valeurs de tension plus faible corrélation avec une faible efficacité d&#39;électroporation). </li><li> Réanimer le chiot sous oxygène sur coussin chauffant pendant quelques minutes et le retourner à la cage, le plaçant loin de la mère. Assurez-vous que la mère récupère le chiot et réunit avec le reste de la litière. Après électroporation, laissez les petits avec leur mère pendant 4-7 jours avant l&#39;étape suivante. </li></ol> 2. Préparation des cultures aiguë tranche cerveau 2.1. Préparation des solutions et outils <ol><li> Les solutions suivantes sont nécessaires (il est également possible d&#39;utiliser-DMEM riche en glucose pour disséquer et d&#39;imagerie17): Dissection Medium (500 ml) Médias équilibrée de Gey - 500ml 45% Glucose - 5ml Film moyen (10 ml) 45% de glucose - 0.110 ml HEPES 1 M - 0,100 ml Pen / Strep - 0.100 ml FCS - 0.500 ml B27 - 0.100 ml Glutamine - 0,200 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (rouge de phénol libre) - 8,89 ml </li><li> Réchauffez milieu de film à 37 ° C. </li><li> Placez Millicell insère dans un fond plat de la culture 35 mm de verre contenant 1 ml de milieu de film et placer dans un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Préparer vibratome accessoires (tournevis, chambre, lames de rasoir, de la colle). </li><li> Préparer les outils de dissection: ciseaux, petite spatule, pinces droites. </li><li> Préparer les outils pour la manipulation de tranches: petit pinceau doux ou anse (taille: 10 pi), pipettes Pasteur en plastique, une boîte de glace et plusieurs plats en plastique 6 cm. </li><li> Prérefroidir le milieu de dissectionà 2-4 ° C. </li></ol> 2.2. Préparation des tranches de cerveau <ol><li> Remplir un plat de 6 cm avec un milieu de dissection pré-refroidi et placez-le sur la glace (pour garder des tranches fraîchement coupées). </li><li> Après la dislocation cervicale, utiliser des ciseaux pour décapiter le chiot de la souris. Retirez le cuir chevelu avec un scalpel, couper le crâne long de la suture mi-sagittal de l&#39;OB pour le cervelet et retirez délicatement les volets crâniens aide d&#39;une pince. Assurez-vous que l&#39;ensemble du cerveau est exposé et soigneusement disséquer à l&#39;aide d&#39;une spatule, en prenant soin de ne pas endommager le tissu. La dissection doit être fait avec soin, mais en même temps très rapidement (moins d&#39;une minute si possible). Dislocation cervicale est notre méthode préférée, car l&#39;anesthésie terminaux avec des anesthésiques médicaments / de gaz peuvent influencer les propriétés de migration des neuroblastes et l&#39;état de santé des cultures tranche de cerveau, qui doivent être imagé relativement rapidement après le sacrifice animal. </li><li> Hemisect le cerveau avec un razou lame (Figure 2). Jeter hémisphère non injectée ou à d&#39;autres expériences. </li><li> Placer un petit morceau de ruban adhésif sur le support de vibratome et utiliser la quantité minimale nécessaire de la colle pour fixer l&#39;hémisphère du cerveau au-dessus de celui-ci (figure 2). Ceci permet d&#39;éviter d&#39;endommager la surface de support à des applications répétées en raison de la colle. </li><li> Laissez la colle sécher pendant quelques secondes. </li><li> Placez support dans le bac vibratome rempli de solution de dissection pré-refroidi. Pointer le bulbe olfactif vers la lame (Figure 2). </li><li> Commencez à couper l&#39;hémisphère du cerveau en utilisant les paramètres appropriés. Les paramètres suivants sont recommandés: épaisseur de la tranche 300 um; vitesse ~ 3-5, la fréquence ~ 9. Haute fréquence et basse vitesse sont recommandés pour éviter d&#39;endommager la tranche. </li><li> Recueillir tranches à l&#39;aide d&#39;un petit pinceau ou une anse doux. Ne garder que les tranches avec OB visible (habituellement 2-3 tranches / cerveau). Typiquement, la tranche contenant la plupart des RMS can se trouve à ~ 300 um de la surface inférieure. </li><li> Vérifiez tranches sous un microscope fluorescent standard pour le signal de la GFP (en prenant soin de les retourner pour vérifier fluorescence des deux côtés), et choisir celles montrant la fluorescence lumineuse le long de la plupart des RMS. </li></ol> 2.3. La culture de tranches de cerveau <ol><li> Dans une hotte de culture cellulaire, couper la troisième plus caudale de la tranche de cerveau et enlever toute trace de colle en utilisant une pince à épiler droites fines ou un scalpel de microdissection. </li><li> Délicatement aspirer la tranche à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de la pipette pour créer une plus grande ouverture, ce sera de ne pas endommager la tranche) et le placer sur le centre d&#39;un Millicell préchauffé insert. </li><li> Assurez-vous que le côté avec le signal fluorescent lumineux est placé en contact avec le Millicell insérer (pour l&#39;imagerie avec un microscope inversé). </li><li> Retirer la solution de dissection excès au-dessus de l&#39;insert avec une pipette. </li><li> Laissez cultures tranche des&#39;installer dans un C / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° pendant au moins 1 h avant l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Imagerie time-lapse de la migration neuroblaste <ol><li> Au moins 2 heures avant l&#39;imagerie, allumez le système Perkin Elmer UltraViewVoX confocale à disque rotatif, inversé Nikon Ti-E microscope, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) caméra CCD refroidie numérique, et le système de chauffage (Solent scientifique) fixé à la constante température de 37 ° C. </li><li> Ouvrez le module d&#39;acquisition de logiciels de Volocity et cliquez sur le bouton &quot;Viz&quot; et sélectionnez le laser (s) pour l&#39;imagerie. </li><li> Dans 2 heures de cerveau préparation de tranches, placez le plat de fond de verre contenant la tranche de cerveau dans la chambre d&#39;imagerie sur la platine du microscope. </li><li> Utilisez un objectif Nikon FCI super plan Fluor ELWD 20X/0.45 sous la lumière fluorescente approprié de choisir et de se concentrer le domaine de la tranche qui sera imagée (par exemple, la première partie descendante du RMS juste après le site d&#39;injection, ou la elbow région des RMS, ou juste après le coude avant neuroblastes entrer l&#39;OB). </li><li> Mettre en place l&#39;imagerie time-lapse avec les actions suivantes: <ol><li> Sur le microscope, cliquez sur le bouton L100 pour permettre à balayage laser de l&#39;échantillon. </li><li> En Volocity, ouvrez le changeur laser ultraView en sélectionnant le laser approprié (par exemple 488 nm laser pour la GFP). </li><li> Régler le temps d&#39;exposition (en général entre 100 à 500 ms) et de l&#39;intensité du laser (en général 20 à 30%) en fonction de l&#39;intensité du signal fluorescent. </li><li> Réglez le gain d&#39;image numérique pour améliorer la visualisation de la cellule. </li><li> Sélectionnez l&#39;intervalle z-pile à l&#39;image à l&#39;intérieur de la tranche de cerveau (généralement sur ​​une intervalle de 100-120 um). Choisir un intervalle d&#39;un nombre approprié de cellules isolées pour éviter des chevauchements possible, autant que possible (ce qui facilitera l&#39;analyse de suivi ultérieur). </li><li> Sélectionner l&#39;espacement entre chaque image z-pile (habituellement 2-4 um). </li><li> Choisissez le moment intErval entre chaque capture z-pile (par exemple 3 min) et la durée totale de formation d&#39;image (par exemple de 3 heures). </li><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Sauvegarder&quot; pour enregistrer les modifications apportées aux paramètres d&#39;imagerie. </li><li> Appuyez sur le bouton d&#39;enregistrement pour commencer l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Alternate imagerie d&#39;échantillons témoins et expérimentaux (par exemple véhicule / traitement médicamenteux ou différents plasmides par électroporation) dans l&#39;ensemble le même jour. </li></ol> 4. Analyser neuroblaste migrations <ol><li> Dans le module Volocity quantification, ouvrez la bibliothèque souhaitée créé après avoir terminé une expérience time-lapse. Sélectionnez &quot;Mise au point étendue&quot; de la boîte en haut à gauche (figure 4A, étape 1). </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Mesures&quot; pour afficher la fenêtre de mesure (figure 4A, étape 2). </li><li> Une liste de tâches est visible dans le coin inférieur gauche de l&#39;écran. Drag &quot;Track&quot; (présent sous le titre «Divers» au bas dela liste) sur l&#39;espace ci-dessus. Cela incitera l&#39;ouverture d&#39;une nouvelle fenêtre appelée &quot;Track&quot; à la partie supérieure gauche de l&#39;écran (figure 4A, étape 3). </li><li> Sélectionnez &quot;Points&quot; de l&#39;onglet &quot;Input&quot; dans la fenêtre Track (figure 4A, étape 4). </li><li> Cliquez sur l&#39;outil Point (figure 4A, étape 5). </li><li> Commencer le suivi de la neuroblastes migration en cliquant avec la souris sur la zone centrale du corps cellulaire et de garder le suivi des mouvements de la cellule jusqu&#39;à ce que le dernier point de la time-lapse de temps est atteinte (par exemple le point numéro 61 pour un film de 3 heures de long) . </li><li> Pour obtenir des données choisir &quot;Faire Point de mesure&quot; dans le menu Mesures (figure 4B, les étapes 6-7). Une fenêtre apparaît au centre de l&#39;écran. </li><li> Dans cette fenêtre, sélectionnez &quot;Un nouvel élément de mesure appelée:&quot; et tapez un nom (figure 4C, étape 8). N&#39;oubliez pas de sélectionner l&#39;option &quot;Tous les points de temps&quot; avant presser OK (figure 4C, étape 9). Un fichier d&#39;élément de mesure apparaîtra sous le fichier time-lapse et contenir des paramètres pour l&#39;analyse quantitative (par exemple, la distance de migration, de vitesse, de déplacement, et taux de déplacement). </li><li> Double-cliquez sur le fichier d&#39;élément de mesure de l&#39;ouvrir comme une fenêtre (figure 4D, l&#39;étape 10). </li><li> Pour visualiser les pistes individuelles de cellules analysées, choisissez «Point chenilles&quot; dans les options d&#39;affichage &quot;&quot; (figure 4D, étape 11). </li><li> Faites un clic droit sur le fichier d&#39;objet de mesure et de l&#39;exporter en tant que fichier texte, qui peut ensuite être importé dans des programmes comme Excel pour analyser les paramètres de migration. </li><li> Pour mesurer les mouvements entre les images consécutives et les pauses faites par chaque cellule au cours de la période de tournage, dans le fichier d&#39;objet mesure, sélectionner des options &quot;Affichage&quot; &quot;point&quot; ou &quot;populations&quot; et cliquez sur ID (chaque piste a un numéro d&#39;identification unique). Exportez le fichier résultant par procéderment comme expliqué à l&#39;étape 4.10. </li></ol>

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R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone.">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li><li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy.">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li><li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington's+disease.">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits.">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li><li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain.">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration.">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li><li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease.">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li><li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb.">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li><li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain.">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Migration efficace de cellules progénitrices neurales le long des RMS assure leur maturation ultérieure en neurones fonctionnels 10. Flux importants de progéniteurs neuronaux dirigés vers l&#39;OB sont visibles dans l&#39;enfance humaine et sont susceptibles de jouer un rôle important au début postnatal le développement du cerveau humain 27. De plus, ces cellules sont capables de cibler des sites du cerveau affectées par une lésion et la neurodégénérescence 4,28. Être capabl...

Dans le cerveau des mammifères, la génération de nouveaux neurones (neurogenèse) commence après la naissance principalement dans deux régions, la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire dans le gyrus denté de l&#39;hippocampe 1. Des preuves considérables recueillies au cours des dernières années prend en charge un rôle essentiel pour la neurogenèse postnatale dans les fonctions de mémoire de l&#39;ampoule de l&#39;hippocampe et olfactives 1-3. Surtout, la neurogenèse postnatale est également titulaire d&#39;un potentiel thérapeutique en raison de sa relation avec les troubles neurologiques dégénératives, et la capacité des neuroblastes à migrer vers les sites blessés dans le cerveau 4-6. La zone sous-ventriculaire (SVZ) a récemment émergé comme une niche neurogène crucial. Neuroblastes SVZ dérivés migrent vers le bulbe olfactif (OB) via le courant de migration rostrale (RMS), ce qui en fait le plus long processus de migration dans le cerveau 1,7,8 postnatale. Le / RMS / système de OB mammifère SVZ est devenu unmodèle utile pour étudier les différentes étapes de la neurogenèse, tels que la prolifération, la migration et la différenciation 1,8. Beaucoup de facteurs de croissance et signaux extracellulaires régulent la neurogenèse SVZ et migration le long des RMS, mais les mécanismes moléculaires intracellulaires sont loin d&#39;être pleinement compris 1,9. Migration correcte le long des RMS est essentiel pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones 10. En outre, certaines études ont montré que les neuroblastes SVZ dérivés peuvent migrer hors des RMS aux sites de lésions cérébrales 4-6,11-13. Ainsi, l&#39;enquête de la migration des neuroblastes mécanismes de signalisation de régulation est fondamental non seulement pour comprendre la neurogenèse, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour marquer progéniteurs neuronaux SVZ par électroporation postnatale in vivo et de suivre leur migration le long des RMS dans les cultures de tranches de cerveau de courte durée en utilisant time-lapse disque rotatif confocale microscopy. L&#39;électroporation est largement utilisé dans les études de développement de l&#39;embryon à stade adulte 14-18. Il est un outil puissant pour cibler et manipuler progéniteurs neuronaux SVZ et représente une alternative moins coûteuse et beaucoup plus rapide à l&#39;injection stéréotaxique de vecteurs viraux ou génération de modèles transgéniques 1,15,19,20. Il s&#39;agit d&#39;un procédé relativement simple qui ne nécessite pas une intervention chirurgicale et a des taux de survie élevés. Électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant dans les modèles génétiques de souris qui emploient le système loxP peut être utilisé pour cibler des gènes d&#39;intérêt ou de réaliser l&#39;étiquetage permanent des progéniteurs SVZ, ce qui représente un outil utile pour les études de la neurogenèse adulte 21,22. Imagerie RMS migration des neuroblastes dans le cerveau intact est encore difficile en raison de limitations techniques actuelles. Toutefois, ce processus peut être contrôlé à l&#39;aide confocale à disque rotatif time-lapse microscopie de tranches de cerveau de courte durée, qui fournissent un syst appropriélui ressemblant étroitement à la condition in vivo aussi prêtent à la manipulation pharmacologique 23,24. Couplage dans électroporation postnatale vivo avec imagerie time-lapse facilitera la compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant neuroblastes motilité et contribuer au développement de nouvelles approches pour promouvoir la réparation du cerveau.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="854">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Millicell</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:149px;">PICM0RG50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm Glass bottom culture dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td style="width:149px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gey&#39;s Balanced media</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose, 45%</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">10109-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:195px;"><a>Invitrogen Life Technologies</a></td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (phenol red-free)</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td style="width:149px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Glass capillaries for injection</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">30-0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Aspirator tube</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:149px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sutter P-97 capillary puller</td>
			<td style="width:195px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:149px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">ECM830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Platinum Tweezertrodes 7 mm</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Footswitch Model 1250F</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:149px;">45-0211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel for electrodes</td>
			<td style="width:195px;">Cefar Compex</td>
			<td style="width:149px;">6602048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:195px;">Merial</td>
			<td style="width:149px;">AP/DRUGS/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:149px;">VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glue</td>
			<td>Roti coll</td>
			<td>Roti coll 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraViEW VoX spinning disk system</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Volocity software</td>
			<td style="width:195px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Acquisition, Quantitation, Visualization Modules</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Environmental chamber for microscopy</td>
			<td style="width:195px;">Solent Scientific</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:149px;"></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l&#39;une des principales niches neurogène dans le cerveau postnatal. Ici, cellules progénitrices neurales prolifèrent et donnent lieu à des neuroblastes capables de se déplacer le long de la courant de migration rostrale (RMS) vers le bulbe olfactif (OB). Cette migration de longue distance est nécessaire pour la maturation ultérieure de nouveaux neurones dans l&#39;OB, mais les mécanismes moléculaires qui régulent ce processus sont encore peu claires. Enquêter sur les voies de signalisation contrôlant neuroblastes motilité peut non seulement aider à comprendre une étape fondamentale dans la neurogenèse, mais aussi avoir un potentiel de régénération thérapeutique, compte tenu de la capacité de ces neuroblastes de cibler des sites cérébrales affectées par une blessure, accident vasculaire cérébral, ou dégénérescence. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé pour in vivo électroporation postnatal et après imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes dans le RMS de la souris. Électroporation postnatale peut efficacement transfecter SVZ ancêtrecellules, qui à leur tour, les neuroblastes qui migrent le long des RMS. Confocale disque en rotation time-lapse microscopie sur des cultures de tranches de cerveau de courte durée, la migration des neuroblastes peut être contrôlée dans un environnement ressemblant étroitement à la condition in vivo. En outre, neuroblaste motilité peut être suivi et analysé quantitativement. A titre d&#39;exemple, nous décrivons comment utiliser in vivo postnatale électroporation d&#39;un plasmide exprimant la GFP d&#39;étiqueter et de visualiser les neuroblastes qui migrent le long des RMS. L&#39;électroporation de plasmides shRNA ou CRE recombinase exprimant chez la souris knock-out conditionnel qui emploient le système de LoxP peut également être utilisé pour cibler des gènes d&#39;intérêt. Manipulation pharmacologique des cultures de tranches de cerveau aiguë peut être effectuée pour étudier le rôle des différentes molécules de signalisation dans la migration des neuroblastes. En couplant électroporation in vivo avec imagerie time-lapse, nous espérons comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent la motilité neuroblastes et contribuer au développementment de nouvelles approches pour favoriser la réparation du cerveau.

Étiquetage des neuroblastes migrateurs SVZ dérivés peut être observé le long des RMS, habituellement 4-8 jours après une électroporation réussie (figure 1B). Points de plus longues peuvent également être choisis, mais moins de cellules se trouvent dans les RMS, car la plupart d&#39;entre eux sont entrés dans l&#39;OB. Neuroblastes commencent acquisition morphologie typique et les caractéristiques de cellules granulaires matures dans l&#39;OB environ 2-3 semaines après l&#39;électroporation...

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In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l&#39;étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l&#39;aide de l&#39;imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l&#39;analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

13.1K vues.  King's College London.  la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo. 

Vidéo: In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Recherche

Neurosciences

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Imagerie du calcium chez la souris Olive inférieure

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...