Nous remercions nos collègues du Département de biologie, Université de Fribourg pour des discussions fructueuses. Nous remercions le Bloomington Stock Center pour fournir des stocks de mouches. Ce travail a été soutenu financièrement par le Fonds national suisse (PP00P3_123339) et la Fondation Velux à SGS

1. L&#39;élevage larvaire <ol><li> Gardez voler des souches ou des croisements génétiques dans la culture de masse à 25 ° C sur un milieu de farine de maïs sous un léger 12 h cycle 12-hr sombre dans une mouche incubateur équipé de la lumière et la minuterie. </li><li> Diluer bailleur de levure dans l&#39;eau pour former une pâte liquide (10 g de levure diluée bailleur de fonds avec 3-4 ml d&#39;eau distillée H 2 O). Ajouter une petite goutte au maïs nourriture de repas et de couvrir les flacons. Laissez sécher pendant au moins une heure pour éviter les mouches adultes coller à la pâte de levure. Mettre une petite goutte de levure diluée dans l&#39;eau sur la surface de l&#39;aliment peut améliorer la ponte. Sinon levure de boulanger pâte, de l&#39;acide acétique à 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suisse A6283-100ML) peut être utilisé. Pour ce faire, tremper le bout d&#39;un coton-tige sur la solution et la propagation sur la surface des aliments de farine de maïs. </li><li> Mettez les mouches adultes (âgés d&#39;au moins quatre jours, mais pas plus de dix jours) dans le maïs flacons alimentaires de repas. Mettez suffisamment d&#39;adultes dans chaque flacon afin d&#39;obtenir des larves suffit de répéter la préférencetester plusieurs fois et permettre une comparaison statistique. Pour croisements génétiques, nous utilisons généralement un minimum de 20 femelles et mâles 5-10 par flacon, mais quelques lignes besoin de plus de femmes à obtenir une progéniture larvaire suffisante. </li><li> Permettre aux adultes de pondre des oeufs pendant 12 heures et les transférer sur de nouveaux flacons. Les adultes peuvent être transférés dans la matinée et la soirée. Nous transférons habituellement les adultes pendant sept à dix jours et si nécessaire prendre de nouvelles adultes. </li><li> Gardez les collections d&#39;œufs prises toutes les 12 heures dans l&#39;incubateur et laisser pousser les larves à 25 ° C, le cycle lumière-obscurité de 12 h à 12 h et 60% d&#39;humidité. Pour tester les composants circadiens du comportement visuel mouvement larves à l&#39;obscurité permanente (DD) 48 heures après la collecte des œufs (correspondant à des cycles de deux clair-obscur). Pour cela, utiliser un incubateur séparé sans lumière, mais gardez toutes les autres conditions telles que la température et l&#39;humidité identiques. Assurez-vous de transférer les flacons à la DD incubateur juste avant le passage à la phase d&#39;obscurité. Avant de déplacer les flacons à another incubateur mis flacons dans une boîte en carton ou envelopper les flacons avec du papier d&#39;aluminium pour éviter exposition à la lumière pendant le transfert (emballage en carton ou l&#39;emballage doit être fait lors de la «lumières sur la phase&quot; avant le décalage entre incubateurs). Empêcher les animaux de toute exposition à la lumière après ce moment et jusqu&#39;au début des expériences. </li><li> Après 4 jours (de 84 à 108 heures de ponte) recueillir début L3 (larves d&#39;alimentation) aux points de temps à tester (voir 4. Essai préférence la lumière, point. 4.4.). </li></ol> 2. Configuration de test <ol><li> Réaliser des expériences dans une pièce sombre avec une température constante et d&#39;humidité. </li><li> Pour garder deux quadrants de la boîte de Pétri dans l&#39;obscurité, recouvrir le couvercle avec du ruban noir et une feuille d&#39;aluminium. Pour ce faire, marquez le centre de la circonférence du couvercle. Aussi marquer quatre points dans la bordure du couvercle à 90 ° de la séparation entre eux. Pour faciliter les choses, tracer un carré de 20 cm divisé en quatre quadrants de 10 cm de longueur sur unefeuille de papier ou avec l&#39;aide d&#39;un ordinateur. Couper 10 cm carrés de papier d&#39;aluminium et ruban noir (figure 1A). Cover deux quadrants opposés par collage un carré de papier d&#39;aluminium, comme première couche et la bande noire recouvrant, veillez à couvrir également la frontière du couvercle. Dans le passé, deux formes légèrement différentes de ce dosages ont été utilisés. Nous utilisons ici le test &quot;quarter-plate&quot;, dans lequel la boîte de Pétri est divisée en quatre quartiers égaux 10. Dans l&#39;alternative essai &quot;demi-plaque&quot; la boîte de Pétri est divisée moitié (moitié exposée à la lumière, la moitié dans l&#39;obscurité) 1,7,8. Jusqu&#39;à aujourd&#39;hui, aucune différence significative entre les deux essais a été publié. </li><li> Collez une feuille de quadrant comme celle utilisée pour le marquage des couvercles droit en vertu de la source de lumière sur la table. Marquez la circonférence d&#39;une boîte de Pétri centré sur l&#39;intersection des quadrants. Utiliser les marques de référence à placer la plaque d&#39;essai toujours dans la même position dans la source lumineuse. </li><li> Installez unelampe, soit une simple ampoule blanche (Phillips, Softtone 5W) ou une lampe LED (lampe LED, 80012 Blanc, Osram) au-dessus de la boîte de Pétri avec l&#39;aide d&#39;une béquille de fer (Fisher Scientific, S47808). Régler la hauteur de façon que la plaque d&#39;essai est tout d&#39;illumination homogène. Nous recommandons fortement l&#39;utilisation de lampes à LED, car ils émettent des longueurs d&#39;onde plus spécifiques que les ampoules classiques. Par ailleurs LED émettent moins de chaleur. </li><li> Ajuster l&#39;intensité lumineuse à l&#39;aide d&#39;un photomètre (Environnement PCE EM882). Pour atteindre l&#39;intensité lumineuse requise de 350 à 760 lux, déplacer la lampe vers le haut ou vers le bas selon les besoins. Brancher la lampe à une alimentation réglable donne plus de souplesse pour modifier les intensités sans déplacer la lampe (figure 1B). </li></ol> 3. Préparation des plaques <ol><li> Faire 200 ml de 2,5% d&#39;agar (Sigma-Aldrich, Suisse A5093-500G) avec de l&#39;eau distillée deux fois (Millipore). </li><li> Placez des boîtes de Pétri sur une table (90 mm de diamètre;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Autriche) en rangées pour permettre versant chaud agarose. </li><li> Faire bouillir l&#39;agarose au micro-ondes jusqu&#39;à ce que la solution est complètement transparent et fluide. Assurez-vous que la solution liquide ne contient pas de bulles. ATTENTION: Transport soigneusement à la table puisque la solution peut être très chaud! </li><li> Verser chaud d&#39;agarose dans des boîtes de Petri jusqu&#39;à ce que toute la surface est couverte de manière homogène par une couche mince de la solution, de deux ou trois millimètres suffisent. Soyez rapide pour éviter agarose solidifier avant de revêtement toutes les plaques. Laissez les plaques refroidir. Stocker les plaques à température ambiante et les utiliser uniquement le jour même de la préparation. </li></ol> 4. Test de préférence la lumière <ol><li> Travailler dans des conditions de lumière rouge dans la salle d&#39;expérimentation afin d&#39;éviter l&#39;influence de lumière avant l&#39;essai depuis la drosophile n&#39;est pas en mesure de détecter des longueurs d&#39;onde de lumière rouge. Utilisez une ampoule rouge (Phillips, PFE712E * 8) monté dans une lampe pour éclairer til lieu de travail. </li><li> Maintenir la température à travers toutes les expériences à 25 ° C. la température de la chambre de commande au moyen d&#39;un dispositif de chauffage ou de refroidissement si nécessaire. </li><li> Prenez un peu de nourriture dans les flacons élevés pour les cycles de deux jours, sous l&#39;obscurité constante (à partir de la section 1). Depuis larves sont habituellement creuse sur la surface de la nourriture, prenez la couche supérieure (environ 5 mm de profondeur) à l&#39;aide d&#39;une spatule (Fisher Scientific, le 14-373-25A). Étaler la nourriture sur la face extérieure d&#39;un couvercle de boîte de Pétri, ajouter un peu d&#39;eau et mélanger délicatement avec la spatule. </li><li> Recueillir l&#39;alimentation des larves L3 de la nourriture. Comme la lumière préférence sera testé, en choisissant seulement début / alimentation des larves L3 est crucial puisque la phototaxis négative est assurée. Late / errance larves L3 ou grand larve rampant sur la nourriture probablement déjà changé leur photobehavior. L&#39;alimentation des larves L3 (phototactic négative) peut être reconnu parce que leurs stigmates antérieurs sont ouverts et saillie vers l&#39;extérieur dans une forme de doigt. Le stigmate postérieurs ont trois ouvertures chacune, et quatre groupes de grands poils ramifiés. Les glandes salivaires s&#39;étendent au second segment abdominal 11. Mise en scène larve sous un microscope est commode alors qu&#39;aucune lumière blanche doit être utilisé. Une lampe à lumière rouge est nécessaire pour éclairer les larves si la mise en scène sous le microscope stéréoscopique avant les expériences sont nécessaires. </li><li> Laver les larves brièvement dans l&#39;eau du robinet et recueillir en début de nourrir les larves de troisième stade (toujours dans la lumière rouge). Avant de transférer les larves de la plaque d&#39;essai, prendre les larves avec un pinceau humide et absorber l&#39;excès d&#39;eau soigneusement avec une serviette en papier ou papier filtre. Ne séchez pas excessivement les larves trop car cela pourrait nuire à l&#39;animal et d&#39;influencer son comportement. </li><li> En utilisant le pinceau humide transférer soigneusement les larves de plaques. Placer un groupe d&#39;environ 30 larves dans le centre de la plaque. Recouvrir la plaque avec le couvercle déjà préparé avec les quadrants et mettre la plaque sous la source de lumière prêt pour l&#39;expérience (voir section 2). </li><li> Allumez la lampe de lumière blanche et lancer le chronomètre. Laissez la larve se déplacer librement sur la plaque pendant 5 min, puis retirez rapidement le couvercle et compter le nombre de larves dans l&#39;obscurité et dans les quadrants légers. Repérage de la position de chaque larve avec un marqueur peut faciliter le comptage. Vous pouvez également prendre une photo de la plaque et compter a posteriori. Les larves montrant préférence de lumière claire, comme les larves rampant sur les murs ou creuser dans de la gélose doit être considérée comme préférence neutre et juste être inclus dans le nombre total de larves lorsque l&#39;indice de préférence la lumière est calculée. </li><li> Après le dépouillement, jeter la plaque avec les larves et les remplacer par une nouvelle plaque d&#39;essai pour la prochaine expérience. Recueillir plaques utilisées dans un sac en plastique autoclave pour la manipulation et l&#39;élimination ultérieure. </li><li> Une fois que vous avez effectué un nombre suffisant d&#39;expériences, un nouveau génotype peut être testé. 10-15 essais par génotype sont suffisants pour l&#39;analyse. </li></ol> 5. Données Analysis <ol><li> Pour plus de commodité transférer les données à une fiche technique en Excel (Microsoft) ou origine (Laboratoire d&#39;origine) sur un ordinateur pour une analyse statistique. Disposer dans une colonne le nombre d&#39;animaux dans l&#39;obscurité, dans une deuxième colonne le nombre d&#39;animaux dans les quadrants légers et dans la troisième le total d&#39;animaux dans la plaque (y compris les larves &quot;neutre&quot;). </li><li> Calcul de l&#39;indice de préférence (PREF) à l&#39;obscurité pour chaque expérimentation en utilisant la formule suivante: PREF (obscurité) = (nombre de larves dans l&#39;obscurité - nombre de larves à la lumière) / nombre total de larves </li><li> Comparer statistiquement un ensemble de données par une analyse appropriée pour les groupes. Ici, nous utilisons un test de Wilcoxon pour comparer statistiquement les deux groupes. Un test ANOVA avec comparaison multiple de Tukey test post hoc peut être fait, si hypothèse de distribution normale est accomplie dans une comparaison avec un groupe de collecteur. </li><li> Faire des graphiques qui montrent clairement des comparaisons entre les lignes et de points de temps au long du cycle jour. WE à utiliser le logiciel Origin (Laboratoire d&#39;origine) pour tester la signification statistique et générer des graphiques appropriés, mais tout autre logiciel statistique peut être utile. </li></ol>

<ol>
	<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development.">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li><li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates.">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li><li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons.">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li><li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall.">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li><li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptors:+unconventional+ways+of+seeing.">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li><li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor.">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li><li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment.">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li><li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference.">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li><li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=smellblind:+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction.">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Pittendrigh, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+systems:+Entrainment.">Circadian systems: Entrainment.</a> Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, 95-124 (1981).</li><li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+Activity+between+LN(v)s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila.">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li><li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+the+light:+photobehavior+in+fruit+fly+larvae.">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Le test de préférence la lumière décrit tire parti de la photobehavior innée larvaire. Le test est facile à mettre en place, permet de nombreuses répétitions à faible coût et fournit de précieuses informations sur la détection et le traitement de lumière. Le paradigme expérimental permet la quantification relativement rapide du nombre de personnes préfèrent clair ou foncé. Cette préférence peut être affiché sous forme de pourcentages bruts ou encore comme indice de préférence (PREF). Le PREF est e...

Nous décrivons ici une analyse comportementale basée sur la préférence pour les larves foncé (ou clair). Les larves réagissent avec une réponse forte et stéréotypé photonegative pendant les phases de recherche de nourriture (L1 à L3 tôt) 1. L&#39;essai a pour but d&#39;évaluer le comportement photophobes de la larve et compare la préférence claire ou foncée d&#39;un groupe de larves se déplaçant librement dans une boîte de Petri revêtue de gélose. Cette analyse comportementale non seulement fournit des informations sur la plasticité sensibilité, l&#39;intégration et temporelle du système visuel, il prévoit en outre des conseils sur la façon de sensibilité à la lumière et son processus est contrôlé par le système circadien. La larve oeil drosophile (aussi appelé orgue Bowlig; BO), est le principal organe de perception de la lumière. Chaque œil est composé de 12 photorécepteurs (PR), huit PR expriment le rhodopsin6 sensible au vert (rh6) et quatre PR expriment le rhodopsin5 sensible au bleu (RH5) 2,3. En plus de PR, salo classe neurones multidendritic IV, qui couvrent la paroi du corps larvaire, ont été identifiées pour répondre aux intensités lumineuses nuisibles 4,5. Il est également connu que les neurones pacemakers situés dans le cerveau des larves central expriment la lumière protéine Cryptochrome sensible (Cry) qui agit comme horloge capteur de lumière bleu intrinsèque dans le cerveau 6,7. Curieusement photophobicity des animaux de type sauvage montre une composante circadienne à différents moments au cours de la journée et de la nuit lors de l&#39;essai avec ce dosage. Les réponses à la lumière de butinage larve L3 montré fort photophobicity à l&#39;aube et au crépuscule photophobicity inférieur lors des tests de préférence clair-obscur 7. Il est intéressant que RH5-PR sont nécessaires pour éviter la lumière, tandis que Rh6-PR sont indispensables. Les deux, RH5-PR et Rh6-PR sont impliqués dans réinitialisation de l&#39;horloge moléculaire par la lumière 8. La voie de Cry doit être coordonnée avec les autres voies de détection de lumière pour orchestrer une sortie comportement approprié dans lecourant de la journée. Acétylcholine dans les PR joue un rôle essentiel dans le comportement d&#39;évitement de lumière ainsi que l&#39;entraînement de l&#39;horloge moléculaire. Blocage de la neurotransmission de l&#39;acétylcholine à partir de neurones PN du stimulateur circadien réduit la réponse photophobes dans le dosage de préférence de lumière-obscurité 8. Employant le même dosage, deux paires symétriques de neurones ont été récemment identifiées pour passer la préférence lumière du troisième stade larvaire de la drosophile 9. Ces deux paires de neurones peuvent être fonctionnent pendant les stades larvaires fin, lorsque les animaux quittent la nourriture pour trouver probablement un site de nymphose approprié. Cependant, la question de savoir comment les voies visuelles interagir et de contrôler le comportement visuel des larves de façon circadienne reste largement sans réponse. Le test de préférence la lumière permet des comparaisons entre les points dans le temps circadiens, Soies et l&#39;état circadien sous différentes qualités de lumière. Le test est facile à préparer et peu coûteux et a été utile précédemment in plusieurs laboratoires pour décrire et étudier le comportement dérivé de la lumière dans la larve.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5093-500G</td>
 <td>2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Greiner Bio-One GmbH</td>
 <td>633180</td>
 <td>90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LEDs Lamp</td>
 <td>OSARAM </td>
 <td>80012 White</td>
 <td>LED lamp, 80012 White</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Environment Meter</td>
 <td>PCE</td>
 <td>PCE EM882</td>
 <td>Lux, Temp, RH%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermostatic cabinet</td>
 <td>Aqua Lytic (Liebherr)</td>
 <td>ET636-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light timer</td>
 <td>Timer T</td>
 <td>6185.104</td>
 <td>230V/50HZ (check specifications for your country)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Universal thermostat</td>
 <td>Conrad</td>
 <td>UT200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Humidifier</td>
 <td>Boneco</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balck tape</td>
 <td>Tesa</td>
 <td></td>
 <td>5 cm </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glue</td>
 <td>Uhu</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>lncubator lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>Softtone</td>
 <td>5W</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Timer clock</td>
 <td>Ziliss</td>
 <td></td>
 <td>Ziliss, Switzerland</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Excel Software</td>
 <td>Microsoft</td>
 <td></td>
 <td>Excel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Origin Software 8.5</td>
 <td>OriginLab</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Backer Yeast</td>
 <td>Migros Switzerland</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iron support stand 17X28CM</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>S47808</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>A6283-100ML</td>
 <td>20% acetic acid dilluted in H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Red light lamp</td>
 <td>Phillips</td>
 <td>PFE712E*8C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spatula </td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-373-25A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>EA</td>
 <td>EA PS 2042-06B</td>
 <td>Optional</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminium foil</td>
 <td>Prix Coop</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heater</td>
 <td>GOON</td>
 <td>NSB200C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microwave Oven</td>
 <td>Intertronic</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard corn meal fly food</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Destilled water </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in drosophila larvae

La lumière agit comme signal environnemental pour contrôler le comportement des animaux à différents niveaux. Le système nerveux des larves de Drosophila est utilisé comme un modèle unique pour répondre aux questions de base sur la façon dont l&#39;information est traitée lumière et partagée entre les comportements rapides et circadien. Larves de drosophile afficher un comportement d&#39;évitement stéréotypé lorsqu&#39;il est exposé à la lumière. Pour étudier les comportements dépendant de la lumière des tests comparables simples de préférence lumière-obscurité peuvent être appliquées. Chez les vertébrés et les arthropodes les circuits neuronaux impliqués dans la détection et le traitement des stimuli visuels se chevauchent partiellement avec celles traitement photic informations circadien. La question fascinante de la façon dont le système de détection de la lumière et le système circadien interagissent pour maintenir sorties comportement coordonné reste largement inexploré. Drosophile est un modèle impact biologique d&#39;aborder ces questions, en raison d&#39;un petit nombre de neurones dans le cerveau et la disponibilité des outils génétiques pour manipul neuronaleation. Le test de préférence de lumière-obscurité présenté permet d&#39;étudier une gamme de comportements visuels, y compris le contrôle circadien de phototaxis.

En suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons testé préférence clair-obscur en début du troisième stade larvaire de type sauvage Canton-S vole à deux fois circadiens différents CT0 et CT12. Les adultes ont été élevés à 12 h à la lumière de 12 heures sombres et laissés à pondre des œufs pendant 12 heures. Larves se développent les deux premiers jours sous le même régime de lumière-obscurité. Comme nous voulions tester modulation circadienne dans des conditions constantes (course libre de l&#...

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Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Nous décrivons ici un test de préférence de lumière-obscurité pour Drosophila larve. Ce test fournit des informations sur la réglementation innée et circadien de photobehavior détection et le traitement de la lumière.

Essai de préférence la lumière pour étudier innée et circadien Photobehavior Réglementé<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

light-preference-assay-to-study-innate-circadian-regulated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

12.8K vues.  University of Fribourg. Nous décrivons ici un test de préférence de lumière-obscurité pour Drosophila larve. Ce test fournit des informations sur la réglementation innée et circadien de photobehavior détection et le traitement de la lumière.

Vidéo: Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Recherche

Neurosciences

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Dosage activité locomotrice d&#39;étudier les rythmes circadiens et le sommeil dans les paramètres Drosophile</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Measuring Circadian and Acute Light Responses in Mice using Wheel Running Activity

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2. They are responsible for timing our sleep/wake cycles and hormone secretion. Since this timing is not precisely 24-hours, it is synchronized to the solar day by light input. This is accomplished via photic input from the retina to the suprachiasmatic nucleus (SCN) which serves as the master pacemaker synchronizing peripheral clocks in other regions of the brain and peripheral tissues to the environmental light dark cycle3-7. The alignment of rhythms to this environmental light dark cycle organizes particular physiological events to the correct temporal niche, which is crucial for survival8. For example, mice sleep during the day and are active at night. This ability to consolidate activity to either the light or dark portion of the day is referred to as circadian photoentrainment and requires light input to the circadian clock9. Activity of mice at night is robust particularly in the presence of a running wheel. Measuring this behavior is a minimally invasive method that can be used to evaluate the functionality of the circadian system as well as light input to this system. Methods that will covered here are used to examine the circadian clock, light input to this system, as well as the direct influence of light on wheel running behavior.

This article will review methods that can be used to determine circadian function and light responsiveness in mice.

Mesurant les réponses Lumière circadiens et aiguë chez la souris en utilisant l&#39;activité roue qui tourne

Circadian rhythms are physiological functions that cycle over a period of approximately 24 hours (circadian- circa: approximate and diem: day)1, 2.  They ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Méthodes locales et globales de l&#39;évaluation de nociception thermique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appétitive apprentissage olfactif associatif en<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Goût préférence Essai pour adultes<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nouveau test pour froid dans nociception<em&gt; drosophile</em&gt; larves

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...