This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

L&#39;étude des interactions hôte / pathogène a prouvé être une méthode remarquable pour comprendre les infections bactériennes et développer des stratégies alternatives pour contrer les maladies infectieuses. Toutefois, en raison de la diversité des stratégies élaborées par différents pathogènes bactériens, l&#39;identification et la caractérisation des facteurs de virulence bactériens et des voies de signalisation hôte qui sont ciblés au cours des infections représentent un véritable défi. Cela nécessite le développement de nouvelles approches pour l&#39;identification à grande échelle des principaux hubs d&#39;interaction hôte / pathogène. Le développement récent de, à haut débit innovantes et des techniques de criblage à haut contenu représente une ressource inestimable qui peut être adapté à l&#39;étude des bactéries pathogènes intracellulaires 15. Ici, nous avons utilisé la zoonose bactérienne pathogène Coxiella burnetii comme un modèle à développer des approches de dépistage qui combinent mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence. Importantly, cette méthode de dépistage permet la surveillance simultanée de plusieurs étapes du cycle intracellulaire Coxiella, fournissant un aperçu global des stratégies développées par cette bactérie d&#39;envahir, de reproduire et de persister dans les cellules infectées. L&#39;approche décrite ici est basée sur deux techniques bien établies, la mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence, qui ont été appliquées avec succès à l&#39;étude des agents pathogènes bactériens. La combinaison de ces techniques dans le contexte des écrans à haut débit / haute contenu nous permet d&#39;évaluer les effets d&#39;un nombre élevé de mutations bactériennes en analysant un nombre très élevé d&#39;événements (typiquement 15 000 cellules infectées par des mutations bactériennes sont imagées et analysées). Ceci fournit une analyse statistique importante d&#39;événements tels que l&#39;invasion bactérienne des cellules hôtes et la réplication intracellulaire, qui sont, par nature, soumises à une forte variabilité. Il est important de noter que les lignées cellulaires autres que epithelial peuvent être utilisés pour ce type de dépistage. Toutefois, les cellules epitheliales plates et larges sont optimales pour l&#39;analyse d&#39;images comme des organelles de cellules hôtes sont plus faciles à détecter. Parce que la majorité des microscopes automatisés peut traiter automatiquement un grand nombre de plaques, il n&#39;y a pratiquement pas de limites au nombre de mutants qui peut être projeté simultanément. En fonction de l&#39;agent pathogène, l&#39;utilisateur peut privilégier l&#39;utilisation d&#39;une épifluorescence ou un microscope confocal. Le moment de l&#39;acquisition de l&#39;image est essentiellement dépendre de la sensibilité de la caméra du microscope, sur le nombre de champs par puits et acquises sur le nombre de canaux acquises par le champ de vision. L&#39;utilisateur peut décider comment ajuster ces facteurs pour optimiser le protocole de dépistage. A titre d&#39;exemple, nous imager une plaque de 96 puits / h en utilisant les conditions indiquées au point 5.1. L&#39;analyse d&#39;images dépend largement de la machine (ou groupe de machines) utilisé. Nous utilisons un 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 Go de RAM poste de travail. Cette machine nécessite environ 40 min pour analyser les images acquises d&#39;une plaque. Un aspect important à prendre en compte lors de l&#39;élaboration de ces tests est la mise en place de la nouvelle (ou l&#39;optimisation des protocoles existants) pour permettre la manipulation et le traitement d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons. Un exemple typique est le développement de l&#39;approche PCR de l&#39;amorce de colonie unique, qui nous a permis d&#39;amplifier rapidement et fragments séquence Coxiella ADN contenant le site d&#39;insertion du transposon chaque, à partir de très petits échantillons. Basé sur notre expérience, la polymérase haute fidélité doit être soigneusement sélectionnés et testés afin d&#39;obtenir des résultats reproductibles. La seule limitation de cette approche peut se cacher dans l&#39;observation que, dans la majorité des cas, environ 30% des échantillons traités ne sont pas exploitables, soit en raison de la PCR ou les étapes de séquençage. Cependant, étant donné que l&#39;isolement des nouveaux mutants de transposons Coxiella est pas une étape de limitation de vitesse, cela ne repré pasenvoyé un enjeu majeur. De même, le développement d&#39;un test fiable de quantifier la concentration bactérienne des stocks mutantes a été la clé de cette approche. En raison de la tendance de Coxiella d&#39;agréger quand en suspension, l&#39;utilisation des lectures de densité optique est pas applicable pour le calcul de la concentration de cultures Coxiella et la seule alternative existante était PCR quantitative (qPCR). Ici, l&#39;utilisation d&#39;un agent intercalant d&#39;ADN marqués par fluorescence significativement accélérer la quantification des bactéries. Cette approche peut également profiter de l&#39;utilisation de lignées cellulaires stables exprimant des marqueurs fluorescents pour plusieurs compartiments intracellulaires selon l&#39;agent pathogène utilisé. Un autre aspect important est l&#39;utilisation de milieux de culture cellulaire dépourvu de rouge de phénol. Nous avons constaté que cet indicateur de pH a une fluorescence naturelle couvrant le spectre rouge et vert qui sature le signal enregistré sur le lecteur de fluorescence automatisé. Ta stratégie présentée ici repose sur la mutagenèse aléatoire transposon. Pour les mutants d&#39;intérêt, nous vous recommandons de valider transpositions uniques (et clonalité) en utilisant transfert de Southern et amplifications PCR du site d&#39;insertion du transposon. Outre l&#39;équipement décrit dans la section de protocole, équipes intéressées à l&#39;aide de l&#39;approche de dépistage présenté ici, auront grand avantage dans la mise en place d&#39;une base de données relationnelle pour la collecte de données, un serveur pour le stockage des données et une station de travail pour l&#39;analyse rapide des images. Fait important, le procédé décrit ici est approprié pour l&#39;étude d&#39;autres agents pathogènes bactériens intracellulaires fourni un procédé de mutagenèse aléatoire existe pour l&#39;agent pathogène, des lignées de cellules peuvent être infectées par l&#39;agent pathogène et celui-ci affiche un phénotype spécifique au cours de l&#39;infection.

La bactérie Coxiella burnetii émergente endémique est responsable de grandes épidémies de fièvre Q, une zoonose débilitante pseudo-grippal avec la santé et l&#39;impact économique grave 1. Les principaux réservoirs de Coxiella sont des animaux domestiques et d&#39;élevage, et on estime que plus de 90% des bovins laitiers aux États-Unis portent C. burnetii 2. Les humains sont des hôtes accidentels qui sont infectés par inhalation d&#39;aérosols contaminés. La fièvre Q humaine manifeste soit comme une maladie aiguë ou chronique, qui peut avoir des complications mortelles avec un taux de mortalité atteignant 65% 1,3. Avec une dose infectieuse de 1 - 10 organismes, Coxiella est le pathogène le plus infectieux connu et il a été étudié comme un bio arme potentielle 4. L&#39;épidémie récente de explosive fièvre Q aux Pays-Bas (2007 - 2010), avec des cas escalade de 182 à plus de 2000 par an, est un exemple de la virulence de cet agent pathogène grave5. L&#39;efficacité remarquable des infections Coxiella est probablement associée à sa résistance au stress environnemental, combiné avec son adaptation unique de cellules hôtes. En effet, Coxiella est présent dans l&#39;environnement sous forme de variantes métaboliquement inactifs à petites cellules (SCV), qui sont remarquablement résistante à plusieurs conditions difficiles (dessiccation, température, etc.). VCS sont absorbé par des cellules phagocytaires via α V β 3 intégrines 6 tandis que l&#39;invasion des cellules non-phagocytaires est médiée par la Coxiella adhérence / invasion OmpA 7 et un récepteur non encore identifié. Après absorption, Coxiella réside dans les vacuoles moulants, positifs pour les marqueurs endosomes précoces et Rab5 EEA1 8. Les bactéries répondent aux acidification endosomique en convertissant des variantes de cellules grandes métaboliquement actifs (VUL) et l&#39;activation d&#39;un type 4 système de sécrétion Dot / Icm (T4SS) 9, Fortement homologue à celle de 10 Legionella pneumophila. La sécrétion d&#39;effecteurs Dot / ICM permet Coxiella pour générer un grand compartiment acide, LAMP1 positif contenant des enzymes lysosomales actifs où les bactéries peuvent se développer et protéger activement les cellules infectées de l&#39;apoptose 11. Par conséquent, le cycle intracellulaire de Coxiella est contrôlée par la translocation Dot / Icm d&#39;effecteurs à médiation par 12 bactériennes, cependant, les facteurs impliqués dans l&#39;invasion microbienne de la cellule hôte, la replication bactérienne et la diffusion de l&#39;infection restent en grande partie inconnus. Combinant mutagenèse de transposon et des essais basés sur la fluorescence, nous développons des approches impartiales pour l&#39;identification simultanée de facteurs bactériens impliqués dans les principales étapes d&#39;infections Coxiella: 1) l&#39;internalisation dans les cellules hôtes, 2) la réplication intracellulaire, 3) la propagation de cellule à cellule et 4) la persistance. À ce jour, nous avons passé au crible plus de 1000 mutations dans 500 séquences codantes Coxiella, qui nous ont fourni des perspectives sans précédent dans les interactions hôte-pathogène qui régulent Coxiella pathogenèse 7. Fait à noter, cette approche peut être appliquée à l&#39;étude d&#39;autres pathogènes intracellulaires qui partagent des caractéristiques de biologie cellulaire avec Coxiella.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

Invasion et la colonisation des cellules hôtes de bactéries pathogènes dépendent de l&#39;activité d&#39;un grand nombre de protéines procaryotes, défini comme étant des facteurs de virulence, qui peut renverser et manipuler des fonctions essentielles de l&#39;hôte. L&#39;étude des interactions hôte / pathogène est donc extrêmement important de comprendre les infections bactériennes et développer des stratégies alternatives pour contrer les maladies infectieuses. Cependant, cette approche nécessite le développement de nouveaux tests à haut débit pour la impartiale, l&#39;identification automatisée et la caractérisation des facteurs de virulence bactériens. Ici, nous décrivons un procédé pour la production d&#39;une banque de mutants GFP-étiqueté par mutagenèse par transposon et le développement d&#39;un criblage à haut contenu approches pour l&#39;identification simultanée de plusieurs phénotypes de transposon associé. Notre modèle de travail est le bactérienne pathogène Coxiella burnetii intracellulaire, l&#39;agent étiologique de la fièvre Q zoonose, qui est associé à soivere les épidémies de la santé avec une conséquente et le fardeau économique. La nature intracellulaire obligatoire de cet agent pathogène a, jusqu&#39;à récemment, gravement entravé l&#39;identification des facteurs bactériens impliqués dans les interactions hôte-pathogène, faisant de Coxiella le modèle idéal pour la mise en œuvre d&#39;approches à haut débit / haute-contenu.

Après isolement de mutants de transposons, colonie unique d&#39;amorces de PCR est une méthode à haut débit robuste pour identifier le site d&#39;insertion du transposon pour chaque mutant. Cette approche découle d&#39;un protocole typique PCR nichée, mais ici une seule amorce hybridant spécifiquement et / ou de manière non spécifique à l&#39;ADN de matrice en fonction de la stringence de la température de recuit (figure 1A). Les produits de PCR typiques sont constitués de multiples fragments d&#39;ADN, dont la plupart sont spécifiques (figure 1B). L&#39;utilisation d&#39;une amorce de séquençage différent qui apparie droit en amont de l&#39;ITR du transposon, et en aval de la séquence reconnue par l&#39;amorce d&#39;amplification fournit une spécificité pour l&#39;étape de mise en séquence (figure 1C). Logiciel automatisé pour l&#39;analyse de séquence permet d&#39;aligner les séquences obtenues dans le génome de Coxiella fournir l&#39;emplacement exact des insertions de transposons (figure 1c). Toutes les insertions de transposons peuvent être ensuite annotated sur le génome de Coxiella (Figure 1D). Chaque mutant Coxiella est isolé et amplifié dans des conditions axéniques-2 ACCM milieu soit avant le stockage ou le criblage. La figure 2 illustre un exemple de mutants de transposons 38 à 16 points / ICM Coxiella gènes (figure 2A). Pour évaluer la viabilité des mutants Coxiella, courbes de croissance axéniques sont obtenues par échantillonnage cultures bactériennes pendant 7 jours après l&#39;inoculation et l&#39;application de l&#39;analyse de la concentration bactérienne décrit dans 1.5 (Figurie 2B). Mutants amplifiés sont ensuite incubées avec les cellules épithéliales, en triplicata plaques de 96 puits pendant 7 jours. Tous les mutants générés étant Coxiella GFP-étiqueté, les courbes de croissance intracellulaires sont obtenus en mesurant l&#39;intensité de fluorescence de la GFP de chaque puits, chaque 24 h, et ​​le tracé des valeurs mesurées en fonction du temps (figure 2C). Intrles courbes de croissance acellulaires fournissent une analyse quantitative des phénotypes associés à chaque insertion de transposon dans le génome de Coxiella. Pour ajouter des informations qualitatives sur les mêmes mutants de transposons, nous avons opté pour l&#39;acquisition d&#39;image automatisé et d&#39;analyse. Sept jours après l&#39;infection, les plaques sont fixées, traitées pour immunofluorescence comme décrit à 4 et analysés en utilisant un système automatisé, tel que décrit microscope à épifluorescence en 5. logiciel d&#39;analyse d&#39;image automatisée comme CellProfiler (Broad Institute, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) traite les canaux acquis et indépendamment des segments identifiés des objets d&#39;analyse comparative (figure 3). Ceci permet l&#39;identification et la caractérisation morphologique des noyaux de cellules hôtes, des contours de cellules, des lysosomes et Coxiella colonies (figure 3 panneaux supérieurs). Corréler colonies Coxiella avec les cellules et permet aux lysosomes identificatiet une analyse morphologique spécifique de vacuoles contenant Coxiella (qui sont LAMP1 positif, Figure 3 du panneau en bas à gauche). Corréler colonies Coxiella avec des contours de la cellule hôte permet l&#39;identification et l&#39;analyse morphologique spécifique des cellules infectées (Figure 3 en bas du panneau de centre). Enfin, les 4 canaux sont fusionnés pour l&#39;illustration et à des fins de contrôle de qualité (Figure 3 du panneau en bas à droite). Les données obtenues par analyse d&#39;image automatisée peuvent être tracées uns contre les autres pour obtenir des «nuages ​​de points multi-phénotypiques&quot;. A titre d&#39;exemple, sur la figure 4A la superficie moyenne (en um 2) de colonies Coxiella est tracée en fonction du nombre de colonies par cellule (figure 4a), afin d&#39;identifier des mutations qui affectent la réplication intracellulaire de Coxiella (phénotype de replication) et / ou la capacité des bactéries d&#39;envahir les cellules hôtes (internalisation phénotype). L&#39;analyse statistique a été utilisé pour définir les régions dans le nuage de points résultant correspondant aux douces (-4 &lt;Z-score ≤ -2) et sévère (Z-score ≤ -4) phénotypes. Mutants ont été observés dans 3 pôles principaux: des mutations qui ont abouti à une croissance intracellulaire défectueux de Coxiella ont été regroupés dans la partie la plus à gauche de la parcelle (figure 4A, rose et points rouges); mutations qui ont affecté Coxiella internalisation dans les cellules ont été regroupés dans la partie inférieure de la parcelle (figure 4A, bleu clair et bleu foncé points) et enfin, des points verts dans la région la plus à droite de la parcelle correspondent aux mutations résultant de phénotypes non significatifs ( Z-score&gt; -2). Fait important, les mutants qui ne parviennent pas à se répliquer mais sont encore capables d&#39;envahir les cellules hôtes, sont détectés après 7 jours d&#39;infection que des bactéries ou des simples, de petites colonies, adjacentes à accueillir les noyaux des cellules (figure 4C, panneau secondes). Par conséquent, la taille de Coxiella &quot;coloentre- &quot;sera affectée de façon significative, mais le nombre de cellules infectées ne varie pas par rapport à des cellules infectées par le WT Coxiella. Au contraire, des mutations qui affectent la capacité de Coxiella à envahir les cellules hôtes se traduisent par une diminution du nombre de colonies / cellule. Lorsque ce nombre est nettement inférieur à 1, cela signifie que, en moyenne, on constate une diminution du nombre total de cellules infectées. En variante, la superficie moyenne (en um 2) de colonies Coxiella peut être tracée en fonction du nombre de cellules hôtes qui survivent infection (figure 4B), pour identifier les mutations qui confèrent une cytotoxicité à Coxiella (phénotype cytotoxique). Comme ci-dessus, l&#39;analyse statistique a été utilisé pour définir les régions dans le nuage de points résultant correspondant aux douces (-4 &lt;Z-score ≤ -2) et sévère (Z-score ≤ -4) phénotypes. La plupart des mutations dépistage n&#39;a pas affecté de façon significative la survie des cellules, indépendamment de la réplication bactérienne dans hôtecellules (figure 3B points verts). 37 mutations survie de la cellule hôte légèrement affectée (figure 3B, les points rouges légers), et 7 mutations étaient particulièrement préjudiciable pour accueillir la survie des cellules (figure 3B, points rouges sombres). S&#39;il vous plaît noter que les paramètres supplémentaires obtenus par l&#39;image procédure d&#39;analyse automatisé peuvent être utilisés pour tirer d&#39;autres cartes, en fonction des besoins expérimentaux. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figure 1:. Séquençage et annotation de mutants de transposon Coxiella (A) à l&#39;unité primaire colonie PCR est utilisée pour amplifier des fragments d&#39;ADN contenant le site d&#39;insertion du transposon. Une amorce d&#39;amplification (Amp) est utilisé à la fois comme amorce spécifique et non-spécifique en fonction de la stringence de la température de recuit. (B) de résultat typique de colonie seule amorce PCR. Chaque Reactile produit un certain nombre de fragments de taille variable, dont certaines contiennent le site d&#39;insertion du transposon; certains autres sont amplifiés de manière aléatoire en tant que sous-produits du cycle de PCR à faible stringence. (C) L&#39;utilisation d&#39;une amorce de séquençage (SEQ) qui hybride à la séquence du transposon permet le séquençage des fragments d&#39;intérêt. Logiciel (D) d&#39;analyse de séquence permet l&#39;annotation automatique des insertions de transposons sur le génome bactérien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figure 2:. Axénique et la croissance intracellulaire de mutants de transposons Coxiella (A) Dans l&#39;écran de pilote, nous avons isolé, séquencé et projeté 38 mutants de transposons dans 16 g de baseEnes du système dot / ICM sécrétion Coxiella (indiqués en rouge). (B) Afin d&#39;évaluer la viabilité de chaque mutant de transposon, la croissance de chaque isoler dans un milieu de culture axénique est surveillé de plus de 8 jours à l&#39;aide d&#39;un agent de fluorescence taggés intercalant d&#39;ADN. (C) Pour chaque mutant est ensuite utilisé pour infecter des cellules épithéliales. Comme le transposon possède une cassette de la GFP, la croissance bactérienne intracellulaire est surveillé de plus de 7 jours de l&#39;infection en suivant les variations de fluorescence de la GFP associé à la réplication Coxiella, en utilisant un lecteur de microplaques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figure 3: analyse d&#39;image automatisée des infections Coxiella Une auto.accouplée microscope à épifluorescence est utilisé pour l&#39;image 21 positions par puits en triple de plaques à 96 puits. Les segments de logiciels d&#39;analyse d&#39;images objets dans chaque canaux acquis pour la quantification et l&#39;analyse. Dans tous les cas, les objets touchant la frontière des images sont exclus. (A) Le canal Hoechst est utilisé pour identifier les noyaux des cellules de l&#39;hôte (entouré en vert). (B) Ceux-ci sont utilisés comme semences pour identifier les contours de la cellule hôte dans le canal Cy3 (la position des noyaux est entouré en bleu, les contours de cellules sont en vert). (C) Le canal Cy5 est utilisé pour identifier les compartiments de LAMPE1-positive (dans le cercle vert); seulement les objets inclus dans les contours de cellules identifiées précédemment (en rouge) sont retenus pour l&#39;analyse d&#39;image. (D) Le canal de la GFP est utilisé pour identifier les colonies de Coxiella (entouré en vert). (E) corrélation colonies Coxiella avec des compartiments de LAMPE1 positif permet l&#39;identification de Coxiella </em&gt; vacuoles contenant (CCVS); seulement les objets inclus dans les contours de cellules identifiées précédemment (en vert) sont retenus pour l&#39;analyse d&#39;image. (F) en corrélation avec des contours Coxiella colonies de cellules permet l&#39;identification de cellules infectées (de pseudocolored). (G) Les images acquises dans les 4 canaux de fluorescence (correspondant à colonies Coxiella (vert), des noyaux de la cellule hôte (bleu), la membrane de la cellule hôte plasma (gris), les compartiments de LAMPE1-positif (rouge)) sont fusionnés et utilisée pour l&#39;illustration et de la qualité contrôle. Échelle barres 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figure 4: l&#39;identification à grande échelle des facteurs impliqués dans Coxiella hôte / pathogène interagissentions. (A) Le Quartier moyenne (en pm 2) des colonies Coxiella est tracée contre le nombre relatif de colonies par cellule, afin d&#39;identifier et de réplication internalisation phénotypes d&#39;intérêt. Les points verts représentent phénotypes qui dévient de WT Coxiella par un Z-score&gt; -2 (non significatif). Points roses et bleu clair représentent réplication et de l&#39;internalisation des phénotypes respectivement, avec un Z-score entre -2 et -4 (phénotypes bénins). Points bleu foncé Rouge et représentent phénotypes avec un Z-score ≤ -4 (phénotypes forts). (B) La surface moyenne (en um 2) de Coxiella colonies a été tracée en fonction du nombre total de cellules (infectées et non infectées) qui ont survécu 7 jours suivant l&#39;infection pour estimer l&#39;effet cytotoxique résultant de la insertions de transposons. Les points verts représentent phénotypes qui dévient de WT Coxiella par un Z-score&gt; -2 (non significatif). Points roses représentent cytotoxique phenotypes avec un Z-score entre -2 et -4 (phénotypes bénins). Les points rouges représentent les phénotypes cytotoxiques avec un Z-score ≤ -4 (phénotypes forts). Les flèches indiquent mutants illustrés par la lettre minuscule correspondante de C (C) des images représentatives de la réplication, l&#39;internalisation et phénotypes cytotoxiques. Dans tous les cas, les noyaux de cellules hôtes sont en rouge, les colonies sont Coxiella en vert. Échelle barres 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii est une bactérie intracellulaire Gram négatif obligatoire responsable de la maladie zoonotique la fièvre Q. Nous décrivons ici des procédés pour la génération de mutants de transposon Coxiella fluorescent ainsi que l&#39;identification et l&#39;analyse automatisée de l&#39;internalisation, la réplication et cytotoxiques phénotypes résultants.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K vues.  Université Montpellier.  Coxiella burnetii est une bactérie intracellulaire Gram négatif obligatoire responsable de la maladie zoonotique la fièvre Q. Nous décrivons ici des procédés pour la génération de mutants de transposon Coxiella fluorescent ainsi que l'identification et l'analyse automatisée de l'internalisation, la réplication et cytotoxiques phénotypes résultants. 

Vidéo: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Recherche

Immunologie et infection

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Drug faciliter la découverte: Un test automatisé inflammation Haute-contenu chez le poisson zèbre

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identification de nouveaux gènes associés à la production d&#39;alginate dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilisation de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenèse Mariner Transposon médiation

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Évaluation visuelle et microscopique de Streptomyces Mutants du développement

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...