NEPTUNE permet le ciblage et la manipulation génétique du système nerveux embryonnaire de la souris à partir du jour embryonnaire 7.5 et permet la génération de modèles knockdown ou traçage de lignée en quelques jours. Ce protocole est adaptable, flexible et rapide. Nous pouvons fournir des shRNA, de l’ARNc ou des bibliothèques virales à code-barres pour répondre à différentes questions en quelques jours plutôt qu’en mois ou en années.
Nous nous attendons à ce que NEPTUNE fournisse des informations en neurosciences, mais il peut également être adapté à d’autres systèmes d’organes. L’identification de la cavité amniotique peut être assez difficile, alors prenez votre temps pour regarder l’image échographique et peut-être avoir un manuel ou une autre ressource anatomique à portée de main. Pour commencer à charger l’aiguille, faites glisser l’aiguille en verre sur le piston en métal, en maintenant le collett attaché mais légèrement desserré.
Ensuite, poussez l’aiguille capillaire avec le piston métallique à travers le joint avant jusqu’à ce qu’il atteigne l’entretoise. Appuyez sur Vide pour enfoncer le piston dans l’aiguille et expulser l’huile de l’extrémité de l’aiguille. Appuyez ensuite sur Remplir pour créer une bulle d’air, en divisant l’huile et la solution.
Enfin, abaissez l’aiguille, immergez la pointe dans la solution et appuyez à nouveau sur Remplir pour charger l’aiguille. Après avoir fixé une souris femelle anesthésiée avec des cavités amniotiques de taille idéale sur la table chauffante, appliquez du gel pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne et injectez un analgésique par voie sous-cutanée. Ensuite, stérilisez le bas-ventre en essuyant avec un chiffon imbibé de 0,5 milligramme par millilitre de solution de chlorhexidine et séchez la peau.
Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision cutanée verticale médiane de 1,5 à 2 centimètres dans le bas-ventre. Ensuite, soulevez doucement la peau et libérez-la de la couche musculaire sous-jacente d’environ un centimètre autour du point d’incision pour faciliter la suture après la chirurgie. Ensuite, faites une incision verticale médiane d’un centimètre dans la couche musculaire.
À l’aide d’une paire de forceps, soulevez un côté de la peau et de la couche musculaire, et avec une autre paire, recherchez les cornes utérines. Ensuite, à l’aide d’une pince, tenez le tissu entre les embryons et retirez soigneusement les deux cornes utérines de l’abdomen. Comptez et numérotez les embryons, soit de l’ovaire au col de l’utérus, soit du col de l’utérus à l’ovaire, des deux côtés.
Ensuite, avec un coton-tige humide, repoussez doucement tous les embryons dans la cavité abdominale, sauf les trois premiers à injecter. Ensuite, placez une goutte de PBS sur une membrane élastique collée à l’ouverture centrale ronde d’une boîte de Petri modifiée disponible dans le commerce et maintenez-la immédiatement au-dessus des embryons. Insérez une pince fermée dans l’incision de l’élastique, puis relâchez la pince pour ouvrir l’incision élastique, laissant tomber le liquide sur les embryons.
À l’aide d’une pince, tirez la section de l’utérus correspondant aux trois embryons à travers l’élastique et perchez doucement la boîte de Petri sur l’abdomen de la souris. À l’aide de quatre pieds d’argile, fixez et fixez la boîte de Petri au-dessus de l’abdomen pour réduire la pression sur la souris et réduire la sensibilité de l’imagerie à la respiration et au rythme cardiaque de la souris. Ensuite, à l’aide d’une pince et d’un coton-tige humide, ajustez l’utérus et l’élastique pour vous assurer que l’élastique est scellé autour de la peau de la souris, empêchant ainsi les fuites de PBS.
Ensuite, pour fixer l’utérus, appuyez sur le cylindre de pâte à modeler à droite des embryons ou de l’utérus et ajoutez du PBS à la boîte de Petri jusqu’à ce que les embryons et l’utérus soient entièrement recouverts du PBS. Pour faciliter l’enregistrement des injections, plongez la sonde à ultrasons dans le PBS et ajustez la souris ou la table chirurgicale de sorte que le premier embryon soit aligné avec la sonde à ultrasons. Scannez les trois embryons et inspectez les cavités amniotiques.
Ensuite, à l’aide de l’appareil à ultrasons, mesurez le diamètre de la cavité amniotique pour déterminer le volume d’injection approprié. À l’aide du contrôleur d’injection, réglez les volumes d’injection déterminés et la vitesse d’injection sur ralentir, avec un débit d’injection de 23 nanolitres par seconde. Après avoir abaissé l’aiguille dans le PBS, à l’aide des roues principales du système de rails, appuyez sur Vide sur le contrôleur du nanoinjecteur jusqu’à ce que le liquide atteigne l’extrémité de l’aiguille.
Ensuite, soulevez l’aiguille du PBS et appuyez sur Injecter pour vérifier qu’une goutte du volume approximatif souhaité est déchargée. Abaissez à nouveau l’aiguille dans le PBS et déplacez le nanoinjecteur avec la roue du plan Y sur le micromanipulateur pour aligner l’aiguille avec la sonde à ultrasons et l’embryon. Ajustez l’angle de l’aiguille avec la molette d’injection pour assurer un angle d’injection presque perpendiculaire par rapport à la paroi utérine.
Ensuite, à l’aide de la roue d’injection du micromanipulateur, insérez l’aiguille dans la cavité amniotique en un seul mouvement. Si la pointe de l’aiguille disparaît de l’image échographique, déplacez la sonde vers l’avant ou vers l’arrière pour ramener l’aiguille au point. Ensuite, injectez le volume souhaité en appuyant sur Injecter pendant le nombre approprié de fois.
Une fois le volume requis injecté, attendez 5 à 10 secondes avant de rétracter l’aiguille en un seul mouvement. Déplacez l’étape vers l’embryon suivant et répétez l’injection pour les deux autres embryons comme démontré. Ensuite, soulevez la sonde à ultrasons et l’aiguille hors du PBS à l’aide du micromanipulateur, en détournant l’aiguille de l’opérateur pour éviter les dommages et les blessures.
À l’aide d’une pince, replacez les premier et deuxième embryons dans l’abdomen en les poussant doucement à travers l’élastique. Ensuite, saisissez doucement le tissu adjacent au troisième embryon et tirez l’utérus vers l’extrémité supérieure de l’incision élastique. Tirez doucement vers le haut du quatrième au sixième embryon avec une pince et laissez le troisième embryon rentrer à nouveau dans l’abdomen.
Une fois que tous les embryons avec des cavités amniotiques optimales ont été injectés, repoussez doucement les embryons et l’utérus dans l’abdomen de la souris. Une transduction réussie de la plaque neurale donne des embryons avec une forte expression d’un rapporteur fluorescent dans le cerveau et d’autres tissus dérivés de l’ectoderme, comme la peau. L’injection de volumes excessivement élevés peut entraîner des anomalies du tube neural, telles que l’exencéphalie.
Des injections réussies au jour embryonnaire 7,5 entraînent une transduction uniforme du cerveau antérieur au cerveau postérieur, y compris le plexus choroïde. Les injections à faible titre entraînent la transduction de clones unicellulaires, tandis que le virus à titre élevé transduit près de 100% du cerveau entier. Les coupes coronales jusqu’au jour embryonnaire 13,5 embryonnaires ont montré une transduction élevée et uniforme du tissu neural de l’œil, du cristallin, de la cornée et du mésenchyme.
Après l’injection au jour embryonnaire 9,5, les glandes salivaires et les canaux se développent vers le jour embryonnaire 11,5 à partir de l’épithélium buccal. L’épithélium lingual de la langue est bien transduit, alors que le mésenchyme sous-jacent est négatif. De plus, les amas positifs dans l’épithélium lingual sont séparés par des sections négatives, suggérant une transduction de la surface papillaire.
Les injections au jour embryonnaire 7,5 entraînent une transduction généralisée du mésenchyme de la langue au jour embryonnaire 13,5, ce qui suggère que les injections précoces ciblent les cellules de la crête neurale, contribuant au mésenchyme dans la langue. Les injections de lentiviraux conduisent également à un ciblage généralisé du système nerveux central et périphérique, transduisant à la fois les neurones et les progéniteurs de la moelle épinière, ainsi que les ganglions de la racine dorsale. Une bonne préparation est essentielle.
Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite et que les embryons sont bien fixés, afin que vous puissiez vous concentrer entièrement sur les injections dans la cavité du rat. Après NEPTUNE, l’analyse peut être effectuée par diverses méthodes, telles que l’analyse immunofluorescente du cerveau, le séquençage de l’ARN unicellulaire ou la naissance des embryons injectés pour une analyse comportementale.
