Les auteurs souhaitent remercier George Farr et les membres du laboratoire horwich pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu par le Howard Hughes Medical Institute.

Les procédures décrites ici pour l’anesthésie, l’euthanasie, et la perfusion cardiaque des souris ont été exécutées sous un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation d’animal d’université de Yale.
1. Préparation d’instruments et de solutions sans RNase
<ol><li>La RNase est un contaminant commun à toutes les surfaces de laboratoire, y compris les paillanes, les micropipettes et l’investigateur.<ol>
<li>Changez les gants souvent ou régulièrement essuyez avec une solution décontaminante RNAse.</li>
		<li>Les outils de dissection en acier inoxydable et la verrerie peuvent être rendus sans RNase en chauffant à >200 °C pendant 1 heure ou plus. Remarque: La stérilisation à la vapeur ne détruit pas RNase. Alternativement, essuyez avec une solution décontaminante RNase, puis avec de l’éthanol sans RNase à 70% et séchez à l’air.</li>
		<li>Essuyez les paillages, les autres surfaces de laboratoire et les micropipettors avec une solution décontaminante de RNase, puis avec de l’éthanol à 70% sans RNase. Désigner un banc de laboratoire ou une zone de travail spécifique pour la récupération et l’analyse de l’ARN. Remarque : Retirez les éjecteurs de pointe avant d’essuyer les arbres des pipettors et laissez-les éteints, si possible.</li>
		<li>Utilisez des tubes, des tubes à microcentrifugation, des pipettes et des embouts de micropipette certifiés par leur fabricant comme exempts de RNase. L’utilisation de pointes de liaison et de microtubes très bas est recommandée. Si possible, utilisez des boîtes ou des sacs de ces composants fraîchement ouverts et gardez-les séparés de l’approvisionnement général du laboratoire.</li>
		<li>Obtenir des solutions sans RNase [PBS sans calcium et magnésium (PBS) de Dulbecco, éthanol, éthanol à 70 % sans RNase] de sources commerciales. Utilisez des bouteilles nouvellement ouvertes pour chaque expérience.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La source du colorant Azure B est essentielle à la récupération réussie de l’ARN intact. Testez chaque lot de colorant avant de consacrer des échantillons précieux à la coloration et au prélèvement. Recueillir quelques milliers de neurones d’un animal non expérimental, préparer l’ARN, et déterminer l’intégrité de l’ARN comme décrit ci-dessous pour trouver un qui produit constamment des nombres de RIN au-dessus de 8,5.<ol>
<li>Dissoudre le colorant Azure B (1 %, en poids/vol) dans de l’éthanol à 70 % sans RNase, généralement 0,3 g dans un tube à centrifuger de 50 ml. Bien mélanger sur une bascule à RT pendant la nuit ou jusqu’à ce que toutes les particules se dissolvent. Un tube de cette solution peut être utilisé pour colorer plusieurs lames sans affecter l’intensité de la coloration.</li>
		<li>Par mesure de précaution, utilisez un tube de coloration différent pour chaque répétition biologique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez les cryomoldes et o.C.t. pour l’incorporation des sections de cordon sans autre traitement.</li>
	<li>Maintenir le cryostat à -20 à -24 °C. Après le sectionnement, placer les lames dans un congélateur à -80 °C jusqu’à ce qu’un nombre suffisant ait été préparé. Commencez la préparation de l’ARN dès que possible après la réalisation des lames. Pour l’entreposage à long terme, conserver les blocs de TPO non sectionnés ou partiellement sectionnés, plutôt que les lames, à 80 °C.</li>
	<li>Fabriquer le tampon de thiocyanate de guanidine pour la préparation de l’ARN à partir des motoneurones disséqués en utilisant les solutions fournies par le fabricant du kit de préparation de l’ARN selon ses instructions.</li>
</ol>2. Préparation des sections de moelle épinière de souris (figure 1A)
<ol><li>Nettoyez tous les outils de dissection, les lames de verre, les lames de rasoir et la plate-forme de dissection en les faisant cuire ou en essuyant avec une solution décontaminante de RNase, suivie d’éthanol à 70% sans RNase. Laisser sécher pendant 2 min. Gardez tout sans poussière en le recouvrant de lingettes de laboratoire.</li>
	<li>Les procédures de manipulation des animaux, y compris l’anesthésie, la perfusion cardiaque et l’euthanasie, doivent être effectuées conformément aux exigences du comité institutionnel local de soins et d’utilisation des animaux (IACUC), dans le but d’amener rapidement l’animal au point de dissection de la moelle épinière.<ol>
<li>Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) d’une dose létale de kétamine (450 mg/kg).</li>
		<li>Une fois qu’un niveau profond d’anesthésie est atteint et confirmé par l’absence d’une réponse pince-orteil, placez la face ventrale de la souris sur une plate-forme de dissection (une planche de polystyrène, par exemple), ouvrez la cavité thoracique pour exposer le cœur et insérez l’aiguille papillon de 27 G d’une perfusion dans le ventricule gauche (qui se trouve à la droite de l’investigateur). Nick l’oreillette droite avec une pince pointue, et perfuser avec pbs à un taux de 5-7 ml/min pendant environ 2 min en utilisant une pompe péristaltique. Le liquide qui s’écoule de l’oreillette doit être largement exempt de sang à ce stade.</li>
		<li>Retirez l’aiguille de perfusion, décapitez la souris et retournez-la sur le tableau de dissection. Ouvrez la peau pour exposer la colonne vertébrale, utilisez de petits ciseaux et une pince pour enlever les vertèbres et soulevez la moelle épinière tout en sectionnant les racines nerveuses avec une pince tranchante. La vitesse et la pratique sont essentielles pour passer du début de la perfusion à l’ablation du cordon; cela ne devrait pas prendre plus de 7 min.</li>
		<li>Rincez le cordon pendant 10 secondes dans de l’eau sans RNase pour laver tout sang résiduel. Posez la moelle épinière sur une lame de verre sans RNase avec une pince incurvée très doucement mais rapidement. Divisez la moelle épinière transversalement à l’aide d’une lame de rasoir propre en 9-10 morceaux.</li>
		<li>Placez les pièces dans un cryomold rempli d’O.C.T. en utilisant les mêmes pinces et alignez-les verticalement à l’aide d’une aiguille propre. Placez le moule dans un plateau peu profond contenant du 2-méthylbutane pré-refroidi avec de l’azote liquide, puis mettez le plateau dans un bain d’azote liquide pour congeler rapidement les morceaux de moelle épinière afin d’éviter la dégradation de l’ARN.</li>
		<li>Conservez le bloc intégré à l’OPO à -80 °C jusqu’à 6 mois avant le sectionnement. Le processus de récupération du cordon à la congélation doit être effectué dans les 5 minutes pour maintenir l’intégrité de l’ARN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cryosection du bloc incorporé en O.C.T. à -20 °C avec un cryostat pour produire des tranches de 20 μm, chacune contenant 9 à 10 sections transversales de la moelle épinière, sur des lames PEN-membrane 2 μm sans RNase conservées initialement à température ambiante pour s’assurer que les sections adhèrent à la lame. Recongelez immédiatement la section sur une surface de -20 °C à l’intérieur du cryostat. Conservez les diapositives à -80 °C jusqu’à ce qu’elles le dent.</li>
</ol>3. Coloration des sections de la moelle épinière (figure 1A)
<ol><li>Sur un rack propre, disposez six tubes coniques de 50 ml. Remplissez-les tous avec 25-30 ml d’éthanol à 70% sans RNase, de sorte que la profondeur soit suffisante pour couvrir toutes les sections d’une lame lorsque la lame est immergée. Fabriquez 30 à 35 ml de solution Azure B à 1 % comme décrit précédemment et conservez-la sur le même rack pour réduire le temps entre les solutions de changement pendant le lavage ou la coloration. Gardez trois ou quatre lingettes de laboratoire devant le rack pour vider rapidement la solution supplémentaire.</li>
	<li>Sortez les toboggans du congélateur à -80 °C sur de la glace carbonique. Décongelez une lame en la plaçant sur une paume gantée. Enlevez la majeure partie de l’humidité et de la condensation sur la lame en l’essuyant avec une lingette de laboratoire, en prenant soin de ne pas toucher les sections. Mettez la lame sur du dessicant de gel de silice frais dans une boîte de Pétri pendant 30-40 secondes pour sécher complètement. Si l’humidité du laboratoire est élevée, un bref traitement dans un dessicateur sous vide peut être utilisé pour sécher la lame plus rapidement.</li>
	<li>Lavage et coloration.<ol>
<li>Trempez la lame séchée dans le premier tube d’éthanol à 70% sans RNase. Trempez la lame pendant 30 secondes, puis lavez la lame pour retirer l’OCT en la trempant de haut en bas pendant 45-60 secondes. Sortez la lame de la solution et égouttez l’excès de liquide sur des lingettes de laboratoire. Répétez le même processus en trempant la lame dans le deuxième tube d’éthanol à 70%. Si le PTOM autour des sections de la moelle épinière n’a pas complètement disparu, répétez le lavage dans le troisième tube.</li>
		<li>Après avoir drainé l’excès de liquide, plongez la lame dans une solution Azure B à 1% dans de l’éthanol sans RNase à 70% pendant 30-45 sec. Drainez l’excès d’Azure B sur une lingette de laboratoire ; à ce stade, toute la diapositive sera bleue.</li>
		<li>Plongez la lame dans le tube suivant d’éthanol à 70%, et plongez de haut en bas rapidement 3-4x pour éliminer l’excès de colorant et rendre visible la coloration spécifique du motoneurone. Si les sections semblent très sombrement colorées, répétez l’étape de destaining dans un tube frais d’éthanol à 70%. Si la coloration semble trop légère, retournez la diapositive à la solution Azure B pendant encore 30 secondes et répétez la décoloration. Essuyez l’excès d’éthanol et séchez la lame à l’air pendant environ 40 secondes jusqu’à ce que tout le liquide ait disparu. La matière grise sera bleu clair, tandis que les motoneurones seront colorés d’un bleu profond, ce qui est facilement visible. Commencez la dissection immédiatement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microdissection par capture laser (LMD) (Figure 1B)
<ol><li>Allumez le microscope et déchargez le support du tube pour fixer le capuchon d’un tube de microfuges de 0,6 ml pour le prélèvement d’échantillons. Mettre 30 μl de tampon de lyse de thiocyanate de guanidine dans le capuchon d’un tube de microfuge de 0,6 ml. Couvrir la surface du bouchon avec du liquide en étalant la solution à l’aide d’une pointe de pipette. De cette façon, tous les neurones collectés seront dissous dans une solution solubilisante au fur et à mesure qu’ils seront disséqués. Alignez le capuchon avec le trou et l’objectif avec le logiciel de microscope. Gardez le capuchon dans la position couverte jusqu’à ce que vous commenciez la capture laser.</li>
	<li>Placez la lame séchée à l’air sur la scène du microscope LMD à l’envers, de sorte que la membrane de la lame PEN soit exposée vers le bas. La membrane avec des sections doit faire face au trou, sous lequel se trouve le tube de collecte.</li>
	<li>Allumez le laser 10 min avant de commencer la préparation de la diapositive. Concentrez-vous sur une section de moelle épinière avec l’objectif 5X. Passer à l’objectif 20X pour la dissection.<ol>
<li>Marquez une région « factice » avec le stylo lumineux et laissez le laser la découper sans la collecter. Cela détend la membrane PEN et permet de marquer et de couper plusieurs régions successivement.</li>
		<li>Recentrez et identifiez les motoneurones dans la région ventrale de klaxon. Ces neurones sont reconnaissables à leur emplacement, leur morphologie pyramidale, leur grande taille et leur coloration bleu foncé avec Azure B (Figure 2).</li>
		<li>À l’aide du stylo lumineux, sélectionnez l’outil de dessin et marquez le long du bord des motoneurones, en faisant un contour complet. Essayez de rendre le contour aussi proche que possible du motoneurone pour éviter la contamination par des cellules autres que le motoneurone. (Testez certaines sections au préalable pour voir quelle est la largeur de la ligne de découpe laser et ajustez le jeu si nécessaire.) Marquer plusieurs cellules avant de couper; le logiciel se souviendra des positions.</li>
		<li>Placez le capuchon sous la position de coupe en cliquant sur la position du capuchon. Cliquez sur le bouton démarrer pour lancer la dissection des motoneurones avec le laser. Recueillir tous les motoneurones de toutes les sections sur une diapositive dans le capuchon d’un tube de microfuge.</li>
		<li>Une fois la collecte terminée, sortez le tube de microfuge du support en déchargeant le plateau et en délogeant doucement le tube. Dissoudre complètement les motoneurones dans le tampon en pipetting la solution de haut en bas. Déplacer la solution dans le corps du tube en centrifugant à 14 000 x g pendant 2 min à 4 °C. Congeler immédiatement l’échantillon dans de la glace carbonique et le conserver à -80 °C. Ce processus, de la coloration de la lame à la collecte des motoneurones, doit être effectué dans les 30 minutes pour une lame afin de minimiser la dégradation de l’ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Préparation de l’ARN à partir de motoneurones
Décongelez tous les neurones collectés d’un animal et regroupez-les pour extraire l’ARN. Les échantillons peuvent sembler bleu pâle en fonction du nombre de motoneurones (tachés d’Azur B) qu’ils contiennent. Extraire l’ARN à l’aide d’un kit approprié selon le protocole prévu pour le tissu LMD, en éluant dans le volume minimum possible. Prélever 1 μl pour vérifier la quantité et l’intégrité de l’échantillon. Congeler rapidement l’ARN restant sur de la glace carbonique et le conserver à -80 °C.
6. Détermination de la qualité et de la quantité de l’ARN
Déterminer la qualité de l’ARN avec l’échantillon de 1 μl sur une puce microfluidique d’électrophorèse capillaire selon le protocole du fabricant. Les préparations d’ARN total avec un numéro d’intégrité de l’ARN (NRI) supérieur à 8,5 peuvent être utilisées pour l’ARN-seq et la qRT-PCR. La sortie des données comprend également généralement la concentration approximative de l’échantillon.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La mesure la plus significative du succès de ce protocole pour la production d’ARN total par microdissection laser de tranches de moelle épinière est la valeur RIN5. Pour les échantillons d’ARN provenant d’eucaryotes supérieurs, des valeurs supérieures à 8,5 produisent régulièrement des données de séquençage et de qRT-PCR de haute qualité. Si le rendement est faible mais que la qualité est élevée, répétez la préparation. Si l’intégrité est inférieure (même 7,5-8), cependant, il est préférable de trouver la source du problème et de réessayer. Il y a beaucoup d’étapes où quelque chose peut mal tourner, mais vraiment seulement deux sources du problème - contamination endogène RNase ou contamination exogène RNase. Le premier peut être résolu par la pratique, de sorte que le temps entre le sacrifice de la souris et la congélation de son cordon intégré O.C.T est minimisé. L’autre point du protocole où la RNase endogène peut contribuer à un mauvais résultat est lors de la préparation des tranches. Chaque tranche doit adhérer rapidement à une glissière PEN à température ambiante, mais elle fondra (l’O.C.T devient clair). Plus vite la tranche peut être refrozen, mieux c’est. Le cryostat que nous utilisons a des surfaces planes à l’intérieur de la chambre qui sont à -20 °C, que nous utilisons pour regeler rapidement la tranche. Trouvez un endroit similaire dans le cryostat utilisé et assurez-vous que la tranche redevient opaque rapidement.
Traquer les sources de RNase exogène peut être difficile, car il y a tellement de possibilités. Les seuls réactifs utilisés qui ne sont pas expressément sans RNase sont O.C.T. et Azure B. Si l’Azure B a déjà fonctionné de manière satisfaisante, essayez une nouvelle bouteille d’O.C.T., bien que ce réactif n’ait jamais été un problème. Les réactifs sans RNase peuvent également être remplacés, même auprès d’un autre fournisseur. Une source beaucoup plus probable est l’enquêteur. En plus d’un nettoyage approfondi de la zone de travail, il est souvent utile qu’un autre membre du laboratoire suive et observe toutes les étapes de la procédure. Même s’il s’agit de quelqu’un qui n’effectue pas systématiquement cette procédure, un regard neuf peut capter une source de contamination autrement inaperçue.
L’extension de ce protocole à la récupération de l’ARN d’autres cellules de la moelle épinière, des cellules de la moelle épinière d’autres espèces ou de types de cellules spécifiques dans d’autres organes nécessitera des modifications dans plusieurs domaines visant à obtenir une identification claire des cellules d’intérêt tout en obviant, ou du moins en minimisant, l’impact de la RNase endogène. Dans le protocole ici, l’élimination et la congélation rapides du cordon, couplées à la coloration d’Azure B dans de l’éthanol à 70%, ont permis à la fois de minimiser la dégradation de l’ARN et d’identifier facilement les corps cellulaires des motoneurones. Azure B est une tache histochimique bien établie pour les neurones qui semble se lier à l’ARN3 et a été utilisé pour évaluer la teneur en ARN des neurones dans des échantillons d’autopsie de tissu cérébral de patients atteints de maladie neurodégénérative6. Notamment, la coloration d’Azure B n’a affecté ni l’intégrité de l’ARN purifié ni sa capacité à être transcrite et analysée à l’envers. D’autres colorants, tels que le crésyl violet7 et le bleu de toluidine8, ont été utilisés dans des protocoles LMD similaires. La collecte des corps cellulaires directement dans une solution de thiocyanate de guanidine pendant qu’ils étaient disséqués a fourni l’étape finale qui a entraîné la récupération de routine de l’ARN intact.
Des approches similaires peuvent être envisagées pour d’autres cellules et organes, reconnaissant que l’identification des cellules d’intérêt tout en minimisant ou, de préférence, en prévenant la dégradation de l’ARN par des RNases endogènes est la condition critique pour une analyse réussie. Dans les tissus qui ont des niveaux élevés de RNase, tels que le pancréas, la manipulation rapide et la basse température ont été combinées pour permettre la récupération de l’ARN des cellules β, en tirant parti de leur autofluorescence naturelle pour la visualisation9. Des procédures utilisant la souillure d’anticorps pour l’identification ont été également rapportées10,mais n’ont pas été entièrement réussies dans nos mains. Enfin, de nombreux modèles murins sont disponibles qui expriment des protéines de fusion fluorescentes(c’est-à-dire GFP, YFP, RFP) dans des cellules d’intérêt, qui pourraient être utilisées pour les identifier dans des sections tissulaires sur le microscope LMD. En fait, les souches de souris que nous avons analysées avec ce protocole expriment une protéine de fusion entre SOD1 et YFP11, et leurs motoneurones de la moelle épinière sont hautement fluorescents. Nous n’avons pas été en mesure, cependant, de trouver un ensemble de lavages à l’éthanol et/ou de conditions de déshydratation qui élimineraient simultanément l’O.C.T., inhiberaient l’activité de la RNase et maintiendraient systématiquement une fluorescence YFP suffisante pour permettre la visualisation des motoneurones et leur récupération par LMD. Peut-être qu’une nouvelle protéine fluorescente ou une variante de celles disponibles qui maintient la fluorescence dans les solvants organiques peut être trouvée pour surmonter cette limitation.

Dans les tissus de mammifères composés de plusieurs types de cellules différents, l’avènement de l’instrumentation de microdissection de capture laser (LMD) a permis de sélectionner un type de cellule spécifique pour l’analyse au niveau de l’ARN ou de la protéine. À l’heure actuelle, les techniques d’amplification et de séquençage de nouvelle génération permettent d’utiliser un pool d’ARN total provenant de quelques milliers de cellules pour obtenir un inventaire relativement complet du transcriptome, y compris l’évaluation des niveaux relatifs d’ARN et l’identification de diverses formes épissées. À ce jour, les analyses protéomiques de quelques milliers de cellules n’atteindront que des espèces plus abondantes. Par exemple, nous avons identifié <1 000 des protéines les plus abondantes de 3 000 à 4 000 corps cellulaires de motoneurones (non représentés), et Zhu et ses collègues ont récemment signalé avoir identifié 2 665 protéines d’environ 15 000 cellules tumorales1. Avec les développements ultérieurs de la spectrométrie de masse, cependant, il est probable que de telles analyses s’étendront à une profondeur beaucoup plus grande.
Ici, nous présentons un protocole spécifique utilisé pour la LMD des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris, suivi de la préparation de l’ARN. Ce protocole a été utilisé dans le cadre de la comparaison d’ARN de motoneurones de souris mutantes transgéniques présymptomatiques de superoxyde dismutase (SOD)1 de sclérose latérale amyotrophique (SLA) avec des ARN préparés à partir d’une souche transgénique SOD1 de type sauvage par validation RNA-seq et qRT-PCR2. Notamment, les motoneurones, dans la corne antérieure de la matière grise dans la moelle épinière, constituent <10% de la population cellulaire totale, entourée d’une mer d’astrocytes, et en tant que tels, leur profil transcriptionnel ne peut pas être facilement déconvolué à partir d’études de la corde entière. Une approche de capture laser est donc idéale pour analyser l’expression de l’ARN dans ces cellules, avec une physiologie préservée en excisant et en congelant rapidement le cordon suivant une brève perfusion saline intracardiaque. Les somata des motoneurones sont grands et sont donc facilement détectables, ici en utilisant un colorant qui a une forte affinité pour les neurones3. De plus, avec une telle taille, ces cellules fournissent une quantité relativement importante d’ARN par cellule capturée. La procédure utilisée, comme détaillé ci-dessous, pourrait être facilement ajustée pour obtenir d’autres types de cellules neuronales, ainsi que potentiellement d’autres types de cellules, spécifiquement identifiés par des techniques de coloration de colorant ou par la coloration d’anticorps.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

La préparation d’ARN de haute qualité à partir de cellules d’intérêt est essentielle à une analyse précise et significative des différences transcriptionnelles entre les types de cellules ou entre le même type de cellule dans la santé et la maladie ou après des traitements pharmacologiques. Dans la moelle épinière, une telle préparation à partir des motoneurones, cible d’intérêt dans de nombreuses maladies neurologiques et neurodégénératives, est compliquée par le fait que les motoneurones représentent <10% de la population cellulaire totale. La microdissection par capture laser (LMD) a été développée pour résoudre ce problème. Ici, nous décrivons un protocole pour récupérer, geler et sectionner rapidement la moelle épinière de souris pour éviter les dommages à l’ARN par les RNases endogènes et exogènes, suivis d’une coloration avec Azure B dans de l’éthanol à 70% pour identifier les motoneurones tout en maintenant la RNase endogène inhibée. LMD est ensuite utilisé pour capturer les neurones colorés directement dans le tampon de lyse du thiocyanate de guanidine, maintenant ainsi l’intégrité de l’ARN. Des techniques standard sont utilisées pour récupérer l’ARN total et mesurer son intégrité. Ce matériau peut ensuite être utilisé pour l’analyse en aval des transcriptions par RNA-seq et qRT-PCR.

Le protocole décrit ci-dessus et à la figure 1 devrait produire 50 ng ou plus d’ARN total avec un NRI de >8,5 à partir de 3 000 à 4 000 corps cellulaires de neurones moteurs de la moelle épinière disséqués des tranches de 9 à 10 20 μm sur environ 20 lames PEN. Étant donné que ce nombre de lames représente moins de 10% d’un bloc intégré en O.C.T. d’une moelle épinière de souris, il est possible de revenir au bloc, qui a été stocké à -80 ° C, et de couper plus de tranches pour passer par un autre cycle de préparation d’ARN. Si de plus grandes quantités d’ARN sont nécessaires pour une analyse, il est préférable de ne faire que le nombre de lames(par exemple 20) à la fois qui peuvent être traitées par dissection et préparation d’ARN en quelques jours, puis de faire plus de lames pour un deuxième tour et de combiner les produits. Assurez-vous d’abord de vérifier le NRI de chaque préparation pour éviter de combiner un bon avec un mauvais. Les méthodes RNA-seq deviennent de plus en plus sensibles et les nouvelles technologies de PCR promettent une sensibilité plus élevée que les méthodes actuelles. Ainsi, moins d’ARN provenant de moins de corps cellulaires neuronaux seront nécessaires, permettant une plus grande profondeur de séquençage et une validation plus complète des hits intéressants. D’autre part, le respect intégral des recommandations du MIQE pour l’analyse et la validation qRT-PCR4 peut nécessiter des quantités plus importantes pour permettre les réactions de contrôle nécessaires pour les ARN de faible abondance.
La figure 2 montre une série typique d’images d’une partie d’une section de corne ventrale de la moelle épinière après coloration et dissection Azure B. Dans le panneau A, les grands corps cellulaires sombrement colorés sont des motoneurones, confirmés par la coloration des anticorps anti-Chat2, et se différencient facilement des cellules voisines plus petites. Le panneau B montre la même région avec des corps cellulaires individuels délimités avec le stylo lumineux et numérotés par le logiciel du microscope. Les contours suivent de près les marges des corps cellulaires, avec une petite tolérance pour la largeur de coupe du laser. Cet espacement doit être déterminé pour chaque réglage de puissance laser afin de minimiser l’inclusion de matériel superflu tout en évitant la perte de cytosol de neurone moteur. Les panneaux C et D montrent la section après que le laser a coupé et que les corps cellulaires individuels sont tombés dans le bouchon de collecte. Notez que la marge de coupe ne suit pas exactement le contour du stylet clair dans le panneau C, mais reste en grande partie en dehors de celui-ci. Cette irrégularité est apparente dans le panneau D, tout comme la zone assombrie autour de chaque coupe, qui reflète les dommages causés par la chaleur au tissu par le laser. Pour cette raison, si deux corps cellulaires sont très proches l’un de l’autre, il est préférable de les décrire pour une seule coupe, plutôt que d’essayer de les couper séparément et de perdre de l’ARN pour chauffer les dommages dans leur région de contact proche.
La figure 3 montre les résultats typiques d’une analyse électrophorétique de l’intégrité de l’ARN d’un échantillon d’ARN préparé à partir d’environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones de souris collectés par LMD. Le panneau supérieur est l’électrophérogramme produit par 1 μl de l’ARN total; l’encart à droite est une image du gel. Dans les deux cas, notez les pics d’ARN ribosomique proéminents. Le panneau inférieur est l’électrophérogramme de la voie contenant des étalons de taille d’ARN. Le logiciel d’analyse a calculé un NRI de 9,8 pour cet échantillon, avec une concentration de 4,9 ng/μl. Un total de 13 μl de cette solution était disponible après l’analyse, fournissant 64 ng d’ARN pour la validation qRT-PCR en aval des quantités de transcription. Pour une analyse qRT-PCR typique de transcriptions modérément abondantes, 0,15-0,20 ng d’ARN total est suffisant pour produire une quantification précise2,de sorte que la quantité d’ARN disponible à partir de cette préparation est suffisante pour valider un certain nombre de transcriptions avec plusieurs ensembles d’amorces, comme recommandé4. Bien sûr, de plus grandes quantités d’ARN d’entrée peuvent être utilisées pour permettre la validation de transcriptions rares. Cette quantité est également plus que suffisante pour permettre la préparation de la bibliothèque et l’ARN-seq de nouvelle génération.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Figure 1. Vue d’ensemble de la production de tranches de moelle épinière et de la microdissection de capture laser des corps cellulaires des neurones moteurs de la moelle épinière. A)Principales étapes de la production de tranches et de la coloration. B) Vue de dessin animé de la section de la moelle épinière et de la dissection au laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Figure 2. Images avant et après d’une dissection au laser de corps de cellules de motoneurones colorés Azure B. A) Partie de la corne ventrale d’une section tachée. Notez les quatre grandes cellules sombrement colorées. Il y a aussi quelques cellules légèrement colorées et un peu plus petites, qui ne sont pas des motoneurones (confirmées par une coloration anticorps anti-Chat; non montrées, mais voir Bandyopadhyay2) et qui ne seront pas sélectionnées pour la dissection. Les nombreuses petites taches sombres sont probablement des processus neuronaux (dendrites et axones), mais cela n’a pas été confirmé. B) Les quatre corps cellulaires délimités par le stylo lumineux. Notez que les contours suivent de près les marges des cellules, avec une distance minimale entre elles. Cet espacement doit être établi empiriquement pour chaque microscope et laser. Le logiciel numérote les neurones individuels, ce qui simplifie le suivi du nombre de neurones collectés. C et D) Après que le laser a coupé et les morceaux contenant les corps cellulaires sont tombés dans le capuchon de collecte. Notez que le trou laissé derrière est un peu plus grand que le contour et est irrégulier. Cela reflète la largeur du faisceau laser et son efficacité de coupe légèrement variable en fonction de la composition locale du tissu. Le bord du tissu assombri entourant chaque trou en raison des dommages de chauffage local causés par le laser est également apparent. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Figure 3. Analyse électrophorétique de l’intégrité de l’ARN préparé à partir d’échantillons LMD. A)Une aliquote de 1 μl de l’ARN préparée à partir d’environ 4 000 corps cellulaires de motoneurones par le protocole ci-dessus a été analysée par électrophorèse microcapillaire sur une puce microfluidique. L’électrophérogramme est montré, avec des pics d’ARN ribosomique proéminents. Sur la droite se trouve une image du gel lui-même. B) L’électrophérogramme des étalons de taille est montré, avec la voie de gel correspondante à droite. Le logiciel de l’instrument a calculé un NRI de 9,8 pour cet échantillon et une concentration de 4,9 ng/μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

L’ARN total de haute qualité a été préparé à partir des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser après coloration des sections de la moelle épinière avec Azure B dans de l’éthanol à 70%. Un ARN suffisant (~40-60 ng) est récupéré à partir de 3 000 à 4 000 motoneurones pour permettre l’analyse de l’ARN en aval par ARN-seq et qRT-PCR.

Production d’ARN pour l’analyse transcriptomique à partir de corps cellulaires de motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K vues.  Yale School of Medicine. L’ARN total de haute qualité a été préparé à partir des corps cellulaires des motoneurones de la moelle épinière de souris par microdissection de capture laser après coloration des sections de la moelle épinière avec Azure B dans de l’éthanol à 70%. Un ARN suffisant (~40-60 ng) est récupéré à partir de 3 000 à 4 000 motoneurones pour permettre l’analyse de l’ARN en aval par ARN-seq et qRT-PCR.

Vidéo: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Recherche

Neurosciences

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Microdissection par capture laser de populations enrichies de neurones neurones isolés ou pour l&#39;analyse d&#39;expression génique après un traumatisme crânien

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Microdissection laser de neurones à partir de cellules différenciées Neuroprogenitor humaines en culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Comprendre les réponses des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la stimulation de la moelle épinière - Explorer les réponses cellulaires des motoneurones grâce à l’électrophysiologie par patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...