Ce travail a été financé par une subvention de projet de fiducie Wellcome attribué à PD et GL (089236/Z/09/Z). SG a été soutenue par une bourse d&#39;études de doctorat en biotechnologie et Conseil de recherches en sciences biologiques. Nous remercions Matthieu Vermeren pour le genre de cadeau du vecteur shRNA et Jennifer Shieh pour de précieux conseils sur neuroblastes nucléofection.

Cette procédure est conforme à Accueil Règlement Royaume-Uni bureau (ACT des procédures scientifiques des animaux, 1986). Les scientifiques doivent suivre les lignes directrices établies et approuvées par leurs organismes de réglementation animaux institutionnelles et nationales. Une. Dissection et de dissociation de Rat RMS Neuroblastes <ol><li> Préparer les solutions nécessaires pour la dissection RMS et dissociation: </li></ol> milieu de dissection (100 ml) Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) - 98,5 ml 5 M de HEPES pH 7,4 à 0,5 ml Pénicilline-streptomycine (10 000 unités / ml et 10 000 pg / ml) - 1 ml milieu de dissociation (2 ml) HBSS - 1.760 ml 10x trypsine (2,5%) - 200 pl DNAse1 (1 mg / ml) - 40 pl Dulbecco modification moyenne de Eagle (DMEM) + 10% sérum de veau foetal (FCS) (40 ml) DMEM -36 ml FCS - 4 ml Le milieu complet (12 ml) Moyennes Neurobasal - 11,46 ml B27 Supplément - 250 pi L-glutamine (200 mM) - 125 pl Glucose (45%) - 165 pl 2. Filtre à stériliser le% de FCS DMEM + 10 et le milieu complet et preequilibrate eux dans un rapport C / 5% de CO 2 incubateur à 37 °. <ol><li> Dissection <ol><li> Sacrifiez une litière de rat P6-P7 (environ 12 chiots) par dislocation cervicale et décapiter avec des ciseaux. </li><li> Faire une incision antéro-postérieur à la peau le long de la suture mi-sagittal du nez au cervelet avec une lame de scalpel. Peler la peau et répéter la même incision le long du crâne. </li><li> Retirez délicatement les volets crâniens avec une pince et retirer délicatement le cerveau d&#39;une spatule, en prenant soin d&#39;inclure les bulbes olfactifs. </li><li> Couper la troisième plus caudale du cerveau et le jeter. </li><li> Hacher ee tissu cérébral en 1,4 mm d&#39;épaisseur à l&#39;aide de coupes coronales un hachoir de tissu. </li><li> Placer les tranches dans des boîtes contenant du milieu de dissection froide et les séparer soigneusement à l&#39;aide d&#39;une aiguille. </li><li> Le RMS apparaît comme une triangulaire, zone translucide au centre de sections de OB et comme une petite zone circulaire en plus des tranches de cerveau caudale. Couper les RMS sur chaque tranche avec un couteau de microchirurgie, en prenant soin d&#39;éviter d&#39;inclure les tissus environnants. Dans les ratons P7, généralement les ~ 8 tranches les plus rostrales (y compris OB) contiennent les RMS. </li><li> Recueillir les fragments RMS avec une pipette Pasteur en plastique et placez-les dans un petit plat contenant un milieu de dissection froide sur la glace. </li><li> Lorsque la dissection est terminé, le transfert des fragments RMS dans un tube de 15 ml avec une pipette en plastique. Laissez fragments à se déposer au fond du tube. </li></ol></li><li> Dissociation <ol><li> Remplacer le milieu de dissection avec 2 ml de milieu de dissociation. </li><li> Triturer les fragments RMS par doucement pipetting la suspension de haut en bas fragment environ 10x en utilisant une pipette P1000. </li><li> Laisser le tube avec les fragments de tissus dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 2 min. </li><li> Introduire à la pipette la solution de nouveau 10x et veiller à ce que les fragments ont dissocié (la suspension doit devenir trouble). </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant 5 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 433 xg pendant 5 min. </li><li> Dans l&#39;entre-temps aliquote de la quantité requise de siRNA / ADN dans des tubes Eppendorf (habituellement 3-5 pg d&#39;ADN / shRNA ou 9.5 ug par siRNA oligo nucléofection cependant, la quantité d&#39;ADN / siRNA peut nécessiter une optimisation). </li><li> Retirer l&#39;excès de milieu et remettre en suspension le culot cellulaire par pipetage doux dans 5 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS. </li><li> Effectuer une numération cellulaire. Attendez ~ 1 x 10 6 cellules par rat chiot cerveau. Un minimum de 2,5 x 10 6 cellules sont nécessaires pour chaque nucléofection, tandis queles meilleurs résultats sont obtenus en utilisant 3-4 x 10 6 cellules par nucléofection. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 433 xg pendant 5 min. Assurez-vous d&#39;enlever autant de support que possible. </li></ol></li></ol> 2. Nucléofection <ol><li> Remettre en suspension immédiatement le culot cellulaire chez le rat (souris ou si l&#39;on utilise des cellules de souris) solution de nucléofection neuronal préalablement incubé à la température ambiante. Utilisez 100 pi par nucléofection Remarque:. Généralement une portée de rat de 12 chiots est suffisante pour effectuer 4 nucleofections et une portée de souris (12 chiots) est suffisante pour effectuer 2 nucleofections. </li><li> Transférer 100 ul de la suspension cellulaire dans chaque tube Eppendorf contenant siRNA / ADN et mélanger délicatement 2-3x par pipetage avec une pipette P200. </li><li> Ajouter l&#39;échantillon (cell-DNA/siRNA suspension) à la partie inférieure de la nucleofectioncuvette, en prenant soin d&#39;éviter les bulles. </li><li> Nucleofect utilisant le programme G-013 (pour les cellules de rat) ou O-005 (pourdes cellules de souris). Un nucléofection prend environ 5 sec. </li><li> Ajouter rapidement 1 ml de DMEM préchauffé + 10% de FCS à l&#39;échantillon nucleofected. </li><li> Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour tous les autres échantillons. Remarque: pour des résultats optimaux, la procédure de nucléofection ensemble ne devrait pas durer plus de 5 minutes. </li><li> Transférer chaque échantillon dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de DMEM préchauffé + FCS à 10% en utilisant la pipette en plastique fourni par le kit de nucléofection. Éviter le transfert de tout débris cellulaire au tube. </li><li> Centrifuger les échantillons à 433 g pendant 5 min. </li><li> Retirez soigneusement tout excès de milieu et remettre le culot en 25-30 ul de DMEM préchauffé + 10% de FCS à l&#39;aide d&#39;une pipette P20. Ne pas utiliser plus de 30 pi de milieu. </li><li> Introduire à la pipette la suspension comme une goutte sur la face intérieure d&#39;un couvercle plat de p35. </li><li> Inversez le couvercle sur le plat de p35 contenant 2 ml de milieu complet (voir aussi la figure 1). </li><li> Ajouter dans l&#39;incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant aumoins 5 h et jusqu&#39;à 7 h. Plus de temps d&#39;incubation permet une meilleure ré-agrégation d&#39;amas cellulaires. </li><li> Transférer les gouttes de suspension du couvercle dans le milieu complet dans le plat à l&#39;aide d&#39;une pipette P1000 avec une pointe de coupe. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 24 heures pour nucleofections d&#39;ADN et 48 h pour nucleofections siRNA / shRNA. </li></ol> 3. Incorporation <ol><li> Préparer un milieu complet (25 ml) et il preequilibrate à 37 ° C / 5% CO 2 pendant quelques heures. </li><li> Sortez les aliquotes congelées de la matrice de la membrane basale de -80 ° C congélateur et décongeler sur la glace dans la chambre froide. </li><li> Pour chaque nucléofection préparer un plat de 6 cm contenant jusqu&#39;à huit 13 mm coverlips stériles. </li><li> Placez les plats sur une boîte de glace recouverte d&#39;une pellicule de plastique. Il est important de maintenir les lamelles fraîche pour empêcher la solidification matrice durant la procédure d&#39;enrobage. </li><li> Pour maintenir l&#39;humidité, placer une bande de tissu humide dans un plat de 15 cm que wmal être utilisés pour contenir jusqu&#39;à trois plats 6 cm contenant les neuroblastes embarqués. </li><li> Ajouter milieu complet à la matrice décongelé dans un rapport 1:3. Par exemple, mélanger 40 pi de milieu complet avec 120 pi de matrice à la pipette. Cette quantité de matrice est suffisante pour intégrer des agrégats sur huit 12 mm lamelles. </li><li> Transférer les groupes de cellules agrégés de nouveau à un tube de 15 ml et centrifuger à 433 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer l&#39;excès de milieu et remettre le culot dans 10 ul de milieu complet. </li><li> Placez 2 pi de suspension cellulaire total sur chaque lamelle stérile et ajouter 18 ul de matrice / mélange milieu complet. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre la matrice sur toute la lamelle. </li><li> Placer immédiatement la capsule de 6 cm contenant les lamelles dans les 15 cm plat et laisser dans l&#39;incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant 15-20 min. Lorsque la matrice est solidifié, ajouter doucement 5 ml de milieu complet à chaque 6 cm prise de plat soins à pousserbas tout lamelle flottant avec une pointe de pipette. </li><li> Incuber pendant 24 heures à 37 ° C / 5% CO 2 pour laisser neuroblastes migrent hors des agrégats de cellules. </li></ol> 4. 3D migrations Assay <ol><li> Préparer les solutions nécessaires pour immunologique. <ol><li> Préparer la solution de bloc: solution de bloc de chèvre (50 ml) Phosphate Buffered Saline (PBS) - 5 ml Sérum de chèvre - 7,5 ml 10% de Triton X-100 - 1,5 ml BSA - 50 mg H 2 O - 36 ml </li><li> Filtrer et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution de fixation: Solution de fixation (100 ml) Paraformaldéhyde (PFA) - 4 g ATTENTION: manipulez toujours PFA sous une hotte Saccharose - 20 g (en option) PBS à 100 ml </li><li> Sur une plaque chauffante et sous agitation constante dissolution de la PFA dans 80 ml de PBS maintenue à 65 ° C. </li><li> Une fois que le PFA a dissous, ajouter 20 g de saccharose. </li><li> Ajuster le pH à7,4 (en général par l&#39;addition de NaOH 60 M ~ 1 ul pour 100 ml de solution). </li><li> Mettre à un volume total de 100 ml avec du PBS. </li></ol></li><li> Immunocoloration <ol><li> Placez les lamelles dans une plaque de 24 puits. </li><li> Rincer les lamelles avec du PBS 2x. </li><li> Fixer les neuroblastes agrégats RMS avec une solution de fixation pendant 45 min à température ambiante. </li><li> Rincer les lamelles avec du PBS 3x (5 min / lavage - sur une plate-forme à bascule). </li><li> Bloquer pendant 30-60 minutes avec une solution de bloc de chèvre. </li><li> Diluer anticorps primaires dans la solution de bloc de chèvre et incuber pendant une nuit à 4 ° C. (Si on le souhaite, la phalloïdine fluorescente (1:400) et le colorant Hoechst (1:10000) peuvent également être ajoutés à la solution d&#39;anticorps primaire à visualiser l&#39;actine filamenteuse et des noyaux). </li><li> Rincer les lamelles avec du PBS 3x (5 min / lavage). </li><li> Diluer les anticorps secondaires dans la solution de bloc de chèvre et incuber pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Rincer coverslips avec du PBS 3x (5 min / lavage) </li><li> Mont lamelles couvre avec un milieu de montage fluorescent et laisser sécher une nuit à température ambiante. </li></ol></li><li> Analyse de la migration <ol><li> Capturez des images d&#39;agrégats de neuroblastes RMS fixes avec un microscope à fluorescence en utilisant un objectif 10X. Inclure une barre d&#39;échelle dans une image de l&#39;échantillon. </li><li> Pour configurer l&#39;échelle de quantification, de mesurer la barre d&#39;échelle dans l&#39;image en sélectionnant la «ligne droite» outil sur la barre d&#39;outils de ImageJ. </li><li> Choisissez l&#39;option «Analyser» et cliquez sur «définir l&#39;échelle». </li><li> Dans la fenêtre de l&#39;échelle définir la «distance connue» et cochez la case «globale» de garder les mêmes paramètres pour toutes les mesures. </li><li> Utilisez l&#39;outil «ligne segmentée» sur la barre d&#39;outils de ImageJ pour mesurer la distance entre le bord de l&#39;ensemble de la neuroblaste le plus migré dans 6 secteurs différents autour de l&#39;ensemble du total (figure 3B). Considérons seulement ag isolégregates pour analyse. </li><li> Calculer une distance moyenne de 6 valeurs obtenues pour chaque agrégat de migration. </li><li> Mesurer 10-20 agrégats pour chaque condition dans chaque expérience et piscine résultats indépendants d&#39;un minimum de trois expériences indépendantes. Toujours inclure un contrôle nucléofection (p. ex. GFP ou une sh de contrôle / siRNA). </li></ol></li></ol>

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A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation.">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197 (2013).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La migration des neuroblastes le long des RMS à l&#39;emplacement final dans l&#39;OB est une étape fondamentale dans la neurogenèse postnatale. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce processus complexe est loin d&#39;être entièrement comprise. La procédure expérimentale décrite ici permet l&#39;étude de la migration des neuroblastes in vitro. Nous avons adapté un protocole précédemment publié pour isoler RMS neuroblastes de souris ou rat 25 postnatale précoce. Pour obtenir des résultats optimaux, il est important de maîtriser l&#39;étape de dissection, car il est essentiel de maintenir l&#39;intervalle de temps entre la dissection et nucléofection à un minimum. Après nucléofection, neuroblastes peuvent être agrégés de nouveau, noyées dans une matrice tridimensionnelle et de gauche à migrer sur une période de 24 heures. Sinon, pour des fins autres que la migration (par exemple immunofluorescence ou analyse Western blot), les cellules peuvent être immédiatement plaqué après nucléofection sur polyornithine/laminin-lamelles recouvertes, où ils survivent jusqu&#39;à 4-5 jours. Souris et le rat neuroblastes migrent dans Matrigel dans une mesure similaire, mais des cellules de souris semblent avoir une plus forte tendance à migrer dans les chaînes que les cellules de rat. En fonction de l&#39;objectif de l&#39;étude, les neuroblastes peuvent être nucleofected avec différents plasmides codant pour des protéines fluorescentes ou de type / mutant protéines sauvages d&#39;intérêt. Pour optimales plasmides d&#39;expression de la protéine avec un promoteur CAG (promoteur de β-actine par le CMV activateur et β-globine queue poly-A) 26 sont fortement recommandés. De plus, les oligos siARN ou des plasmides shRNA peuvent être nucleofected à knockdown cibles d&#39;intérêt. L&#39;appauvrissement de la protéine efficace peut être visualisée par immunofluorescence ou par western blot (lyse habituellement incorporés agrégats de 1 rat chiot avec 50 ul de tampon de lyse standard). Nucléofection est une méthode relativement simple pour la transfection de neuroblastes primaires, offre une alternative plus facile et plus rapide à viral transfection médiée par un vecteur, et peut atteindre une haute (~ 70-80%) efficacité de la transfection. Il est essentiel de travailler rapidement au cours de la procédure de nucléofection, depuis le départ de neuroblastes dans la solution de nucléofection pendant une période prolongée réduit considérablement la viabilité cellulaire. Le rendement moyen des cellules de dissection RMS est relativement faible pour les souris P7 (~ 5 x 10 5 cellules / cerveau) par rapport aux rats P7 (~ 1 x 10 6 cellules / cerveau) et d&#39;au moins 3 x 10 6 cellules par nucléofection sont tenus pour réaliser la transfection avec ~ 50% de rendement. En outre, les neuroblastes de rat semblent mieux résister à nucléofection rapport à neuroblastes de souris. Par conséquent, les petits postnatale précoce (P6-P7) rat pourraient représenter une source de neuroblastes pratique, considérant également que l&#39;organisation de RMS de rats et de souris sont remarquablement similaire 27 et que l&#39;étendue de rat et de la souris migration des neuroblastes in vitro est également comparable. Il est conseillé de ne pas garder les groupes agrégés de nouveau de neuroblastes nucleofected en suspension pendant plus de 48 heures pour éviter les effets anormaux sur la morphologie et la migration cellulaire (nos observations non publiées). Le test 3D décrit ici peut être utilisé pour quantifier la migration des neuroblastes à un point de temps fixe après incorporation dans la matrice (par exemple. 24 h). Les granulats de différentes tailles peuvent être utilisés dans l&#39;analyse, car il n&#39;existe pas de corrélation significative entre la taille des agrégats et de la distance de migration (nos observations non publiées). Pour visualiser et étudier plus la dynamique de la migration des neuroblastes, imagerie time-lapse peut être utilisé. Il est recommandé d&#39;effectuer l&#39;analyse de la migration dans un intervalle de 24 heures après l&#39;intégration, car la vitesse de neuroblastes semble diminuer de façon drastique à des points de temps plus longues (nos observations non publiées). &lt;/ P&gt; Il ya des limites à ce protocole. En premier lieu, la mesure nucléofection peut être utilisé pour les premiers neuroblastes de rongeurs postnatales, alors que l&#39;infection avec des vecteurs viraux méthode de transfection reste le plus efficace pour 28 neuroblastes adultes. En second lieu, l&#39;analyse in vitro de migration ne reproduit pas entièrement l&#39;architecture complexe des RMS observées in vivo. En effet, bien que les neuroblastes maintenir la capacité de migrer d&#39;une manière similaire à leurs homologues in vivo, dans le montage expérimental décrit ici, ils n&#39;ont pas d&#39;interactions avec d&#39;autres composants RMS telles que les astrocytes et les vaisseaux sanguins, ce qui contribue également à réguler leur motilité 9,29, 30. Ce problème peut être réglé à l&#39;avenir par l&#39;optimisation des systèmes de modèle de co-culture en trois dimensions. En conclusion, la combinaison nucléofection avec un test de migration 3D représente un outil précieux pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacentsla migration des neuroblastes. Cette procédure expérimentale fournit une méthode initiale, rapide et relativement simple d&#39;évaluer le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes, qui peut encore être validées par d&#39;autres approches comme in vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de cultures tranche de cerveau 28,31,32 .

En postnatal des mammifères cerveau, la production de nouveaux neurones (neurogenèse) se produit tout au long de la vie et est limitée à deux niches neurogène: la zone sous-ventriculaire (SVZ) des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire du gyrus denté de l&#39;hippocampe 1. Plusieurs études récentes ont montré l&#39;importance du rôle de la neurogenèse adulte dans la facilitation des tâches d&#39;apprentissage et de mémoire 2,3. En outre, la preuve de la prolifération et le recrutement de cellules progénitrices neurales suivants lésion cérébrale 4-7 soulève la possibilité d&#39;activation pharmacologique de la neurogenèse dans la réparation neuronale. La neurogenèse postnatale est strictement réglementée dans toutes ses phases, qui comprennent la prolifération de neurones progéniteurs, la migration, la différenciation, la survie et l&#39;intégration synaptique finale des neurones nouvellement nés 8. Progéniteurs neuronaux (neuroblastes) dérivées de cellules souches dans le SVZ migrent sur une grande distance à travers la migration rostralecourant (RMS) vers le bulbe olfactif (OB) où elles se développent en neurones fonctionnels 9. Neuroblastes migrateurs sont principalement unipolaire, avec un corps cellulaire allongé s&#39;étendant d&#39;un processus de leader unique. Ces cellules se déplacent dans les chaînes d&#39;une manière collective, en glissant sur ​​l&#39;autre 10. La migration est une étape cruciale pour la maturation ultérieure des progéniteurs SVZ dérivés en neurones fonctionnels 11 et est contrôlée par des facteurs multiples et des molécules de guidage, y compris: molécule polysialylés neurones d&#39;adhésion cellulaire (PSA-NCAM) 12, Ephrines 13, les intégrines 14 fentes 15, Facteurs de croissance de 16 et 17 neurotransmetteurs, mais les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus ne sont pas pleinement compris. Enquêter sur les voies de signalisation intracellulaires régulant la migration des neuroblastes fournira non seulement une meilleure compréhension de la neurogenèse adulte, mais aussi de contribuer au développement de la nouvelle thérapeutiqueapproches pour favoriser la réparation du cerveau. Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes in vitro en utilisant nucléofection et un test de migration 3D. Nucléofection est une technique de transfection cellulaire basé sur un procédé perfectionné de l&#39;électroporation. du type de cellule courant électrique spécifique et la solution de nucléofection permettent le transfert de macromolécules polyanioniques tels que des ADN et des vecteurs shRNA et de siRNA oligonucléotides directement dans le noyau cellulaire et transfection permis de diviser lentement ou cellules inactives sur le plan mitotique, comme les neurones embryonnaires de mammifères et 18. Cette méthode est rapide, relativement facile à réaliser et donne lieu à une transfection hautement reproductible d&#39;un large éventail de types de cellules, y compris les neuroblastes et les neurones primaires de 19 à 21. La dissociation du tissu RMS permet l&#39;isolement des neuroblastes migratoires, qui peut être nucleofected avec succès avec l&#39;ADN / SHRVecteurs NA ou oligos de siRNA ciblant des gènes d&#39;intérêt. Suite à nucléofection, les neuroblastes sont agrégés de nouveau suspendu dans des gouttes et ensuite noyées dans une matrice de Matrigel en trois dimensions. Ces conditions permettent neuroblastes migrent sur ​​les agrégats de cellules récapitulant le mode de migration observée in vivo, offrant ainsi un excellent modèle pour étudier les voies de signalisation impliquées dans la migration des neuroblastes et d&#39;évaluer l&#39;influence des traitements pharmacologiques sur la motilité de ces cellules.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:255px;">14175129</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">HEPES</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">2.5% Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>store 200 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">DNAse I Vial (D2)</td>
			<td style="width:339px;">Worthington</td>
			<td style="width:255px;">LK003170</td>
			<td>&#8805;1,000 units per vial; store 50 &#181;l aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:339px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3007902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:339px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:339px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">D-(+)-Glucose solution (45%)</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free</td>
			<td style="width:339px;">BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td>prepare 120 &#181;l aliquots at 4 &#176;C, then store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">PFA</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">441242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Sucrose</td>
			<td style="width:339px;">BDH</td>
			<td style="width:255px;">102745C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Goat serum</td>
			<td style="width:339px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:255px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:339px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:255px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">BSA</td>
			<td style="width:339px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:255px;">BPE9701-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Dako fluorescence mounting medium</td>
			<td style="width:339px;">Dako</td>
			<td style="width:255px;">S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Rat neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Mouse neuron nucleofection kit</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;">VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Microsurgical knife</td>
			<td style="width:339px;">Angiotech</td>
			<td style="width:255px;">7516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:339px;">The Mickle Laboratory Engineering Company</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:688px;">Nucleofector II</td>
			<td style="width:339px;">Lonza</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleofection of rodent neuroblasts to study neuroblast migration in vitro

La zone sous-ventriculaire (SVZ) situé dans la paroi latérale des ventricules latéraux joue un rôle fondamental dans la neurogenèse adulte. Dans cette zone restreinte du cerveau, les cellules souches neurales prolifèrent et produisent constamment neuroblastes qui migrent tangentiellement dans les chaînes le long de la courant de migration rostrale (RMS) pour atteindre le bulbe olfactif (OB). Une fois dans l&#39;OB, neuroblastes passer à la migration radiale puis se différencient en neurones matures capables d&#39;intégrer dans le réseau neuronal préexistante. La migration des neuroblastes appropriée est une étape fondamentale dans la neurogenèse, assurer la maturation fonctionnelle correcte de nouveaux neurones. Compte tenu de la capacité des neuroblastes SVZ dérivés pour cibler les zones lésées dans le cerveau, l&#39;étude des mécanismes intracellulaires sous-tendent leur motilité va non seulement améliorer la compréhension de la neurogenèse, mais peut également favoriser l&#39;élaboration de stratégies neurorégénérateurs. Ce manuscrit décrit une analyse détailléeprotocole pour la transfection de rongeur primaire RMS neuroblastes postnatals et l&#39;analyse de leur motilité l&#39;aide d&#39;un test in vitro de migration 3D récapitulant leur mode de migration observée in vivo. Les neuroblastes de rats et de souris peuvent être rapidement et efficacement transfectées par nucléofection avec de l&#39;ADN plasmidique, petite épingle à cheveux (sh) ARN interférent court ou (si) oligos ARN ciblant des gènes d&#39;intérêt. Pour analyser la migration, les cellules sont agrégés de nouveau dans nucleofected «gouttes suspendues», puis noyées dans une matrice tridimensionnelle. Nucléofection en soi ne porte pas atteinte de façon significative la migration des neuroblastes. Le traitement pharmacologique de neuroblastes nucleofected et agrégés de nouveau peut également être effectuée pour étudier le rôle des voies de signalisation impliquées dans la migration des neuroblastes signalisation.

Neuroblastes peuvent être isolés avec succès à partir de tissu disséqué RMS (figure 1A) et noyées dans une matrice à trois dimensions. Cellules isolées de rat ou dans le RMS postnataux de la souris sont immunopositif des marqueurs de neuroblastes migrateurs, tels que doublecortine (DCX), ßlll tubuline ou PSA-NCAM (figures 1B-C). Neuroblastes dissociées peuvent être efficacement nucleofected avec de l&#39;ADN (par ex. D&#39;un plasmide codant pour la GFP, Figure 2) ou des plasmides shRNA (figure 4) pour atteindre l&#39;épuisement protéine, qui peut être évaluée par analyse Western blot (figure 4B) ou immunofluorescence (non représenté) . Cellules nucleofected avec des plasmides codant pour la GFP migrent radialement pôles de neuroblastes agrégés de nouveau (figure 3A). Quantification de la distance par rapport migré 24 heures après l&#39;intégration (figure 3B) ne montre aucune différence de migration entre GFP-posit<html> ive cellules et cellules nonnucleofected GFP-négatif (figure 3C), indiquant que nucléofection en soi ne perturbe pas la migration. Il ya aussi pas de différence significative dans la mesure de la migration entre les neuroblastes et neuroblastes nucleofected migrent directement des explants RMS (données non présentées). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1. Dissection de neuroblastes RMS. (A) Représentation schématique de RMS neuroblastes dissection. Pour une description détaillée s&#39;il vous plaît se référer au texte. (B) Les cellules de RMS de rat isolés sont immunopositif pour les fabricants de neuroblastes migrateurs DCX et tubuline βlll. Bar, 20 um. (C) Les cellules migrent hors de souris RMS explants expriment neuroblaste migratoire Marqueurs DCX et PSA-NCAM. Bar, 20 um.0989/50989fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2. Souris neuroblastes nucléofection. Dissociées souris RMS neuroblastes sont nucleofected avec pMAX-GFP, agrégés de nouveau, noyées dans une matrice en trois dimensions et on a laissé migrer pendant 6 heures. Neuroblastes qui migrent d&#39;un amas de cellules agrégés de nouveau (en haut, à contraste de phase photos) montrent l&#39;efficacité de transfection élevée (en bas, le canal de la GFP photos). Les panneaux de la colonne de droite montrent des images de plus grossissement correspondant aux encarts en surbrillance dans les panneaux de la colonne de gauche. Bars, 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:c<html> ontenu-width = &quot;6 po&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figure 3. 3D essai de migration. (A) neuroblastes de rat ont été nucleofected avec pMAX-GFP (GFP) ou pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), agrégés de nouveau, noyée dans la matrice et laissé migrer pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été fixées et immunocolorées pour la GFP (vert) et ßlll tubuline (rouge). Bar, 50 um. (B) mesure la distance de migration en utilisant ImageJ. L&#39;amas de cellules agrégés de nouveau est divisé en 6 secteurs égaux. La distance entre le bord de la grappe (trait pointillé) et de la cellule migré plus loin est mesuré pour chaque secteur. (C) Quantification de la distance relative migré par les cellules nucleofected, des cellules nonnucleofected (GFP-positives) et de contrôle (GFP-négatif) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="&lt;/ Html">&quot;Figure 4&quot; fo: contenu width = &quot;6 po&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg&quot; width = &quot;500px&quot; /&gt; Figure 4. Suivi migration des neuroblastes après shRNA nucléofection. (A) neuroblastes de rat ont été nucleofected avec un vecteur de commande shRNA (pCA-b-EGFPm5 Silencieux 3, qui exprime également EGFP 23) ou le même vecteur contenant un shRNA ciblant fascine, une protéine de l&#39;actine-regroupement 24. Les cellules ont été agrégés de nouveau plus de 48 h, enrobées dans une matrice et de gauche à migrer pendant 24 heures. Les agrégats ont été ensuite fixées et immunocolorées pour la GFP (vert) et ßlll tubuline (rouge). Bar, 50 um. (B) fascine efficace épuisement peut être détectée 50 heures après shRNA nucléofection par analyse western blot. Actine est montrée ici comme un témoin de charge (C) L&#39;analyse quantitative de la distance par rapport à la migration montrant que l&#39;épuisement fascine entrave sérieusement la migration des neuroblastes. (Moyenne ± SEM; ** p &lt;0,01, n = 3 expériences indépendantes). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.

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Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

la migration des neuroblastes est une étape cruciale dans la neurogenèse postnatale. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes en utilisant / petit ARN en épingle à cheveux d&#39;ADN (shRNA) nucléofection et un test de migration 3D avec neuroblastes isolés du rongeur postnatale courant de migration rostrale.

Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

11.3K vues.  King's College London.  la migration des neuroblastes est une étape cruciale dans la neurogenèse postnatale. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour étudier le rôle des régulateurs candidats de la migration des neuroblastes en utilisant / petit ARN en épingle à cheveux d'ADN (shRNA) nucléofection et un test de migration 3D avec neuroblastes isolés du rongeur postnatale courant de migration rostrale. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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Neurosciences

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Souris Rhombencéphale<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour étudier les migrations visage Branchiomotor Neuron

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...