Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut de recherche et d&#39;innovation en biomédecine (IRIB), la plate-forme de la Normandie d&#39;imagerie cellulaire (PRIMACEN), l&#39;Inserm, IBiSA, l&#39;Université de Rouen, le Fonds européen de développement régional (FEDER - PERENE, Interreg 4A), LARC-Neurosciences réseau et de la Région Haute-Normandie.

Animaux (mâle ou rats Wistar femelles) sont nés et élevés dans une animalerie accrédité (approbation B.76-451-04), selon le guide français pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Des expériences ont été menées sous la supervision de chercheurs autorisés (MB, DV et LG) en conformité avec la directive européenne Conseil de la Communauté (2010/63 / UE du 22 Septembre 2010) et le ministère français de l&#39;Agriculture. 1. Préparation des supports et outils <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, préparer la BSS 1x Hank (HBSS) dans l&#39;eau stérile de 10x solution stock contenant CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l) sans MgCl 2. Ajouter NaHCO 3 (350 pg / ml) à 1x solution de HBSS. </li><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, ajouter N2 supplément (à partir d&#39;une solution stock 100x) et de la pénicilline (100 unités / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) solution à moyen Eagle modifié (DMEM) nutriment mix de Dulbeccoture F-12 (1: 1). </li><li> Dans des conditions stériles, préparer une aliquote (25 ul, 2 mM) du colorant fluorescent cytoplasmique cellulaire appelée Tracker vert dans du DMSO (1,075 ml à 1 mg). Diluer une aliquote de 5 ml de DMEM dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Préparer rempli seau à glace pour garder les médias à 4 ° C. </li><li> Décontaminer laboratoire paillasses et des outils avec 70% d&#39;éthanol. </li></ol> 2. Dissection du cervelet de rats P10 <ol><li> Décapiter rapidement ratons (P10) avec des ciseaux courbes de fonctionnement derrière les oreilles afin d&#39;obtenir le début de la moelle épinière. </li><li> A l&#39;arrière-côté de la tête décapitée, faire une incision médiane de la peau du cou pour le nez avec iris ciseaux fins et séparer la peau du crâne avec iris ciseaux fins et Dumont # 3 forceps. </li><li> Utilisez des ciseaux fins de l&#39;iris pour faire délicatement deux incisions latérales de la base dans la région rostrale du crâne. Retirer le crâne disséqué avec deux # 3 forceps. Détachez le soutien-gorgeà partir de toute adhérence avec le crâne en utilisant les mêmes forceps. </li><li> Transférer le cerveau avec l&#39;extrémité d&#39;une spatule de cuillère à boîte de Petri (Ø 35 mm) contenant 2 ml de milieu HBSS glacée. </li><li> Mettez la boîte de Petri contenant le cerveau dans une plus grande boîte de Petri (Ø 100 mm) rempli de glace et transfert à l&#39;étape de la loupe binoculaire. </li><li> Sous un stéréomicroscope, isoler le cervelet du cerveau par dilacération utilisant deux # 3 forceps. De même, retirer la moelle épinière résiduelle et la pie-mère-membrane. </li><li> Transférer le cervelet dans une nouvelle boîte de Pétri HBSS-rempli (Ø 35 mm, 2 ml) avec l&#39;extrémité de la cuillère d&#39;une spatule et garder sur la glace. </li></ol> 3. Préparation des aigus cervelet tranches <ol><li> Sous la loupe binoculaire, couper le cervelet entre les vermis et l&#39;hémisphère droit comme indiqué par les deux têtes flèche dans la figure 2A avec une poignée de scalpel norme n ° 3 solide et une lame chirurgicale # 15. </li><li> Mettre une goutte de cyanoacrylate colle sur la platine de vibratome et attendre 15 à 25 secondes pour éliminer les vapeurs de solvants toxiques. </li><li> Recueillir le cervelet de coupe avec la fin de la cuillère d&#39;une spatule et éliminer l&#39;excès de HBSS avec des serviettes en papier propre. </li><li> Apportez le cervelet près de la platine. Fixer le bord de coupe de la platine et attendre 10 sec. </li><li> Insérez le disque d&#39;échantillon dans le bac tampon avec le manipulateur, et le faire pivoter afin de l&#39;axe transversal du cervelet est perpendiculaire au porte-couteau. Fixer le disque de l&#39;échantillon avec une clé Allen et remplir doucement le bac tampon avec du milieu HBSS jusqu&#39;à ce que le cervelet est couvert. </li><li> Charge de la glace pilée dans le bain de refroidissement. </li><li> Nettoyer les lames trois fois avec de l&#39;éthanol à 70% afin d&#39;éliminer toute l&#39;huile. </li><li> Insérez la lame dans le porte-couteau et le fixer avec la vis de serrage. </li><li> Placez le bord droite de la lame derrière le bord arrière (de la vue de l&#39;utilisateur) de l&#39;échantillon et le définir comme un point de départ. Utilisez commandement avancé pour définir til le point final après le bord avant de l&#39;échantillon. </li><li> Sélectionnez sectionnement vitesse à 2,5 et sectionnement fréquence à 8. Sélectionnez épaisseur de dégrossissage à 180 um. Démarrer une découpe de tissu. </li><li> Pick-up chaque section en utilisant un verre à large alésage tronqué pipette et transférer Pasteur à HBSS contenant boîte de Petri (Ø 35 mm) conservé dans la glace. </li><li> L&#39;utilisation de deux # 5 pince, retirer les méninges soin du cervelet lorsque interférer avec la lame. Collectez un maximum de 5 tranches par cervelet (Figure 2B, C). </li><li> Retirez les méninges des tranches de cervelet soigneusement avec deux pinces # 5 sous la loupe binoculaire et séparer délicatement les lobules pour une meilleure charge de sonde. </li></ol> 4. coloration fluorescente de vie Interneurones <ol><li> Transfert tranches de cervelet avec une pipette de Pasteur verre à large alésage tronqué à une plaque de 6 puits (max 3 tranches / par puits). Aspirer le milieu HBSS. </li><li> Incuber tranches (3 max) dans 5 ml de loading solution du colorant fluorescent (10 uM). </li><li> Pour protéger de la lumière, couvrir la microplaque de papier d&#39;aluminium. Mettez-le sur une table gyro-mobile à 35 tours par minute pendant 10 min à température ambiante pour faciliter l&#39;étiquetage de la cellule. </li><li> tranches de transfert sur ​​la membrane d&#39;un Transwell insérer (3,0 um taille des pores; Figure 2D) avec une pipette de Pasteur verre à large alésage tronqué. Aspirer le milieu de chargement avec pipette. </li><li> Retirer l&#39;insert et remplissez le puits avec 1,9 ml de DMEM. Remplacer l&#39;insert et ajouter 100 ul de DMEM sur le dessus de la tranche pour couvrir le tissu. </li><li> Placer la plaque contenant les inserts de culture dans la chambre de l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2) pendant 2 heures ce qui est suffisant pour observer GC dans le ML. Lie tissus plates pour permettre la fixation sur la membrane de l&#39;insert (figure 2E). Veiller à ce que les tranches sont pas de séchage. </li></ol> 5. Ex vivo Imaging Grâce confocale Macroscopie <ol><li> Transférer la plaque sansle couvercle en plastique dans un incubateur attaché à la barre d&#39;un macroscope confocal. Placez un couvercle de verre sur l&#39;insert de plaque de la macroscope. Maintenir la température de la chambre à 37,0 ° C ± 0,5 ° C, et de fournir les tranches avec un débit de gaz constant (95% O 2, 5% CO 2) à travers l&#39;insert en forme de plaque pour maintenir le pH constant. Attendez 2 heures supplémentaires avant l&#39;expérience time-lapse. </li><li> La distance Pour visualiser la migration de GC dans les tranches de tissu, éclairer la préparation avec une longueur d&#39;onde de lumière de 488 nm à l&#39;aide d&#39;une diode laser à travers un macroscope de confocal à balayage laser équipé d&#39;un objectif à sec X2 (travail: 39 mm, diamètre: 58 mm, NA = 0,234), et de détecter l&#39;émission de fluorescence de 500 à 530 nm. <ol><li> Pour résoudre finement le mouvement de GC, acquérir des images avec un facteur de zoom optique supplémentaire de 1,5 à 2,0. Récupérer des images de GN dans un plan focal unique ou jusqu&#39;à 10 plans focaux différents le long de l&#39;axe z toutes les 30 min jusqu&#39;à 12 heures. </li></ol></li&gt; <li> Si nécessaire, retirez le couvercle de verre et ajouter des petits volumes (1-10 pi) d&#39;activateurs biologiques ou inhibiteurs dans DMEM avec une pipette de 10 ul d&#39;étudier leur effet sur la migration de GC. </li></ol> Suivi 6. Cell <ol><li> Pour chaque temps du film, effectuer une projection z-pile à travers le mode de type ecart dans ImageJ. Moduler le contraste et les niveaux des images successives de luminosité afin de faciliter l&#39;identification et le suivi des GC étiquetés. Carte manuellement chaque position sur l&#39;instantané de référence (à t = 0). <ol><li> Utilisez le &quot;suivi manuel&quot; plug-in dans le menu de particules Analyse et de déterminer en cliquant sur le point de chaque corps de la cellule de gravité pendant time-lapse. Exporter les données de suivi premières dans un tableur. </li></ol></li><li> Réorganiser les données de suivi premières exportées de ImageJ avec un programme intelligent de maison (http://primacen.fr, écrite dans le code PHP) qui identifient chaque cellule et les positions associées. Utilisation du programme, calculate la distance totale parcourue et la vitesse moyenne de la migration pour chaque cellule. Classer et comparer les caractéristiques de la migration des cellules dans des conditions de contrôle et de traitement en vertu de filtres appropriés, en utilisant le même programme. </li></ol>

<ol>
	<li>Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+in+the+Cerebellum.">Migration in the Cerebellum.</a> Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+modes+of+neuronal+migration+in+different+domains+of+developing+cerebellar+cortex.">Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex.</a> Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).</li><li>Komuro, H., Yacubova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+cerebellar+granule+cell+migration.">Recent advances in cerebellar granule cell migration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).</li><li>Fahrion, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+neuronal+migration+deficits+in+a+mouse+model+of+fetal+Minamata+disease+by+increasing+neuronal+Ca2++spike+frequency.">Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency.</a> Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).</li><li>Raoult, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+stimulates+the+expression+and+the+release+of+tissue+plasminogen+activator+(tPA)+in+neuronal+cells:+involvement+of+tPA+in+the+neuroprotective+effect+of+PACAP.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP.</a> Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).</li><li>Cameron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical-layer-specific+control+of+neuronal+migration+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).</li><li>Renaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin-A2+and+its+ligand,+Sema6A,+control+nucleus-centrosome+coupling+in+migrating+granule+cells.">Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells.</a> Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).</li><li>Komuro, H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+granule+cell+migration:+a+confocal+microscopic+study+in+acute+cerebellar+slice+preparations.">Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations.</a> Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).</li><li>Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(PACAP)+in+the+postnatal+and+adult+rat+cerebellar+cortex.">Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex.</a> Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).</li><li>Hannibal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+peptide+in+the+rat+central+nervous+system:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).</li><li>Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-type+plasminogen+activator+(tPA)+is+the+main+plasminogen+activator+associated+with+isolated+rat+nerve+growth+cones.">Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones.</a> Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).</li><li>Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+tissue+plasminogen+activator+mRNA+in+the+developing+rat+cerebellum+and+effects+of+inhibiting+tissue+plasminogen+activator+on+granule+cell+migration.">Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration.</a> Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).</li><li>Friedman, G. C., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mRNA+expression+in+granule+neurons+coincides+with+their+migration+in+the+developing+cerebellum.">Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum.</a> Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).</li><li>Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+extracellular+proteases+facilitate+cell+migration,+axonal+growth,+and+pathfinding.">Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding.</a> Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).</li><li>Basham, M. E., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+expression+in+the+neonatal+and+adult+mouse+brain.">Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain.</a> Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).</li><li>Bourgault, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+conformational+determinants+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+(PACAP)+for+activation+of+the+PAC1+receptor.">Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor.</a> Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).</li></ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit la culture des aigus P10 rat tranches de cervelet dans le système Transwell et le marquage fluorescent de GC avec un colorant fluorescent vert pour étudier la migration cellulaire au cours du développement postnatale par macroscopie confocale. Ce protocole permet des observations de la migration des cellules pour une période allant jusqu&#39;à 12 heures et les essais des rôles possibles des facteurs de la migration y compris les agonistes ou antagonistes des neuropeptides, des inhibiteurs d&#39;enzymes, des modulateurs de signalisation cellulaire ou de substances toxiques lors de l&#39;expérience de régulation. Un petit trou dans l&#39;insert de membrane avec une pointe de pipette est nécessaire pour faciliter l&#39;administration de composés dans le milieu d&#39;incubation. Une pointe recourbée pipette fait maison peut être utilisé pour faciliter la livraison de la solution. Une question d&#39;études sur la migration cellulaire sur la vie des tranches de tissu est que les mouvements du tissu lui-même peuvent faire le suivi difficile cellule. Alors que les approches précédentes ont proposé de stabiliser doucement sliCES avec un filet de nylon ou d&#39;une mince couche de queue de rat collagène 7,17, un avantage majeur de cette technologie est le transfert simple et directe d&#39;une plaque de culture de 6 puits contenant tranches de cervelet sur ​​des pièces de membrane de l&#39;incubateur à CO2 sous l&#39;objectif d&#39;un macroscope confocal. Température intégrée et CO 2 contrôleurs fournissent également des paramètres environnementaux appropriés et constants essentielles pour la migration des cellules 9. Par conséquent, les conditions de culture sont conservés pendant les observations et les mouvements de tissus sont minimisées puisque les tranches sont bien fixées à l&#39;insert de membrane. La stabilisation du tissu est contrôlée par suite de la position du ou des bords de tranche des cellules de Purkinje qui doivent être résolus références lors de l&#39;acquisition. En outre, tranches de cervelet (entre 12 et 18) répartis dans les 6 puits de la plaque peuvent être rapidement observées en détail avec une platine motorisée et un zoom optique. En raison de la grande distance de travail (X2, 39 mm) de l&#39;objectif à sec, épi-observation est exempt d&#39;immersion et de l&#39;administration de composés dans le milieu de culture est beaucoup plus facile. Par conséquent, les paramètres environnementaux et les similitudes de soutien de la culture en CO 2 incubateur et confocale macroscopie conduisent à la conservation maximale de l&#39;échantillon biologique. Un autre avantage du protocole est le grand champ de vision et par conséquent le grand nombre de cellules qui peuvent être observées simultanément. Par exemple, nous avons déterminé précédemment que la densité de GC fluorescentes avec migration radiale dans le ML est 1124 ± 138 cellules / mm 2 18. Macroscopie confocale (X2, NA = 0,234) a une résolution latérale inférieure par rapport à la microscopie confocale (40X, NA = 1,25), mais les corps cellulaires de GC peuvent être facilement suivis et la vitesse moyenne de la migration est comparable entre les deux approches technologique 7,18 . Outre l&#39;amélioration technique pour les acquisitions d&#39;image, la qualité des tranches de tissu et ela qualité de l&#39;étiquetage des e sont des points clés pour les expériences réussies. Toujours garder les médias et les tissus sur la glace au cours des processus de dissection, d&#39;éliminer l&#39;huile sur vibratome lames et ne pas utiliser des tranches de tissu en contact avec de la colle. Les coupes sagittales et transversales sont adaptées radiales et la migration tangentielle respectivement. Utiliser différentes longueurs d&#39;incubation approprié pour la détection dans les différentes couches du cortex du cervelet. Temps d&#39;incubation longs (jusqu&#39;à 8 heures) sont nécessaires pour détecter la migration de nombreux GC dans le PCL et l&#39;IGL. Depuis la migration de GC est un processus physiologique pendant des fenêtres spatio-temporels spécifiques, le contrôle positif est que les cellules doivent migrer correctement. En particulier, de nombreux GC broche dans le ML est l&#39;un des principaux indicateurs de santé pour les tranches sagittales du cervelet. Pour le démarrage des expériences, l&#39;observation des mouvements de GC dans le ML est suggéré. En effet, la forme de GC avec le corps cellulaire allongé verticalement doit être considérée comme un point de commencer ac de référencequisition avec commande successive (2 heures) et de traitement (2 h) les périodes qui peuvent être facilement effectuées dans le ML. Les colorants fluorescents comme la famille Cell Tracker ou des protéines fluorescentes exprimées à travers des constructions génétiques peuvent être utilisés comme traceurs pour les études de migration cellulaire. En raison de la cinétique lente de la migration de GC (1 pile toutes les 30 min), des expériences multicolores peuvent également être effectuées en mode séquentiel depuis 4 lasers faisceaux (405, 488, 532 et 633 nm) sont disponibles sur le système. Considérant la migration radiale centripète et centrifuge, suivi d&#39;autres interneurones peut également être réalisée 18. En particulier, de nombreux types de cellules et moins peuvent être plus facilement localisées avec un grand champ de vision. Enfin, ce protocole peut être utilisé pour étudier la migration cellulaire à d&#39;autres stades du développement cérébelleux mais aussi d&#39;autres zones du cerveau.

Dans le cervelet développement, huit différents types de neurones sont produits de façon séquentielle entre la deuxième semaine embryonnaire et la deuxième semaine post-natale chez les rongeurs 1. Originaire initialement à partir, une zone germinative primaire, cellules granulaires immatures (GC) sont les derniers à être neurones produits à partir de la couche externe granulaire (EGL), une zone germinative secondaire 2. Pendant les trois premières semaines après la naissance, le cortex cérébelleux est une structure feuilletée organisée en quatre couches comprenant la EGL, la couche moléculaire (ML), la couche de Purkinje de cellule (PCL) et la couche granulaire interne (IGL) (figure 1). Grâce à la migration centripète, immature GC, interneurones glutamatergiques, atteindre l&#39;IGL un délai d&#39;environ deux jours. À la troisième semaine postnatale, l&#39;EGL disparaît et l&#39;IGL constitue ce qu&#39;on appelle la couche granulaire (GL) dans le cervelet adulte. Dans le GL, GC recevoir entrées synaptiques excitateurs de fibres moussues et les cellules de la brosse unipolaires, etentrées synaptiques inhibitrices de axones des cellules de Golgi. Dans le ML, les axones du GC font synapses excitatrices avec neurones GABAergiques, y compris les cellules de Purkinje, les cellules, les cellules étoilées du panier, et des cellules de Golgi 2. L&#39;observation en temps réel du mouvement de cellule dans tranches de cervelet aiguës obtenues à partir de rongeurs postnatales démontre que GC modifient leur forme de façon concomitante avec des changements dans les modalités et la vitesse de migration au cours de leur parcours dans le cortex cérébelleux 3. Au cours des deux premières semaines après la naissance, précurseurs GC prolifèrent activement au sommet de l&#39;EGL. Dans la partie médiane de l&#39;EGL, postmitotique GC migrer tangentiellement dans le sens de leur processus plus large. A la frontière EGL-ML, GC ralentir leur mouvement, les cellules commencent à entrer dans un processus verticale courte descendante dans le ML. Dans le ML, GC ont un corps cellulaire allongé verticalement, un processus de fuite mince et un processus conduisant plus volumineux, et de migrer radialement le long des fibres gliales Bergmann. Dans lePCL, GC arrêter leur mouvement mais après une phase stationnaire prolongée (2 heures), ils traversent la frontière PCL-IGL. Dans l&#39;IGL, GC migrent vers le fond de la couche en l&#39;absence de support de fibres gliales. Une fois les conseils du processus menant approcher la frontière affaire IGL-blanc (WM), GC lente et cesser leur mouvement. Les sections transversales du cervelet sont préférés pour l&#39;étude des migrations tangentielles dans le EGL tout coupes sagittales sont dédiés à la migration radiale dans le ML, PCL et IGL. Certains facteurs de régulation des mouvements de GC, y compris neuropeptides (par exemple, la somatostatine, PACAP) ont été identifiés à ce jour, mais les mécanismes complets impliqués dans le contrôle spatio-temporel de la migration de GC dans chaque couche corticale sont encore largement inconnus 1,4,5,6. migration de GC a été étudié au cours des 20 dernières années par le biais de vidéos et de microscopie confocale en utilisant un éclairage la lumière soit transmis pour cellules cultivées isolées ou détection de fluorescence pour acutranches cérébelleuses Te. Dil Initialement lipophiles, et plus récemment &quot;cellule Tracker&quot; colorants et des protéines fluorescentes exprimé cellules ont été utilisées pour confocale ou microscopie à deux photons 7,8. Des expériences réussies dépendent d&#39;un certain nombre de procédures spécifiques qui rendent le protocole simple mais pas facile. En particulier, des tranches aiguës doivent être stabilisés au cours des observations généralement avec un nylon réseau maillé fait maison 9. L&#39;intensité de l&#39;éclairage la lumière doit être aussi faible que possible pour éviter la phototoxicité et photoblanchiment tel que proposé par balayage multipoint approche microscope confocal. En outre, la température et le CO 2 sont des paramètres environnementaux clés depuis l&#39;instabilité peuvent affecter la migration neuronale. Pour faciliter et affiner les procédures expérimentales, nous avons développé un protocole macroscopie confocale qui limite les mouvements de tranche, assure paramètres environnementaux constants, réduit photoblanchiment, augmente le champ de vision (de l&#39;ordre de millimètres) et consequremment le nombre de cellules (des dizaines) qui peuvent être suivis grâce à l&#39;analyse d&#39;image. Ainsi, 180 um tranches épaisses sont mises en culture sur des inserts à membranes, et des plaques à 6 puits sont directement transférés sous un objectif motorisé 2X d&#39;un macroscope confocal commercial équipé d&#39;un grand incubation chambre, la température et le CO 2 contrôleurs et un système de commande de vibration. Temps-déchéances et z-piles sont ensuite effectuées sur plusieurs heures et des outils pharmacologiques ou des molécules bioactives peuvent être ajoutés ou livrés dans le milieu d&#39;incubation. Cette méthode peut également être adapté pour étudier la migration des autres types de neurones dans le cerveau cervelet ou à différents stades de développement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACAP38</td>
			<td>INRS, Canada</td>
			<td></td>
			<td>Bourgault et al., 200919</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAI-1</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>528208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td>
			<td>O973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester Transwell-Clear inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 35 mm diameter</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100 mm diameter</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>130182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylen tube (15 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>E/0800DF/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biological safety cabinet fume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MSC9 Class II A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adjustable-volume pipette (0,5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gyro-rocker, SSL3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator, Hera Cell 150</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibrating blade microtome, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal macroscope, TCS LSI</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controller</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope, M205 C</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors, curved, blunt/blunt</td>
			<td>Medicon</td>
			<td>03.03.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp</td>
			<td>FST</td>
			<td>149090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 and #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11293-00 and 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome injector blades/single edge</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>39053250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard scalpel handle #3 solid</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical blade #15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of postnatal cerebellar granule cell migration using confocal macroscopy

Au cours du développement postnatal, les cellules granulaires immatures (interneurones excitateurs) présentent une migration tangentielle dans la couche granulaire externe, et ensuite la migration radiale dans la couche moléculaire et la couche de cellules de Purkinje pour atteindre la couche granulaire interne du cortex cérébelleux. Par défaut dans les processus migratoires induit soit la mort cellulaire ou à la mauvaise des neurones, conduisant à des déficits dans diverses fonctions du cervelet. La migration de cellules granulaires centripète implique plusieurs mécanismes, tels que la chimiotaxie et la dégradation de la matrice extracellulaire, pour guider les cellules vers leur position finale, mais les facteurs qui régulent la migration cellulaire dans chaque couche corticale ne sont que partiellement connu. Dans notre procédé, des tranches cérébelleuses aigus sont préparés à partir P10 rats, les cellules granulaires sont marqués avec un marqueur cytoplasmique fluorescent et les tissus sont mis en culture sur des inserts à membranes de 4 à 10 heures avant de commencer la surveillance en temps réel de la migration cellulaire par macroscopie confocale à 37 ° C dans leprésence de CO 2. Au cours de leur migration dans les différentes couches corticales du cervelet, les cellules granulaires peuvent être exposés à des agonistes de neuropeptides ou antagonistes, inhibiteurs de la protéase, inhibiteurs d&#39;effecteurs intracellulaires ou même des substances toxiques comme l&#39;alcool ou le méthylmercure pour enquêter sur leur rôle possible dans la régulation de la migration neuronale .

Dans le cervelet postnatale précoce, GC présentent d&#39;importants changements dans leur mode et de la vitesse de la migration comme ils traversent différentes couches corticales 1 (figure 1). Cet article donne des exemples de résultats qui peuvent être obtenus par l&#39;étude de la migration de GC dans leur milieu naturel cellulaire. P10 rat des tranches de tissu cérébelleux marqués avec un colorant fluorescent vert sont examinés sous un macroscope confocal (figure 3A) et nous montrent que GC migrer radialement dans le ML avec une vitesse moyenne de 18 um / h (figure 3B, C). À ce jour, le rôle des interactions / communications entre les cellules neuronales et gliales y compris les facteurs réglementaires et des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la migration cellulaire dans chaque couche corticale sont en grande partie inconnus. Par conséquent, la question principale est d&#39;identifier les neuropeptides, les neurotransmetteurs, neurotrophines et des composants de la matrice extracellulaire qui pourraient jouer un rôle dans ces corticale couche spécifiquechangements fic de la vitesse au cours de leur processus de migration. Hypophysaire adénylate cyclase polypeptide activateur (PACAP) est détectée principalement dans la PCL, mais également dans le ML et le IGL pendant les deux premières semaines après la naissance chez les rongeurs 7,10,11. Application de PACAP38 (10 -6 M) dans le milieu de culture a entraîné une diminution de la vitesse de 79% de la GC dans la ML. Par exemple, la vitesse de migration de GC dans le ML est passé de 11,9 um / h dans des conditions de contrôle à 2,5 um / h après l&#39;administration de PACAP38 (figure 4A). l&#39;activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) est un membre de la cascade protéolytique conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire des composants (EM), tels que des molécules d&#39;adhésion cellulaire ou de la laminine 12,13. tPA et le plasminogène, un substrat de tPA, sont détectées dans les couches corticales pendant le développement du cervelet 14,15,16 postnatal. L&#39;administration de PAI-1 (10 -7 M), un inhibiteur endogène de tPA, réduit de 78% le GCla migration dans le ML. Par exemple, GC réduit la vitesse de migration dans le ML de 19,2 um / h dans des conditions de contrôle à 4,2 um / h après l&#39;addition de PAI-1 (figure 4B). Ces résultats indiquent que PACAP exerce un effet inhibiteur direct sur les mouvements de GC et que la serine protease de tPA facilite la migration de GC dans la ML du cervelet de rat en développement. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figure 1: représentation 3D de la migration de GC dans le cortex cérébelleux postnatale. 1-4, Extension du processus de GC et de la migration tangentielle dans le EGL. 5, la migration radiale dans le ML long des fibres gliales Bergmann. 6, phase stationnaire transitoire dans le PCL. 7, la migration des cellules gliales indépendante radiale dans le IGL. 8, achèvement de migration de GC GC dans la IGL, de cellules granulaires, en rouge;. EGL, La couche granulaire externe; B, Bergmann glie, en violet foncé; G, cellule de Golgi, en jaune; cf, fibres grimpantes, en bleu; g, cellules granulaires postmigratory, en vert clair; IGL, couche granulaire interne; mft, fibres moussues terminal, en vert foncé; ML, couche moléculaire; P, cellule de Purkinje, en violet clair; couche de cellules PCL, Purkinje. Ce chiffre a été modifié depuis 5. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figure 2: Ex vivo culture de P10 tranches de cervelet (A) cervelet disséqués à partir P10 rat.. Barre d&#39;échelle = 6 mm. (B) La photographie de la vie de 180 um d&#39;épaisseur tranche cérébelleuse travers stéréomicroscopie. Barre d&#39;échelle = 3 mm. (C) Aun plus fort grossissement, les quatre couches corticales (EGL, ML, PCL, IGL) du cervelet sont déjà distinguées. Barre d&#39;échelle = 1 mm. (D) Après marquage fluorescent, des coupes de tissu sont placés sur des inserts de culture (diamètre 24 mm) dans une plaque à 6 puits. (E) de la représentation schématique d&#39;un insert de culture avec la membrane de polyester culture de tissu traité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figure 3: la migration dynamique de GC dans les couches corticales du P10 de rat cervelet (A) Vue Macroconfocal (xyz, de projection 2D) d&#39;une tranche P10 cérébelleux de rat dans lequel GC sont marqués avec un colorant fluorescent cytoplasmique verte.. La barre d&#39;échelle = 75 um. (B) d&#39;imagerie time-lapse montrant GCles mouvements dans le ML par macroscopie confocale pour 4 heures dans des conditions de contrôle. Asterisk symbole (*) marque le soma GC. Temps écoulé (en minutes) est indiqué en bas de chaque photomicrographie. La barre d&#39;échelle = 10 um. (C) des changements séquentiels dans la distance parcourue par GC soma. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figure 4:. Effet de l&#39;inhibiteur de neuropeptide et protease de la migration de GC (A) GC a été suivi dans la ML par macroscopie confocale pendant 2 heures dans des conditions de contrôle et ensuite pendant 2 heures en présence d&#39;un polypeptide adénylate-activation de l&#39;hypophyse adénylate (PACAP). (B) GC a été suivi dans la ML par macroscopie confocale pendant 2 heures dans des conditions de contrôle et ensuite pendant 2 heures en présence d&#39;inhibiteur de l&#39;activateur du plasminogène-1 (PAI-1).

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Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

ex-vivo-imaging-postnatal-cerebellar-granule-cell-migration-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

9.3K vues.  Inserm, IRIB, University of Rouen. During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Vidéo: Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un test organotypique à haute résolution imagerie time-lapse de la migration neuronale dans le cerveau postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Recherche

Neurosciences

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo d&#39;imagerie en temps réel de simples divisions cellulaires dans neuroépithélium de souris

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Souris Rhombencéphale<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour étudier les migrations visage Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Déplétion sélective des cellules microgliales du cervelet granules de cultures cellulaires utilisant la L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Évaluation de la viabilité neuronale à l&#39;aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.