Nous reconnaissons l&#39;appui financier de l&#39;attribution NSF CMMI-1000724.

1A. Formation primaire monocouche sur silicium <ol><li> Couper en tranches de silicium de 1 cm 2 substrats, la poussière et rincer à l&#39;eau et l&#39;éthanol filtré. </li><li> Retirez la contamination organique en submergeant les substrats de silicium dans un plat en verre contenant Nano bande à 75 º C. Après 15 minutes, rincer chaque substrat avec déminéralisée, eau filtrée. </li><li> Placez chaque substrat dans une solution à 5% HF (Attention: HF est un matériau extrêmement dangereux) pour enlever la couche d&#39;oxyde natif. Après 5 minutes à sec du silicium sans oxyde d&#39;azote </li><li> Pour produire un substrat chlorés, immédiatement plonger chaque morceau sans oxyde de silicium dans un flacon à scintillation contenant 2 ml d&#39;eau saturée PCl 5 dans le chlorobenzène. Cette solution doit être filtrée à 0,2 um. </li><li> Assemblez un condenseur flacon sur le dessus de chaque flacon et les placer dans un heatblock ensemble à 112 ° C pendant une heure. </li><li> Après la réaction est terminée, laissez refroidir et rincer les flacons de chaque surfaCE avec le chlorobenzène et le sèche sous azote filtré. </li><li> Pour former un substrat propényl-termine, place chaque surface de silicium chlorés dans un flacon sous pression contenant 4 ml de chlorure de magnésium propényle. Placer chaque flacon de pression dans un heatblock à 130 ° C pendant 24 heures. </li><li> Prenez chaque flacon la pression de la heatblock et laisser refroidir. </li><li> Rincez chaque surface rapidement avec DCM et de l&#39;éthanol et sèche sous azote filtré. </li></ol> 1B. Formation monocouche primaire sur Germanium <ol><li> Couper plaquette de germanium dans les substrats de 1cm2, la poussière et rincer à l&#39;eau et l&#39;éthanol filtré. </li><li> Retirez la contamination organique en submergeant les surfaces dans un plat en verre contenant l&#39;acétone pendant 20 minutes </li><li> Placez chaque surface dans une solution de HCl à 10% pendant 15 minutes. Ce procédé élimine simultanément la couche d&#39;oxyde natif et chlore à la surface. Après 5 minutes sécher les substrats à l&#39;azote. </li><li> Pour former un substrat octyl-fin, l&#39;APLCE de chaque surface de germanium chlorés dans un flacon sous pression contenant 4 ml de chlorure de magnésium octyle (2 mM). Placer chaque flacon de pression dans un heatblock à 130 ° C pendant 48 heures. </li><li> Prenez chaque flacon la pression de la heatblock et laisser refroidir à température ambiante. </li><li> Rincez chaque surface rapidement avec DCM et de l&#39;éthanol et sèche sous azote filtré. </li></ol> 2. La fonctionnalisation du substrat de la NHS au silicium et de germanium <ol><li> Préparer une filtrée à 0,1 M NHS diazirine solution dans le tétrachlorure de carbone. Attention: Gardez exposition à la lumière à un minimum. </li><li> Pipet quelques gouttes de la solution sur les surfaces à terminaison méthyle. Laisser la solution se répandre à travers toute la surface. </li><li> Placez les surfaces sous une lampe UV (254 nm = ☐, 4400/cm2 à 0,74 pouces). Laisser les surfaces à réagir sous la lumière UV pendant 30 minutes, puis ajouter plus de NHS-diazirine à la surface et laisser la réaction se développer pendant 30 minutes supplémentaires. </li><li> Rincer le NHS modifiées surfaces avec DCM et de l&#39;éthanol et sèche sous azote filtré. </li></ol> 3. La fonctionnalisation de petites molécules <ol><li> Réagir NHS modifiés substrats dans un 20 mM de tert-butyle carbamoyle (Boc-) solution éthylènediamine dans du dichlorométhane (DCM) pour deux heures à température ambiante. </li><li> Après la réaction, rincer le substrat Boc-modifié avec DCM et de l&#39;éthanol. </li><li> Déprotéger le substrat Boc modifié en utilisant 25% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) dans le DCM pendant une heure à température ambiante. </li><li> Rincer la surface résultante avec du DCM, l&#39;éthanol et 10% (p / v) de bicarbonate de potassium dans l&#39;eau et sécher sous azote filtré. </li><li> Analyser toutes les surfaces par XPS pour déterminer la composition élémentaire. </li></ol> 4. Acides polyuréthane acrylate de timbre (PUA) Préparation <ol><li> Diluer l&#39;acrylate A par 30% avec B triacrylate de triméthylolpropane éthoxylé pour réduire la viscosité. Ajouter photo-initiateurs C et D au mélange réactionnel (Fig.Ure 6). </li><li> Ajouter de sodium 2-mercaptoethanesulfonate (0,2 g, 1,22 mmol) à une solution HCl 4N dans le dioxane (10 ml) et agiter à température ambiante pendant 2 minutes. </li><li> Filtrer le chlorure de sodium d&#39;abord à travers un filtre de verre fin, puis à travers une seringue 0,2 μ m membrane en PTFE filtre pour donner une solution claire de l&#39;acide 2-mercaptoethanesulfonic dans le dioxane. </li><li> Evaporer le dioxane sous pression réduite </li><li> Réagir l&#39;acide sulfonique résultant avec 2 ml de mélange de polyuréthane-acrylate prépolymère à température ambiante puis sous vide à 50 ° C. Soyez sûr de complètement libre le mélange de bulles d&#39;air piégées. </li><li> Refroidir la solution obtenue à température ambiante et polymérisation entre deux lames de microscope en verre ou une lame de verre et d&#39;une maîtrise par l&#39;exposition aux rayons UV pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Après polymérisation, détachez soigneusement le timbre hors du maître et laver le timbre à l&#39;éthanol et l&#39;eau et sécher avec nitroge filtréen. </li></ol> 5. Impression catalytique et SEM / AFM Analyse <ol><li> Placez le correspondant de polyuréthane-acrylate de timbre sur le dessus du substrat NHS modifiés à la température ambiante pendant une minute sans charge externe pour les tenir ensemble. </li><li> Après la réaction, séparer le timbre et le substrat. </li><li> Rincez le substrat avec de l&#39;éthanol, l&#39;eau et l&#39;éthanol puis sécher à l&#39;azote filtré. </li><li> Rincez le timbre avec l&#39;éthanol, l&#39;eau et l&#39;éthanol puis sécher à l&#39;azote filtré. </li><li> Gardez des timbres à la température ambiante avant l&#39;application suivante. </li><li> Analyser le modèle produit en utilisant le mode de contact microsopy latéraux à force atomique (AFM) et microscopie électronique à balayage (MEB) </li></ol> 6. La modélisation des protéines et de microscopie à fluorescence <ol><li> Immerger le substrat NHS motifs bifonctionnels en lysine-N, N-diacétique (20 mM) et Et3N (100 mM) dans du DMF: H20 (1:1) à température ambiante pendant 1 heure puis rincé avecl&#39;eau et l&#39;éthanol. </li><li> Incuber les substrats dans une solution de 50 mM NiSO4 pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Rincez les substrats chélatés abondamment à l&#39;eau et de tampon de liaison (20 NaP mM, 250 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7,5) et plonger dans une solution de GFP filtré (M ~ μ 40) pendant 1 heure à 0 ° C. </li><li> Immédiatement rincer les substrats avec tampon de liaison suivie par PBS (pH 7,4). </li><li> Gardez substrats hydratés dans du PBS à 0 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour l&#39;analyse de microscopie par fluorescence. </li></ol> 7. La modélisation des protéines et de microscopie à fluorescence <ol><li> Immerger le substrat NHS motifs bifonctionnels en lysine-N, N-diacétique (20 mM) et Et3N (100 mM) dans du DMF: H 2 0 (1:1) à température ambiante pendant 1 heure puis on rince avec de l&#39;eau et l&#39;éthanol. </li><li> Incuber les substrats dans un 50 mM NiSO 4 solution pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Rincez les substrats chélatés trop wl&#39;eau et des vec tampon de liaison (20 NaP mM, 250 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7,5) et plonger dans une solution de GFP filtré (~ 40 pM) pendant 1 heure à 0 ° C. </li><li> Immédiatement rincer les substrats avec tampon de liaison suivie par PBS (pH 7,4). </li><li> Gardez substrats hydratés dans du PBS à 0 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient prêts pour l&#39;analyse de microscopie par fluorescence. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Un exemple de soft-lithographiques patterning nano catalytique est montré dans la figure 7. L&#39;approche crée des modèles sur le chimiosélective sans oxyde de silicium et de germanium, qui peuvent être fonctionnalisés avec orthogonalement chimiques dissemblables et des groupements biologiques. La réaction entre le substrat NHS functioanlized et le cachet de catalyseur à motifs conduit à l&#39;hydrolyse des fractions du NHS dans les zones de contact conforme, produisant un motif bifonctionnel portant substrat régions du NHS activé et les acides carboxyliques libres. En raison de la diffusions nature libre de notre méthode, nous obtenons la résolution proche de celle de la photolithographie. Par exemple, la figure 7 montre les caractéristiques 125 nm, qui ont été uniformément reproduit à travers la surface entière substrat de silicium. Remarquablement, le timbre de catalyseur peuvent être réutilisés plusieurs fois sans perte d&#39;efficacité. Fonctionnalisation chimiosélective de semi-conducteurs à motifs avec des biomolécules ouvre la perspective de l&#39;intégration de matériaux traditionnels électronique avec très sélective des substrats biologiques pour des applications dans la détection, de diagnostic et d&#39;analyse des domaines de recherche. Un exemple de fonctionnalisation est montré dans la figure 8, où NHS motifs de silicium a été sélectivement fonctionnalisées avec des molécules de protéines. En exploitant les réactivités différentiel de activées et les acides carboxyliques libres, nous avons d&#39;abord fixé à terminaison acide nitrilotriacétique (NTA) linkers hétérobifonctionnels pour les régions du NHS-fonctionnalisés, puis utilisé le résultatNTA-modelé la surface comme un modèle pour la fixation sélective de l&#39;hexa-histidine-taggés GFP. Figure 8b montre clairement l&#39;intensité de fluorescence différentielle entre la GFP modifiée et hydrolysé de régions exemptes d&#39;acides carboxyliques. La taille et la forme des fonctions répliquées sont compatibles entre les deux motifs de surface du NHS (figure 8a) et GFP modifiée de surface (Figure 8b), confirmant la remarquable stabilité du carbone passivé surfaces et la sélectivité de l&#39;approche d&#39;emboutissage. Le protocole n&#39;est pas limité à son-protéine marquée, et peut être utilisé pour des biomolécules autre motif, y compris l&#39;ADN et des anticorps. <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma général représentant l&#39;impression par microcontact catalytique <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Structure des bi-couches msystème de olecular sur Ge et Si. Primaire monocouche alkyle formes stables de Ge-C ou Si-C des liens avec le substrat et fournit un système chimiquement inerte et fermer emballé qui protège la surface sous-jacente de la dégradation. (B) de surcouche secondaire forme des liaisons CC stable avec couche protectrice primaire et fournit fonctionnel terminal des groupes <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Schémas de réaction représentant la formation de monocouches primaires de protection sur Si (A) et Ge (B) <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Fonctionnalisation chimique de la monocouche de protection primaire avec un donateur carbène hétérobifonctionnels <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Le schéma réactionnel Figure 5. Démontrant modifications à petite molécule de NHS-fonctionnalisés sousdémontre et les spectres correspondants XPS <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Composition du catalyseur pré-polymères du mélange, les conditions de polymérisation, et les images au MEB de l&#39;acide sulfonique motifs modifiés de timbre et de la correspondante de PMMA-Si maître <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Figure 7. SEM et des images de friction AFM de SAM calqué sur Si et Ge avec un timbre acides <img src="/files/ftp_upload/3478/3478fig8.jpg" alt="Figure 8"/> Figure 8 Soft-lithographie structuration et la fonctionnalisation de silicium passivé avec des molécules organiques et biologiques a:.. L&#39;image SEM de la NHS motifs modifiés substrat B:. Micrographie fluorescentes de la GFP modifiées substrat.

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P., Rothuizen, H., Schmid, H., Schmidt-Winkel, P., Stutz, R., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+meets+lithography:+Soft+approaches+to+high-resolution+printing.">Printing meets lithography: Soft approaches to high-resolution printing.</a> IBM Journal of Research and Development. 45 (5), 697-719 (2001).</li><li>Libioulle, L., Bietsch, A., Schmid, H., Michel, B., Delamarche, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Inking+Stamps+for+Microcontact+Printing+of+Alkanethiols+on+Gold.">Contact-Inking Stamps for Microcontact Printing of Alkanethiols on Gold.</a> Langmuir. 15 (2), 300-304 (1999).</li><li>Sharpe, R. B. A., Burdinski, D., Huskens, J., Zandvliet, H. J. W., Reinhoudt, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft-Lithographic+Approach+to+Functionalization+and+Nanopatterning+Oxide-Free+Silicon.">Soft-Lithographic Approach to Functionalization and Nanopatterning Oxide-Free Silicon.</a> Langmuir. 27 (10), 6478-6485 (2011).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à divulguer

Le protocole présenté est une forme ou d&#39;impression par microcontact inkless qui peut être universellement appliqué à n&#39;importe quel substrat capable de supporter simples bien ordonnée monocouches. Dans cette méthode, un timbre-catalyseur immobilisé transfère un motif à une surface d&#39;appui correspondante des groupes fonctionnels. Parce que le processus ne repose pas sur le transfert d&#39;encre de tampon à la surface de la limitation de résolution diffusif de μCP traditionnelle et réactive est évité, ce qui permet de fabrication de routine d&#39;objets nanométriques. L&#39;incorporation d&#39;un primaire hautement ordonnée système moléculaire offre une protection complète du semi-conducteur sous-jacent de dommages d&#39;oxydation. Dans le même temps, la méthode prend en charge l&#39;immobilisation des encombrants groupes réactifs en utilisant une surcouche secondaires réactive; ainsi le système réalise à la fois de protection et de fonctionnalisation. La technique commence avec la formation d&#39;stables de carbone de la surface des liens permettant chimiquement inerte Primarmonocouche y qui sert une barrière efficace à la formation d&#39;oxyde. Formation d&#39;une surcouche du secondaire fournit des groupes terminaux réactifs NHS fonctionnelles qui servent de points d&#39;attache pour une variété de groupements chimiques et biologiques. Cette stabilité du système à deux couches moléculaires est ensuite modelé en utilisant notre approche μCP catalytique. L&#39;approche présentée dans cette étude propose une méthode générale pour la structuration des substrats semiconducteurs avec une large gamme de matériaux organiques et biologiques. La possibilité de créer à motifs organiques semi-conducteurs interfaces sans coûteux, une instrumentation complexe offre de nombreuses opportunités dans des domaines tels que l&#39;électronique, les nanotechnologies, la biochimie et la biophysique.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société / modèle </th></tr><tr><td> XPS spectromètre de </td><td> Axe Kratos Ultra </td></tr><tr><td> Microscope à force atomique </td><td> Veeco D3100 </td></tr><tr><td> SEM-FEG microscope </td><td> FEI XL30 </td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss Axio Imager </td></tr><tr><td> Heatblock </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Pompe à vide </td><td> BOC Edwards </td></tr><tr><td> Système de purification d&#39;eau </td><td> Millipore </td></tr><tr><td> TESP sondes de silicium </td><td> Veeco </td></tr><tr><td> Silicon </td><td></td></tr><tr><td> Flacons de pression </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> Collecteur à vide </td><td> Chemglass </td></tr><tr><td> Lampe UV </td><td> UVP </td></tr><tr><td> Matériau de l&#39;encreur </td><td> Voir les références 20 et 18 </td></tr><tr><td> Filtres seringues PTFE </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Nano bande </td><td> Cyantek </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> L&#39;acétone </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> HF </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Chlorobenzène </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> PCl5 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium Propényl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium Octyl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Le tétrachlorure de carbone </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Boc éthylènediamine protégée </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Sodium 2-mercaptoethanesulfonate </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> HCl 4N dans le dioxane solution </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> La lysine-N, N-diacétique </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Et 3 N </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NiSO 4 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NaP </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> imidazole </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Sigma </td></tr></tbody></table>

soft lithographic functionalization and patterning oxide-free silicon and germanium

Le développement de dispositifs électroniques hybrides repose en grande partie sur l&#39;intégration de (bio) matériaux organiques et inorganiques semi-conducteurs grâce à une interface stable qui permet le transport d&#39;électrons efficace et protège les supports sous-jacents de la dégradation oxydative. Groupe semi-conducteurs IV peuvent être efficacement protégés par hautement ordonné monocouches auto-assemblées (SAM) composé de simples chaînes alkyle qui agissent comme des barrières imperméables à la fois des solutions organiques et aqueuses. Simple SAM alkyle, cependant, sont inertes et ne se prêtent pas aux techniques de dessin traditionnelles. La motivation pour immobiliser des systèmes moléculaires organiques de semi-conducteurs est de conférer de nouvelles fonctionnalités à la surface qui peuvent fournir des fonctions optiques, électroniques et mécaniques, ainsi que l&#39;activité chimique et biologique. Impression par microcontact (CP μ) est une technique douce-lithographique pour SAM patterning sur des surfaces multiples. 1-9 Malgré sa simplicity et la polyvalence, l&#39;approche a été largement limitée à des surfaces de métaux nobles et n&#39;a pas été bien développés pour le transfert de motif à des substrats technologiquement importants comme l&#39;oxyde sans silicium et de germanium. Par ailleurs, parce que cette technique repose sur la diffusion d&#39;encre pour transfert de motif de l&#39;élastomère sur le substrat, la résolution de l&#39;impression traditionnelle est essentiellement limitée à près de 1 m. 10 à 16 μ Contrairement à l&#39;impression traditionnelle, sans encre patterning CP μ repose sur une réaction spécifique entre une surface immobilisée substrat et un catalyseur de timbre lié. Parce que la technique ne repose pas sur la formation SAM diffusif, elle élargit considérablement la diversité des surfaces patternable. En outre, la technique sans encre évite les limitations de taille imposées par fonction de diffusion moléculaire, facilitant la réplication des caractéristiques très petites entreprises (&lt;200 nm). 17-23 Toutefois, jusqu&#39;à présent, μ inkless CP a été principalement utilisé pour la modélisation des systèmes moléculaires relativement désordonnée, qui ne protègent pas les surfaces sous-jacentes de la dégradation. Ici, nous rapportons un simple, fiable à haut débit méthode pour patterning passivé silicium et de germanium avec des monocouches organiques réactifs et de démontrer la fonctionnalisation sélective des substrats à motifs à la fois avec des petites molécules et des protéines. La technique utilise un préformé NHS-réactive le système à deux couches d&#39;oxyde sans silicium et de germanium. La fraction du NHS est hydrolysée de manière schéma-spécifique avec un acide sulfonique modifiés timbre acrylate pour produire des motifs chimiquement distinctes du NHS activé et les acides carboxyliques libres. Une limitation importante à la résolution de nombreuses techniques de CP μ est l&#39;utilisation de matériel de PDMS qui manque la rigidité mécanique nécessaire à la fidélité de transfert élevés. Pour remédier à cette limitation nous avons utilisé un polyuréthane polymère d&#39;acrylate, un matériau relativement rigide qui peut êtrefacilement fonctionnalisés avec différentes fractions organiques. Notre approche patterning protège complètement la fois de silicium et de germanium de l&#39;oxydation chimique, permet un contrôle précis sur la forme et la taille des motifs caractéristiques, et donne accès à des modèles chimiquement discrimination qui peuvent encore être fonctionnalisés avec des molécules organiques et biologiques. L&#39;approche est générale et applicable à d&#39;autres surfaces technologiquement pertinents.

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Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Nous décrivons ici une méthode simple pour la modélisation sans oxyde de silicium et de germanium fonctionnalisation avec des monocouches organiques réactifs et de démontrer des substrats à motifs avec des petites molécules et des protéines. L&#39;approche protège complètement les surfaces de l&#39;oxydation chimique, fournit un contrôle précis de la morphologie caractéristique, et fournit un accès facile à des modèles chimiquement discriminés.

La fonctionnalisation douce lithographiques et les motifs sans oxyde silicium et de germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K vues.  Duke University. Nous décrivons ici une méthode simple pour la modélisation sans oxyde de silicium et de germanium fonctionnalisation avec des monocouches organiques réactifs et de démontrer des substrats à motifs avec des petites molécules et des protéines. L'approche protège complètement les surfaces de l'oxydation chimique, fournit un contrôle précis de la morphologie caractéristique, et fournit un accès facile à des modèles chimiquement discriminés.

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

À haut débit la synthèse des glucides et fonctionnalisation de nanoparticules polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Mou procédure lithographique de production plastique microfluidiques avec vue-ports Transparent à la lumière Visible et infrarouge

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Conception de silicium poreux Films comme porteurs du facteur de croissance nerveuse

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Bioinspired Soft Robot with Incorporated Microelectrodes

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics paradigm, especially in biomedical research. Recreating artificial life-like actuation dynamics is crucial for a soft-robotic system. However, the precise control and tuning of actuation behavior still represents one of the main challenges of modern soft robotic systems. This method describes a low-cost, highly scalable, and easy-to-use procedure to fabricate an electrically controllable soft robot with life-like movements that is activated and controlled by the contraction of cardiac muscle tissue on a micropatterned sting ray-like hydrogel scaffold. The use of soft photolithography methods makes it possible to successfully integrate multiple components in the soft robotic system, including micropatterned hydrogel-based scaffolds with carbon nanotubes (CNTs) embedded gelatin methacryloyl (CNT-GelMA), poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA), flexible gold (Au) microelectrodes, and cardiac muscle tissue. In particular, the hydrogels alignment and micropattern are designed to mimic the muscle and cartilage structure of the sting ray. The electrically conductive CNT-GelMA hydrogel acts as a cell scaffold that improves the maturation and contraction behavior of cardiomyocytes, while the mechanically robust PEGDA hydrogel provides structural cartilage-like support to the whole soft robot. To overcome the hard and brittle nature of metal-based microelectrodes, we designed a serpentine pattern that has high flexibility and can avoid hampering the beating dynamics of cardiomyocytes. The incorporated flexible Au microelectrodes provide electrical stimulation across the soft robot, making it easier to control the contraction behavior of cardiac tissue.

A bioinspired scaffold is fabricated by a soft photolithography technique using mechanically robust and electrically conductive hydrogels. The micropatterned hydrogels provide directional cardiomyocyte cell alignment, resulting in a tailored direction of actuation. Flexible microelectrodes are also integrated into the scaffold to bring electrical controllability for a self-actuating cardiac tissue.

Robot doux bioinspiré avec microélectrodes incorporées

Bioinspired soft robotic systems that mimic living organisms using engineered muscle tissue and biomaterials are revolutionizing the current biorobotics ...

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These cell-silicon hybrids offer leadless optical modulation capabilities with minimal perturbation to normal cell behavior. The optical capabilities are obtained by the photothermal and photoelectric properties of SiNWs. These hybrids can be harvested using standard tissue culture techniques and then applied to different biological scenarios. We demonstrate here how these hybrids can be used to study the electrical coupling of cardiac cells and compare how myofibroblasts couple to one another or to cardiomyocytes. This process can be accomplished without special equipment beyond a fluorescent microscope with coupled laser line. Also shown is the use of a custom-built MATLAB routine that allows the quantification of calcium propagation within and between the different cells in the culture. Myofibroblasts are shown to have a slower electrical response than that of cardiomyocytes. Moreover, the myofibroblast intercellular propagation shows slightly slower, though comparable velocities to their intracellular velocities, suggesting passive propagation through gap junctions or nanotubes. This technique is highly adaptable and can be easily applied to other cellular arenas, for in vitro as well as in vivo or ex vivo investigations.

This protocol describes the use of silicon nanowires for intracellular optical bio-modulation of cell in a simple and easy to perform method. The technique is highly adaptable to diverse cell types and can be used for in vitro as well as in vivo applications.

Nanofils de silicium et stimulation optique pour les études de couplage électrique intra- et intercellulaire

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Modélisation simple, abordable et modulaire des cellules à l’aide de l’ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...