Les auteurs tiennent à remercier Emilija Renke et Janet Yu pour l&#39;assistance technique. DCN est soutenu par des subventions du ministère américain de la Défense (DR080205, DM102823, OR09055 et OR090059). RDH est soutenu par une subvention de la station de Maryland Expérience agriculture et une subvention de formation NIH en biologie cellulaire et moléculaire.

1. Détermination des conditions optimales de chauffage Tout d&#39;abord, il faut déterminer expérimentalement la température d&#39;incubation optimal et le temps d&#39;utilisation de l&#39;étape de chauffage dans l&#39;essai. Pour notre modèle PlyC, il est important de noter que E. coli co-transformées avec les gènes et plyCA plyCB sur des plasmides d&#39;expression distincts a été montré pour former une holoenzyme entièrement fonctionnel PlyC 6. Les 96 préparation bien microplaque ainsi que les conditions de croissance des cellules et la technique de reproduction ultérieure de placage ont été adaptés à partir des exemples fournis dans la littérature 12-16. Un temps d&#39;incubation de 30 min sera approprié pour cet essai que les résultats des précédentes expériences d&#39;inactivation thermique dicter une perte rapide de l&#39;activité au cours de courte durée d&#39;incubation dans des environnements dépassant la température physiologique (observation non publiée). La température d&#39;incubation optimal pour PlyC a été élucidée par les étapes suivantes: <ol><li> Transform la construction d&#39;expression pBAD24: plyCA (Amp r) dans l&#39;compétente E. coli souche DH5a pBAD33: plyCB (Cm r). </li><li> Plaque des transformants sur une plaque de gélose Luria-Bertani (LB) additionné d&#39;ampicilline (100 pg / ml) et le chloramphénicol (35 mg / ml). Incuber les plaques pendant la nuit à 37 ° C. </li><li> Avec un cure-dent stérile, inoculer une colonie individuelle dans chaque rangée de puits (Figure 2a) dans un 96 stérile, limpide, à fond plat et, à couvercle de microplaque contenant 200 pl de LB additionné d&#39;ampicilline et le chloramphénicol. </li><li> Solidement placer la plaque de microtitration à 96 puits sur un 37 ° C incubateur agitateur et la croissance des bactéries pendant la nuit à 300 rpm. </li><li> Récupérez la plaque de 96 puits de microtitration à partir de 37 ° C incubateur agitateur et la plaque de réplique à une nouvelle plaque de 96 puits de microtitration comme suit: <ol class="lalpha"><li> Ajouter 180 ul de LB additionné d&#39;ampicilline et au chloramphénicoldans chaque puits de la plaque de réplique. </li><li> Transférer 20 ul de bactéries de la plaque d&#39;origine dans les puits correspondants de la plaque de réplique. Cela devrait se traduire par une DO initiale 600 de ~ 0,5. </li></ol></li><li> Solidement placer la plaque sur la réplique 37 ° C incubateur agitateur et incuber la plaque pendant 1 heure à 300 tours par minute, puis ajouter le inductant. Dans le cas des systèmes d&#39;expression pBAD, l&#39;arabinose inductant est de 0,25%. Autres systèmes d&#39;expression peut exiger inductants différentes. Placez la plaque arrière sur le 37 ° C incubateur agitateur et agiter à 300 rpm pour une période supplémentaire de 4 heures pour permettre l&#39;expression des protéines. Les niveaux d&#39;expression varient généralement entre 10-20 g de PlyC. </li><li> Expression de la protéine une fois terminé, récupérer la plaque de culot réplique et les bactéries en plaçant la plaque de microtitration 96 puits dans une centrifugeuse réfrigérée qui contient un rotor oscillant godet qui correspond à des plaques de microtitration 96 puits. Centrifuger à 3000 rpm pendant 10 min à température ambiante.</li><li> Eliminer le surnageant par les médias lentement inverser la plaque de microtitration et doucement décantation des médias. </li><li> Lyser les cellules en ajoutant 50 pl de B-PER II Réactif d&#39;extraction de protéines bactériennes dans chaque puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Augmentez le volume dans chaque puits à 120 ul par addition de 70 ul de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,2. </li><li> Pellet les débris insolubles cellulaire en faisant tourner la plaque à 3000 rpm pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. </li><li> Transfert 110 pi du lysat brut soluble dans les puits correspondants d&#39;une plaque 96 thermocycleur bien. </li><li> 30 min en utilisant le temps d&#39;incubation prédéterminé, exposer les lysats solubles résidant actuellement dans la plaque 96 puits thermocycleur à une gamme de gradient de température couvrant une large 15-20 ° C. Notez, le but est de déterminer à quelle température une enzyme particulière perd&gt; 95% l&#39;activité catalytique. </li><li> Après incubation, incuber la 96 puitsthermocycleur plaque à 4 ° C pendant 5 min et 100 pi de transférer les lysats solubles de la plaque 96 thermocycleur bien à leur endroit bien correspondant à la 96 final ainsi microplaque. </li><li> Avec un multipipettor 12 canaux, ajouter 100 ul de souche D471 GAZ à chaque puits. Remarque, D471 cellules lyophilisées sont à l&#39;origine de cultures de la nuit et remises en suspension dans du PBS pH 7,2 pour obtenir une DO 600 de ~ 2,0. </li><li> Placez immédiatement la plaque 96 puits dans le spectrophotomètre pour microplaques et contrôler la cinétique enzymatique en mesurant la DO 600 toutes les 15 secondes pendant 20 min. La plus basse température d&#39;incubation qui correspond à un puits qui ne disposent pas de changement de la densité optique (ADO ≤ 0,1) est définie comme la température non permissive. </li></ol> Après un écran large de température est réalisée afin d&#39;identifier la température non permissive, les étapes ci-dessus peut être répété sur une gamme plus étroite de températures (5 ° -10 ° C) pour éluciderla précision de température non permissive pour l&#39;enzyme d&#39;intérêt. Remarque, la température non permissive identifiés dans ce dosage peut être différente de la température de fusion élucidé par d&#39;autres moyens en raison de différences de volume, concentration, etc 2. Génération Mutant la Bibliothèque La création de la banque de mutants à être projeté au hasard consiste à intégrer les mutations d&#39;une ADN polymérase d&#39;erreurs avec un biais minimal de nucléotides dans le gène plyCA utilisant le kit de mutagenèse aléatoire GeneMorph II comme suit: <ol><li> Concevoir des amorces nucléotidiques avec des températures de fusion similaires (T m) entre 55-72 ° C avec les sites de restriction de choix à l&#39;extrémité 5 &#39;et 3&#39; du gène extrémités plyCA. </li><li> Puisque le taux de mutation souhaitée est de 2-3 nucléotides par plyCA (1,4 kb), utiliser les concentrations des composants de la réaction de PCR ainsi que les conditions thermocycleur recommandés par le fabricant pour f mutation basrequencies (0 à 4,5 par ko). </li><li> Cloner les gènes mutés plyCA dans le vecteur d&#39;expression pBAD24. </li><li> Transformer les concepts en un DH5a pBAD33: fond plyCB et les transformants plaque sur des plaques d&#39;agar LB additionné d&#39;ampicilline et le chloramphénicol. </li><li> En outre, de transformer et de la plaque DH5a pBAD33: plyCB avec le vecteur d&#39;expression contenant le gène pBAD24 WT plyCA. Colonies de cette plaque servira les contrôles en cours de sélection. </li></ol> 3. 96 Préparation Eh bien microplaque et les conditions de la croissance cellulaire <ol><li> Remplir chaque puits d&#39;une plaque de microtitration à 96 puits avec 200 ul de LB additionné d&#39;ampicilline et le chloramphénicol. </li><li> Après le schéma plaque de microtitration (Figure 2b), sélectionner avec soin une colonie individuelle des plaques de gélose au jour le jour avec un cure-dent stérile et inoculer les bactéries dans la pla désigné puits de la microplaque de 96 puitste. Il est essentiel de veiller à une seule colonie par puits inoculés. </li><li> Agiter le solidement ancré plaque de 96 puits de microtitration à 300 tpm pendant la nuit à 37 ° C. </li></ol> 4. Placage réplique, induction de l&#39;expression des protéines et préparation de lysat <ol><li> Suivez les étapes 1.5 à 1.11 de la section intitulée «Détermination des conditions optimales de chauffage&quot; avec une modification. Stocker la plaque originale à 4 ° C après l&#39;étape de plaquage réplique a conclu. </li><li> Après l&#39;étape 1.11, le transfert de 110 pl du lysat brut soluble dans les puits correspondants d&#39;une plaque 96 thermocycleur bien sauf pour le contrôle positif puits A1-D1. En ce qui concerne les lysats témoins positifs (c.-à-lysats qui ne sont pas chauffées), le transfert de 100 ul des lysats dans les puits correspondants dans une nouvelle plaque de 96 puits de microtitration qui servira de plaque de dosage final de l&#39;expérience et de stocker de la glace. </li></ol> 5. Soluble traitement thermique Lysate <ol><li> Chauffer le contrôle négatif et soluble mutant lysats sont actuellement enfermées dans la plaque 96 thermocycleur bien dans le thermocycleur pendant 30 minutes à la température d&#39;incubation non permissif optimisé déterminé à l&#39;étape 1. </li><li> Après incubation à température non permissive, incuber la plaque à 96 thermocycleur bien à 4 ° C pendant 5 min. </li><li> Transférer 100 ul des lysats solubles de la plaque 96 thermocycleur et à leurs emplacements de puits identiques lors de la finale plaque de 96 puits d&#39;essai de microtitration contenant déjà les lysats témoins positifs solubles. </li><li> Avec un multipipettor 12 canaux, ajouter 100 ul de souche D471 GAZ à chaque puits. Placez immédiatement la plaque dans le spectrophotomètre pour microplaques. </li><li> Surveiller la cinétique enzymatique en mesurant la DO 600 toutes les 15 secondes pendant 20 min. <ol class="lalpha"><li> Une variante avec PlyC comportement thermique avancé est défini comme une construction qui peut diminuer la densité optique d&#39;origine de 50 pour cent en moins de 900 secondes à l&#39;température non permissive. En outre, les contrôles positifs (c&#39;est à dire non-chauffée, WT PlyC) doivent afficher WT activité catalytique (t 1/2 ≤ 100 s) et les témoins négatifs (c.-à-chauffé, WT PlyC) devrait être dépourvu d&#39;activité. </li></ol></li><li> Une fois avec une variante PlyC progressé comportement thermique est identifié, récupérer la plaque originale conservée à 4 ° C et les bactéries ensemencer de l&#39;individu spécifique et pour le mutant d&#39;intérêt en milieu LB frais additionné d&#39;ampicilline et au chloramphénicol. La croissance de l&#39;inoculum nuit à 37 ° C. </li><li> Extraire et purifier l&#39;ADN plasmidique de la culture et soumettre ensuite pour le séquençage afin d&#39;identifier les mutations de nucléotides qui signifient comportement thermique amélioré à PlyCA. En outre, en complément d&#39;une petite aliquote de la culture d&#39;une nuit avec 10% de glycérol et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole, présenté dans la figure 1, présente un 96 méthodologie bien microplaque qui permet d&#39;utiliser l&#39;évolution dirigée d&#39;augmenter la thermostabilité d&#39;une enzyme bactériolytique. Grâce à l&#39;utilisation d&#39;une ADN polymérase d&#39;erreurs, on peut introduire des mutations aléatoires qui augmentent la stabilité globale cinétique de la molécule traduit bactériolytique d&#39;intérêt, ce qui est généralement dû à des réorganisations moléculaires consistant à augmenter électrostatique, hydrophobe pont disulfure et les interactions qui génèrent améliorée empilement moléculaire, des modifications amélioration des réseaux de charge de surface ou le renforcement d&#39;un état ​​supérieur d&#39;oligomérisation 17-18. Après l&#39;introduction de mutations nucléotidiques, une procédure de sélection rigoureux a ensuite été utilisé pour identifier les mutations qui sont thermiquement bénéfique. Les résultats représentatifs présentés ici ont été basées sur un cycle de mutagenèse aléatoire. En réalité, il a été suggéré queau moins trois cycles successifs de mutagenèse aléatoire, chacun utilisant le mutant le plus robuste que l&#39;enzyme tête, suivie par réarrangement d&#39;ADN est approprié pour ces types d&#39;études d&#39;évolution dirigée de comportement thermique 2. Il est important de comprendre que même si ce protocole identifie des mutations qui augmentent la stabilité cinétique, ces variantes ne sont pas nécessairement thermostabilité accrue. Une molécule est considérée thermostable quand il a la capacité de conserver sa structure, à une température élevée. Toutefois, dans l&#39;essai présenté, l&#39;activité résiduelle des lysats mutants ne sont pas analysés à la même température que ils ont été initialement mis à incuber pendant l&#39;étape de traitement thermique et donc ne peut être la sélection de mutations qui favorisent le repliement plutôt que thermostabilité renforcée 19. Bien que nous soyons d&#39;extrapoler le comportement thermique comme une indication de la stabilité thermique, véritable stabilité thermique doit être mesurée de manière empirique par biophysiquetiques des méthodes telles que le dichroïsme circulaire (CD), la calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et fluorimétrie différentielle à balayage (DSF). Les données préliminaires d&#39;expériences de CD et DSF suggèrent que plusieurs candidats identifiés à partir de la méthodologie présentée en effet afficher thermostabilité progressé (données non présentées). Bien que la méthodologie présentée ici est spécifique à la mise en œuvre augmenté comportement thermique de PlyC, cette même méthodologie peut en outre être utilisé pour améliorer l&#39;activité thermique à d&#39;autres enzymes bactériolytiques avec quelques modifications mineures à des variables telles que des tampons, des taux de mutation, les conditions de chauffage et de systèmes d&#39;expression. Une variable critique associé à ce test concerne le taux de mutation nucléotidique de l&#39;ADN polymérase d&#39;erreurs. Nous avons choisi d&#39;utiliser la polymérase erreurs Mutazyme ADN II dans notre analyse de l&#39;évolution dirigée en raison de preuves expérimentales suggérant cette enzyme affiche le moins de biais avecquant à ce qui nucléotides au hasard incorporé dans le gène d&#39;intérêt par rapport à d&#39;autres techniques de mutagenèse aléatoire, comme l&#39;utilisation de l&#39;hydroxylamine, mutator E. coli et d&#39;autres erreurs ADN polyermases 20. En général, les taux de mutation plus faibles ont tendance à être plus souhaitable pour deux raisons. Tout d&#39;abord, la thermostabilité de l&#39;ingénierie des protéines consiste généralement en relativement peu de substitutions d&#39;acides aminés. Taux de mutation élevés peut provoquer des altérations structurelles dramatiques à des molécules particulières qui peuvent résulter de façon concluante dans le mauvais repliement structurelle et anomalie de fonctionnement. Par exemple, l&#39;incorporation de la glycine et de résidus proline peuvent perturber alpha structures hélicoïdales secondaires 21. Deuxièmement, les taux élevés de mutations de nucléotides augmenter les chances d&#39;intégrer des codons stop prématurés, ce qui entraîne des molécules tronquées qui sont biologiquement inactifs. En général, les taux de mutation plus faibles sont préférés car d&#39;erreur plus faible taux de résultat dans le accumultion des mutations adaptatives alors que les taux de mutation plus élevés générer des mutations neutres ou nuisibles 22. Pour chaque tour de mutagenèse aléatoire, une autre variable essentielle que l&#39;on doit optimiser implique la température d&#39;incubation utilisé pendant le processus de sélection. Sélection de l&#39;expérimental température non permissive est relativement difficile. Nous avons d&#39;abord utilisé une température d&#39;incubation qui était de 10 ° C supérieure à la température non permissive de PlyC, mais après criblage de mutants 3000, nous avons été incapables d&#39;identifier les mutations avantageuses. Gardant à l&#39;esprit les méthodes d&#39;évolution dirigée consistent à identifier séquentiellement bénéfiques substitutions d&#39;acides aminés qui ont des effets additifs, il a été déterminé que la température moins rigoureuse doit être utilisé pendant le processus de sélection, même si elle a augmenté le risque de générer des faux positifs. En tant que tel, nous avons utilisé une température d&#39;incubation qui n&#39;était que de quelques degrés au-dessus du non-admtempérature ive et retamisé candidats sélectionnés pour exclure les faux positifs. Nous avons décidé d&#39;utiliser une température d&#39;incubation qui n&#39;était pas trop tempéré (≤ 1 ° C plus élevée à la plus basse température non permissive) et, inversement, pas trop sévère (≥ 5 ° C plus élevée à la plus basse température non permissive). La température idéale, nous avons décidé d&#39;utiliser dans cet essai particulier était de 2 ° C de plus modéré que le déterminées expérimentalement température non permissive. Le choix d&#39;une température trop douce se traduira par un taux beaucoup plus élevé de faux positifs d&#39;identification de l&#39;~ 20%, nous avons observé (tableau I) lorsque vous utilisez une température d&#39;incubation modérée. De plus, en utilisant une température d&#39;incubation qui est trop sévère pourrait finalement aboutir à l&#39;impossibilité d&#39;identifier des mutants avec le comportement thermique nettement améliorée. Par exemple, en utilisant une température d&#39;incubation de ≥ 5 ° C aurait entraîné l&#39;impossibilité d&#39;identifier l&#39;promettant mutant 29C3 ainsi que la majorité des autres candidats sélectionnés lors du premier tour de dépistage. En résumé, nous proposons un protocole d&#39;enzymes d&#39;ingénierie bactériolytiques d&#39;acquérir une meilleure stabilité cinétique. En outre, ce même test, sans que les étapes de chauffage, peuvent être utilisés pour cribler des mutations qui augmentent l&#39;activité catalytique. Augmentant à la fois l&#39;activité catalytique et une thermostabilité est un obstacle important au développement face à une enzyme thérapeutique. Bien que les détails de ce protocole sont spécifiques à la PlyC endolysine, la méthodologie peut être adaptée à n&#39;importe quelle enzyme bactériolytique avec seulement quelques modifications. Nous avons présenté les résultats préliminaires à partir de seulement le premier tour de mutagenèse qui valide le fait que la fonctionnalité de l&#39;essai, ce qui entraîne la mise en œuvre et l&#39;identification de mutations qui génèrent une augmentation de la thermostabilité moléculaire de grande ampleur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> B-PER II Reagent Extraction des protéines bactériennes </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Kit mutagenèse aléatoire </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Effacer 96 puits, microplaque à fond plat avec couvercle </td><td> BD Vacutainer Labware médicale </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 puits Plaques PCR Nonskirted </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Rotor </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Sel de sodium de l&#39;ampicilline </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Le chloramphénicol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 vecteur d&#39;expression </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 vecteur d&#39;expression </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

L&#39;évolution dirigée est définie comme une méthode pour exploiter la sélection naturelle, afin de concevoir des protéines d&#39;acquérir des propriétés particulières qui ne sont pas associés à la protéine dans la nature. La littérature a fourni de nombreux exemples concernant la mise en œuvre de l&#39;évolution dirigée pour réussir à modifier la spécificité moléculaire et la catalyse 1. Le principal avantage d&#39;utiliser l&#39;évolution dirigée au lieu de plus rationnel des approches d&#39;ingénierie moléculaire concerne le volume et la diversité des variantes qui peuvent être criblés 2. Une application possible de l&#39;évolution dirigée consiste à améliorer la stabilité structurale des enzymes bactériolytiques, comme endolysins. Bactériophages coder et exprimer endolysins pour hydrolyser une liaison covalente critique dans le peptidoglycane (c.-à-mur cellulaire) des bactéries, ce qui entraîne la lyse des cellules hôte et la libération des virions descendants. Notamment, ces enzymes possèdent la capacité d&#39;induire la lyse extrinsèquement à susceptIble bactéries en l&#39;absence du phage et de plus ont été validées à la fois in vitro et in vivo pour leur potentiel thérapeutique 3-5. L&#39;objet de notre étude de l&#39;évolution dirigée implique la PlyC endolysine, qui est composé de sous-unités PlyCA et PlyCB 6. Lorsque purifiée et a ajouté extrinsèquement, l&#39;holoenzyme PlyC lyse streptocoques du groupe A (SGA) ainsi que d&#39;autres groupes de streptocoques dans une affaire de secondes et a en outre été validés in vivo contre GAZ 7. De manière significative, le suivi cinétique enzymatique résiduelle après incubation à température élevée fournit une preuve distincte qui perd PlyC activité lytique brusquement à 45 ° C, ce qui suggère une courte durée de vie thérapeutique, ce qui peut limiter le développement supplémentaire de cette enzyme. D&#39;autres études révèlent le manque de stabilité thermique est observée uniquement pour la sous-unité PlyCA, tandis que la sous-unité PlyCB est stable jusqu&#39;à ~ 90 ° C (observation non publiée). En plus de PlyC, il existe slusieurs exemples dans la littérature qui décrivent la nature thermolabile de endolysins. Par exemple, le Staphylococcus aureus endolysine LysK et Streptococcus pneumoniae endolysins caporal-1 et Pal perdre activité spontanée à 42 ° C, 43,5 ° C et 50,2 ° C respectivement 8-10. Selon l&#39;équation d&#39;Arrhenius, qui concerne la vitesse d&#39;une réaction chimique à la température présente dans le système particulier, une augmentation de la thermostabilité sera en corrélation avec une augmentation de l&#39;espérance de durée de vie 11. À cette fin, l&#39;évolution dirigée a été montré pour être un outil utile pour altérer l&#39;activité thermique des molécules différentes dans la nature, mais jamais a cette technologie particulière été exploitée avec succès pour l&#39;étude des enzymes bactériolytiques. De même, les comptes de succès de faire progresser la stabilité structurelle de cette classe d&#39;antimicrobiens au total sont inexistants. Dans cette vidéo, nous utilisons une nouvelle méthodologie qui utilise une erreur prune ADN polymérase suivie d&#39;un processus de sélection optimisée à l&#39;aide d&#39;un format de 96 puits de plaque de microtitration pour identifier des mutations de la sous-unité de la PlyCA endolysine PlyC streptocoques qui sont associés à une augmentation de la stabilité cinétique enzymatique (Figure 1). Résultats après un seul tour de mutagenèse aléatoire suggèrent que la méthodologie est la génération variantes PlyC qui conservent plus de deux fois l&#39;activité résiduelle par rapport au type sauvage (WT) PlyC après traitement à température élevée.

A l&#39;issue du premier tour de mutagenèse aléatoire, plus de 6000 mutants PlyC ont été examinées et un total de 35 mutants ayant un comportement thermique augmentation potentielle ont été identifiés, sélectionnés et séquencés. L&#39;analyse génomique, résumés dans le tableau I, indiquent que des candidats 35, 7 des constructions contenues WT séquences PlyCA au niveau de la traduction, ce qui correspond à des faux positifs identifiés par l&#39;analyse. Sur les 28 candidats restants, la gamme de mutation était de 1 à 6 mutations nucléotidiques avec un taux moyen de mutation de 2,75 nucléotides par plyCA gène, qui était dans la fourchette de 2-3 mutation nucléotidique nous ciblons. Au niveau de la traduction, cette gamme de mutation nucléotidique particulière et a abouti à la fréquence d&#39;une mutation d&#39;acide aminé gamme de 1 à 5 acides aminés, avec un taux de mutation moyenne de 1,9 mutations d&#39;acides aminés par PlyCA polypeptide. Sur les 28 candidats ayant au moins un acide aminé Mutation, quatre de ces constructions mutantes ont été choisies au hasard pour une caractérisation plus poussée afin de valider que le processus de sélection rigoureux de la méthodologie de l&#39;évolution dirigée a été en effet de fonctionner correctement. Les enzymes mutantes PlyC ont été purifiés à l&#39;homogénéité&gt; 95% sur la base analyse SDS-PAGE comme décrit précédemment 6-7. La cinétique enzymatique d&#39;WT PlyC et chacun des quatre mutants ont été caractérisés à PlyC concentrations molaires égales après incubation des enzymes purifiées à diverses températures élevées. L&#39;activité a été contrôlé après l&#39;ajout de GAZ D471 en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les 15 secondes pendant 20 min. L&#39;activité a été définie comme la vitesse maximale résiduelle de l&#39;enzyme après une incubation de chaleur. Parmi les quatre candidats choisis au hasard pour une caractérisation plus poussée, mutant 29C3 a montré le comportement le plus thermique renforcée. Le comportement thermique du WT PlyC et 29C3 a été étudiée à différentes températures pendant l&#39;incubation et le dosage de l&#39;activité dans le PBS pH 7,2 à80 nM et 40 nM, respectivement les concentrations. Les expériences 45-50 ° C d&#39;incubation (figure 3) ont été réalisées dans un thermocycleur où les échantillons ont été incubés dans une paroi mince plaque de 96 thermocycleur puits dans un volume total de 120 pl. Le 35 ° C, 40 ° C et 45 ° C expériences d&#39;incubation (figure 4 et 5) ont été réalisées dans un bloc de chaleur où les échantillons ont été incubés dans un tube de 1,5 ml dans un volume total de 1,3 ml. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. WT PlyC et 29C3 n&#39;a montré aucune différence significative de la stabilité cinétique à la température ambiante (25 ° C) comme décrit dans le premier jeu de barres sur la figure 3. Cependant, après une incubation de courte durée de 30 min à des températures comprises entre 45-50 ° C, l&#39;activité de 29C3 a été sensiblement supérieure à l&#39;activité spécifique de la construction HT au niveau de chaque point de température. Par exemple, WT PlyC affiché une perte de 44% de l&#39;activité à 45,2° C alors que 29C3 a montré qu&#39;une perte de 2% de l&#39;activité à la même température. Les études d&#39;incubation de longue durée comparant l&#39;activité résiduelle de la WT PlyC et 29C3 ont en outre été effectués à 35 ° C et 40 ° C impliquant la mesure de l&#39;activité résiduelle à 24 et 48 points dans le temps h. A 35 ° C, 41% 29C3 affiché et l&#39;activité de 176% plus élevé que WT PlyC à 24 h et de 48 points d&#39;incubation de temps, respectivement (figure 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 affiché et l&#39;activité 107% plus élevé que WT PlyC à 24 h et de 48 points d&#39;incubation de temps, respectivement (figure 4b). L&#39;activité résiduelle de WT PlyC et 29C3 ont également été surveillés toutes les 20 minutes pour un total de 3 heures à 45 ° C. WT PlyC n&#39;a pu conserver son activité de 21% après une incubation de 3 h à cette température, tandis que 29C3 est parvenu à maintenir l&#39;activité de 46%. La demi-vie (t 1/2) pour WT PlyC et 29C3 ont été de 67 et 147 min, respectivement, suggèrent<html> ment que 29C3 a une augmentation de 2,2 fois de la stabilité cinétique à 45 ° C (figure 5). <table border="1"><tbody><tr><td> Total des candidats Round 1 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> Les candidats ayant WT PlyCA séquence </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Les candidats ayant ≥ 1 mutation d&#39;acide aminé </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Prix moyen Mutation nucléotides (nt / plyCA) </td><td> 2,75 </td></tr><tr><td> - Gamme Mutation nucléotides (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Taux Amino Acid Mutation (AA / PlyCA) </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td> - Amino Acid Gamme Mutation (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Analyse génomique candidate Pool. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Réalisé méthodologie d&#39;essai évolution. Dans l&#39;évolution dirigée, on commence avec l&#39;enzyme de plomb, ce qui serait PlyC WT pour le premier tour. Une banque de mutants aléatoires PlyC contenant impartiales mutations de nucléotides du gène plyCA est alors construit par une ADN polymérase d&#39;erreurs, cloné dans le vecteur d&#39;expression pBAD24 et transformé en E. coli souche DH5a contenant déjà pBAD33:. plyCB transformants individuels sont inoculés dans leur propre propre puits d&#39;une plaque de microtitration à 96 puits. Par un processus de recherche exhaustive, chacun des mutants qui sont PlyC catalytiquement actif après incubation à une température non autorisée sont classés comme des mutants ayant une stabilité cinétique accrue. Theconstruct afficher le comportement le plus progressé thermique volonté devient par conséquent l&#39;enzyme de plomb pour le prochain cycle de mutagenèse aléatoire. Globalement, il existe trois séries complètes de random mutagenèse suivie par réarrangement d&#39;ADN résultant en une molécule bactériolytique avec le comportement thermique évolué. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Figure 2. 96 puits de microplaques pour les modèles d&#39;analyse de l&#39;évolution dirigée. Le schéma microplaque lors de la détermination des conditions de chauffage optimales (Figure 2a) consiste à inoculer un seul des parents WT PlyC clone dans chaque rangée de la plaque de microtitration. La plaque de microtitration schématique en projection mutant (Figure 2b) consiste à inoculer chaque puits de la colonne 1 avec un clone unique, WT parental PlyC ainsi que inoculer chaque puits dans les colonnes 2-12 avec un clone distinct mutant PlyC. Wells A1-D1 sont désignés pour les contrôles positifs des parents, qui coopèrentnsist de WT PlyC constructions non exposés à la température d&#39;incubation non autorisée. Wells E1-H1 sont désignés pour les contrôles négatifs des parents, qui sont constitués de constructions PlyC WT qui sont exposés à la température d&#39;incubation non autorisée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse de l&#39;activité cinétique résiduelle comparant WT PlyC et 29C3. Enzymes ont été purifiées à homogénéité et incubées pendant 30 min dans un thermocycleur pour une même concentration molaire à température ambiante ou à un gradient de température allant de 45-50 ° C. Activité enzymatique corrélée à la vitesse maximale affichée après incubation température donnée. À l&#39;exception de 25 ° C et 47,7 ° C, la variation de l&#39;activité entre WT et 29C3 à chaque température en corrélation avec une valeur de p &lt;0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. </p&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Figure 4. Analyse de l&#39;activité cinétique résiduelle comparant WT PlyC de 29C3 à 35 ° C et 40 ° C. égalité des concentrations molaires purifié WT PlyC et 29C3 ont été incubées dans un bloc chauffant à 35 ° C (figure 4a) ou 40 ° C (figure 4b). L&#39;activité enzymatique résiduelle a été mesurée à 24 et 48 points dans le temps h. L&#39;activité affichée par chaque construction a été normalisée par rapport à la vitesse maximale affichée à zéro le temps. La variation de l&#39;activité entre WT et 29C3 à chaque point de température et de temps corrélé à une valeur de p &lt;0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Figure 5. Analyse de l&#39;activité cinétique résiduelle comparantWT PlyC de 29C3 à 45 ° C. égalité des concentrations molaires purifié WT PlyC et 29C3 ont été incubées dans un bloc chauffant à 45 ° C et l&#39;activité enzymatique résiduelle a été mesurée toutes les 20 minutes pendant 3 heures. L&#39;activité affichée par chaque construction a été normalisée par rapport à la vitesse maximale affichée à zéro le temps. À l&#39;exception des points de données à 20 min, la variation de l&#39;activité entre WT et 29C3 à chaque point de temps corrélé à une valeur de p &lt;0,05. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes.

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A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes | Immunology and Infection | Video

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Une méthode d&#39;évolution dirigée roman spécifique au domaine de l&#39;ingénierie thermostabilité a été développé et validé par conséquent, pour les enzymes bactériolytiques. Après un seul tour de mutagenèse aléatoire, une enzyme bactériolytique évolué, PlyC 29C3, affichée deux fois supérieure à l&#39;activité résiduelle par rapport à la protéine de type sauvage après incubation à température élevée.

Une nouvelle méthode de dépistage pour l&#39;évolution dirigée des enzymes thermostables bactériolytique

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

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17.8K vues.  University of Maryland. Une méthode d'évolution dirigée roman spécifique au domaine de l'ingénierie thermostabilité a été développé et validé par conséquent, pour les enzymes bactériolytiques. Après un seul tour de mutagenèse aléatoire, une enzyme bactériolytique évolué, PlyC 29C3, affichée deux fois supérieure à l'activité résiduelle par rapport à la protéine de type sauvage après incubation à température élevée.

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Méthode d&#39;agglutination de particules pour l&#39;identification des poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Recherche

Immunologie et infection

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Sélection des Plasmodium falciparum Parasites des Cytoadhesion aux cellules du cerveau endothéliales humaines

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Une stratégie rapide pour l&#39;isolement des nouveaux Faustoviruses d&#39;échantillons environnementaux Utilisation<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Une nouvelle méthode d&#39;analyse qualitative multi-échelle des bactéries biofilms sur filamenteux Fungal Colonies utilisant confocale et microscopie électronique

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Affichage bactérien de Peptide pour la sélection des enzymes de biotinylating de roman

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...