Synchroniser la drosophile pour définir les temps circadiens est la première étape dans l’étude des événements qui contrôlent ou répondent à l’horloge biologique. La synchronisation de tous les modèles suivra la même approche de base. Il y a beaucoup d’étapes pour ce faire pratique et il peut sembler accablant de les mettre tous ensemble.
Attendez-vous à essayer quelques fois avant qu’il ne se sente naturel. Gardez les températures stables et je veux que la lumière soit allumée pendant les trois minutes. Préparer les aliments à la mouche dans une crock-pot à 121 degrés Celsius, en mélangeant comme ingrédients sont ajoutés.
Couvrir le Crock-Pot et porter le contenu à ébullition, en mélangeant le contenu toutes les 10 minutes. Après 20 minutes à ébullition, éteindre le feu et ajouter 83,6 millilitres d’eau au Crock-Pot. Laissez le couvercle éteint au fur et à mesure que les aliments refroidissent.
Pendant que les aliments refroidissent, remuer toutes les 10 minutes pour éviter qu’un film ne se forme sur le dessus. Mesurez également la température toutes les 10 minutes avec un thermomètre en verre. Une fois que la nourriture a refroidi à moins de 60 degrés Celsius, ajouter le Tegosept et l’acide propionique, tel que décrit dans le manuscrit.
Bien mélanger et ajuster le Crock-Pot pour maintenir une température, à seulement quelques degrés moins de 60 degrés Celsius. Utilisez une pompe périssaltique pour distribuer la nourriture à la mouche. Pour les flacons étroits, pompez 10 millilitres, et pour six bouteilles carrées de fond d’once, pompez 60 millilitres.
Entreposer les mouches sauvages à 25 degrés Celsius pendant 10 à 12 jours, jusqu’à ce qu’environ 200 pupes soient fixées à l’intérieur de la bouteille. Pour retirer les adultes de la bouteille, inclinez-les dans une nouvelle bouteille et utilisez l’extrémité terne d’un pinceau numéro zéro pour pousser les adultes restants. Essuyer le pinceau avec 70 % d’éthanol avant et après l’utilisation.
Incuber les nymphes à 25 degrés Celsius pour permettre à la prochaine génération d’émerger. Après trois jours, les mouches auront de zéro à trois jours. N’oubliez pas que la température, la lumière et même votre choix d’aliments influenceront l’entraînement.
Assurez-vous de les garder, chaque contrôle au cours de votre expérience. Aux points de collecte désignés, utilisez un tampon d’anesthésie au dioxyde de carbone pour immobiliser les mouches et recueillir 100 mâles et 100 femelles. Les mouches femelles sont beaucoup plus grosses que les mâles.
Les mouches peuvent également être différenciées en examinant les organes génitaux. Les mâles ont des organes génitaux arrondis foncés, tandis que les femelles ont des organes génitaux plus légers et plus pointus. Placer les mâles et les femelles dans des flacons séparés avec 100 femelles par flacon et 50 mâles par flacon.
Les interactions sociales masculines entraînent de nombreux décès lorsqu’il y a 100 personnes dans un flacon. Pour permettre l’entraînement circadien, placez les flacons dans des incubateurs réglementés par la lumière pendant trois à cinq jours. Pour produire des mouches pour l’entraînement futur, placez 25 des femelles restantes, et cinq à sept des mâles restants dans une nouvelle bouteille.
Incuber la bouteille à 25 degrés Celsius. Pour chaque 100 mouches qui seront collectées. Préparer un flacon étroit en ajoutant 4,8 millilitres de fixatif.
Placez les flacons étroits dans un seau de glace et emmenez le seau, les serviettes en papier, le papier d’aluminium et le ruban adhésif à l’incubateur. Pour recueillir les mouches, placez un entonnoir dans le flacon étroit, puis retirez le bouchon du flacon de mouches et inversez-le rapidement dans l’entonnoir. Appuyez doucement pour aider à guider les mouches dans le flacon de fixatif.
Lors de la collecte des mâles, mélanger deux flacons de 50 mouches dans un flacon étroit. Envelopper les flacons pour ZT13 et ZT19 dans du papier d’aluminium. Après le transfert des mouches, collez les bouchons en place pour éviter les déversements.
Placez les flacons sur le mélangeur à noix à 165 rpm, et quatre degrés Celsius, pendant quatre heures. Les mouches ne sont plus sensibles à la lumière, de sorte que le papier d’aluminium peut être enlevé pour vérifier que les mouches sont submergées dans le fixatif. Après avoir retiré les flacons du mélangeur à noix, retirer le formaldéhyde, puis laver les mouches trois fois avec 3000 microlitres de 1X PBS, en inversant le flacon pendant chaque lavage.
Conservez les flacons à quatre degrés Celsius, en attendant l’immunofluorescence future. La lumière et l’obscurité ont été utilisées pour entrainer les mouches aux cycles circadiens. L’entrainement a été vérifié par immunoblotting, et l’analyse d’immunofluorescence de la protéine de période, un marqueur pour l’entraînement circadien.
L’immunoblotting des extraits entiers de cellules, préparé à partir des têtes des mouches entraînées montre un modèle canonique de mobilité et d’intensité de protéine d’époque. L’immunofluorescence des cerveaux entraînés, recueillie à ZT1, montre des protéines d’époque dans le modèle caractéristique. Cette méthode est un point de départ pour l’immunofluorescence, l’immunoplotting, l’immunoprécipitation, l’analyse comportementale, et toute autre technique que vous pouvez vouloir utiliser pour comparer comment la voie change pendant que l’horloge biologique tourne.
Avec la possibilité d’entrainer votre organisme modèle, vous pouvez demander si votre voie préférée change au fil du temps, et si les effets dans votre voie préférée peut conduire à la perturbation de la biologique. Un certain nombre de maladies s’aggravent lorsque l’horloge biologique est perturbée. L’identification des mécanismes sous-jacents nous aidera à créer des médicaments plus efficaces pour les personnes souffrant de maladies, comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson.
