CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1. électroporer la construction d&#39;intérêt dans les tubes neuraux de HH12-13 embryons de poulet in ovo Utilisez un rapporteur fluorescent, de préférence dans une transcription bicistronique ou fusionnée à la protéine d&#39;intérêt avec un 2a virale intercalant peptide 11, pour permettre l&#39;identification rapide des individus avec des niveaux satisfaisants de transfection. REMARQUE: Le temps d&#39;incubation typique pour ce stade est d&#39;environ 48 heures à 37,8 ° C. <ol><li> Ouvrir une petite fenêtre dans les œufs après avoir enlevé 3 ml d&#39;albumine avec une seringue couplée à un 18 G x 1 1/2 aiguille. Pour améliorer la visualisation embryon, injecter une petite quantité d&#39;encre de Chine diluée à 1:50 dans la solution de Ringer stérile sous l&#39;embryon 1-4. </li><li> Après avoir recouvert l&#39;embryon avec une solution de Ringer stérile, injecter une solution 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 et 0,1% de colorant alimentaire (F, D &amp; C) contenant 2,5 pg / pl d&#39;ADN à travers l&#39;extrémité postérieure du tube neural jusqu&#39;à ce qu&#39;il remplissejusqu&#39;à la région du cerveau postérieur. Pour l&#39;électroporation, des électrodes de platine de positionnement (0,5 mm) de diamètre 4 mm séparées par une région le long du flanc et de fournir des impulsions de 5 à 50 ms et 20 V avec un intervalle de 100 ms entre les quatre. </li><li> Après électroporation, incuber embryons manipulés pendant 48 heures de plus jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent HH23 de stade et d&#39;identifier les personnes présentant un niveau élevé de transfection à la région flanc sous un stéréomicroscope fluorescent. REMARQUE: La durée d&#39;incubation après l&#39;électroporation dépend du but de l&#39;expérience. Les plasmides par électroporation peuvent générer des niveaux d&#39;expression importants après 2 h 2. Ainsi, si l&#39;intérêt réside dans les gènes de l&#39;apparition précoce de la période d&#39;incubation post-électroporation peut être réduite. </li></ol> 2. Récolte succès transfectées embryons et disséquer les moitiés de la moelle épinière électroporation Remarque: Cette procédure dure 2 à 3 heures pour 10 embryons et les rendements 1-2 Ug d&#39;ARN total par embryon. La dissection de tubes neuraux nécessite des mouvements fins et quelques séances de pratique peut être nécessaire avant de l&#39;appliquer à des échantillons expérimentaux. <ol><li> Décontaminer les outils de dissection métalliques avec une solution de décontamination RNase ou par cuisson à 150 ° C pendant 4 heures et 12 préparer traitée au DEPC PBS. Utilisez uniquement du matériel en plastique sans RNase certifié. NOTE: Après la récolte, il est important de suivre un traitement standard pour prévenir la contamination RNase lors de la dissection. </li><li> Récolter les embryons en utilisant une paire de ciseaux fins de dissection et une collection cuillère tamisé. Gardez les embryons dans le froid traitée au DEPC PBS dans une boîte de 100 mm de Pétri. </li><li> Avec une paire de pinces fines, découper la région du flanc ensemble (entre la limite postérieure du bourgeon de membre antérieur et la limite antérieure du bourgeon de membre postérieur) et transférer cette section à un nouveau plat contenant froid traitée au DEPC PBS. </li><li> Utilisez deux aiguilles fines de verre de perforer à trois différentsles points de chaque côté dorsolatéral de l&#39;embryon entre le tube neural et le mésoderme paraxial. </li><li> Introduire les deux aiguilles de verre dans la perforation centrale et se déplacent lentement l&#39;un d&#39;entre eux une distance le long de l&#39;axe antéro-postérieur du tube neural. Répétez cette opération pour les perforations qui ne sont pas atteints par les premiers mouvements. Retirez le mésoderme paraxial individuelle avec une paire de pinces fines. </li><li> Tourner l&#39;embryon côté, insérer les extrémités des pinces entre le tube neural et la notochorde et faites-les glisser dans des directions opposées le long de l&#39;axe antéro-postérieur de séparer les deux structures. NOTE: Ce devrait également éliminer la plupart du mésoderme encore attachés au tube neural. </li><li> Si nécessaire, retirez les morceaux plus gros de tissu mésodermique qui restent attachées en tirant avec une pince à épiler tout en tenant légèrement le tube neural avec une autre paire de pinces. Lorsque vous avez terminé, doucement transférer le tube neural à un autre plat contenant PBS froid de DEPC-traités à l&#39;aide d&#39;unRNase-free pipette Pasteur en verre reliée à une pompe manuelle de la pipette et de garder sur de la glace jusqu&#39;à ce que tous les tubes sont disséqués. </li><li> Diviser les tubes neuraux en deux moitiés. Pour cela, insérez la pointe acérée d&#39;une paire de pinces fermé dans la lumière et ouvrir la plaque de toit en déplaçant les pinces à travers elle. Après cela, séparer les deux moitiés en coupant la plaque de fond avec les pincettes conseils. </li><li> Trier électroporation moitiés de non-électroporation sous un microscope à dissection à fluorescence et le transfert d&#39;un tube de 1,5 ml rempli avec glacée traitée au DEPC PBS. Si nécessaire, feuilleter les microtubes doucement pour libérer tous les tissus fixés aux parois en matière plastique et de favoriser la sédimentation des tubes. </li><li> Spin à 100 g pendant 3 secondes et enlever très lentement autant que possible PBS avec 1 ml micropipette. Pour ce faire, tout en regardant une source de lumière qui brille à travers le microtube pour surveiller si tout matériel embryonnaire est aspiré à la pointe de la pipette; si cela se produit, décharger lentement et répéter la centrifugation. </li><li> Ajouter 70 ul de solution de lyse pour l&#39;extraction de l&#39;ARN par neural moitié du tube et secouez le tube pour mélanger le contenu. Incuber à température ambiante pendant 5 min et vigoureusement vortex. Répéter l&#39;incubation de 5 min et agitation au vortex à deux reprises. Conserver à -80 ° C. </li><li> Recueillir au moins huit moitiés du tube neural par exemple pour assurer un rendement adéquat pour l&#39;étape suivante. En commun des échantillons plus petits si plusieurs sessions électroporation / dissection doivent amasser un nombre suffisant de tubes neuraux. Stocker suffisamment d&#39;échantillons pour des doubles ou des triples exemplaires pour chaque condition. </li></ol> 3. Purifier l&#39;ARN et préparer des banques pour Illumina séquençage <ol><li> Retirer les échantillons de -80 ° C stockage et placer sur la glace pendant 15-30 min. Reprendre décongélation à température ambiante jusqu&#39;à la fin. </li><li> Vortex bien et laissez à température ambiante pendant 5 min. Vortex nouveau et centrifuger à 15 000 g pendant 1 min à granulés insoluble. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tubeet procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN selon le total isolement d&#39;ARN instructions du manuel du kit. On élue dans le volume minimum recommandé pour augmenter la concentration. REMARQUE: traitement à la DNase après nettoyage est recommandé afin d&#39;éviter la contamination potentielle des séquences d&#39;ADN génomique dans les ensembles de données d&#39;ARN-Seq. </li><li> Feuilletez le tube pour mélanger le contenu et enlever 5 pi pour l&#39;analyse de contrôle de la qualité. Conserver l&#39;échantillon restant à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la préparation bibliothèque; Ces échantillons doivent être décongelés que une fois pour éviter la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Exécutez ARN purifié dans un instrument Bioanalyzer utilisant le kit RNA 6000 Nano; Valeur RIN doit être au moins au-dessus de 7 pour continuer. </li><li> Générer des bibliothèques en utilisant un kit de préparation de bibliothèque Illumina compatible ARN-Seq et multiplexer jusqu&#39;à 4 bibliothèques dans une voie d&#39;un instrument de HiSeq mis à produire 100 pb seul lit. Si possible, inclure tous les échantillons dans la même série de minimiser les artefacts techniques potentiels. NOTE: Ce devrait produire jusqu&#39;à 50 millions de rEADS par exemple, qui est plus que suffisant pour obtenir une couverture pour la plupart des gènes 13. </li></ol> 4. Comparer les ensembles de données d&#39;ARN-Seq dans le serveur Galaxy publique 10. REMARQUE: l&#39;espace de stockage du serveur est limité et expériences comparant de nombreux échantillons peut exiger la suppression des fichiers intermédiaires générés dans les étapes de filtrage. <ol><li> Créez un compte d&#39;utilisateur dans le serveur public Galaxy ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) et FTP télécharger les jeux de données Illumina au format fastq. </li><li> Préparer les fichiers téléchargés avec l&#39;outil FastqGroomer 14 sous la NGS: Menu QC et la manipulation; si les scores de qualité sont déjà codés dans Phred + 33 (Sanger), ignorez cette étape en changeant simplement le type de fichier à fastqsanger sous les attributs de chaque ensemble de données. </li><li> Analyser la qualité générale de chaque ensemble de données en utilisant l&#39;outil FastQC sous la NGS: QC et manipulation moinu. REMARQUE: Une attention particulière doit être accordée aux graphiques qui en résultent pour le contenu de la séquence par la qualité de la séquence de base et par la base, car ceux-ci de fournir des estimations pour les paramètres utilisés pour tailler les extrémités du lit. </li><li> Garniture lit à jeter des extrémités 3 &#39;des données de faible qualité à l&#39;aide de l&#39;outil FASTQ qualité Trimmer 14 sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l&#39;outil de ne traiter que des extrémités 3 &#39;pour le niveau de qualité en dessous de 20. </li><li> Retirer séquences d&#39;adaptation de lit à l&#39;aide de l&#39;outil Clip ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sous la NGS: Menu QC et manipulation. Régler l&#39;outil à jeter lit à moins de 45 pb à gauche, saisir la séquence de l&#39;adaptateur utilisé et choisir la sortie d&#39;inclure les deux séquences coupées et non tronquée. En outre, choisir de ne pas jeter des séquences avec des bases inconnues puisque la plupart des bases de faible qualité ont déjà été supprimés dans la dernière étape. </li&gt; <li> Utilisation de l&#39;outil séquences TRIM ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sous la NGS: QC et le menu de manipulation, couper les premières bases de la lecture de se retirer 5 partialité »de séquence détectée par FastQC (généralement 10). NOTE: A ce stade, il est une bonne idée de lancer FastQC nouveau et comparer avec l&#39;analyse précédente pour déterminer si la qualité de l&#39;ensemble de données a été améliorée. </li><li> Téléchargez et décompressez la dernière assemblée du génome du poulet pour le navigateur de génome UCSC d&#39;Illumina iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) et télécharger l&#39;ensemble du fichier de format fasta génome et le fichier d&#39;annotation des gènes de format gtf à l&#39;histoire Galaxy utilisant le fichier de téléchargement de l&#39;outil dans le menu Get Data. </li><li> Carte lit pour chaque échantillon pour le génome du poulet à l&#39;aide du dispositif d&#39;alignement 15 sous TopHat2les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d&#39;utiliser un génome de l&#39;Histoire (sélectionnez le fichier fasta téléchargé à l&#39;étape 4.7). </li><li> Construire un transcriptome prédite pour chaque échantillon à l&#39;aide de manchette 16 sous les NGS: Menu Analyse ARN. Choisissez d&#39;utiliser l&#39;annotation de référence comme guide (sélectionnez le fichier téléchargé à l&#39;étape gtf 4.7) et tourner sur les options Effectuer correction du biais (de l&#39;Histoire, fichier fasta de l&#39;étape 4.7) et multi-usage lire correct. </li><li> Fusionner transcriptomes prévues pour tous les échantillons à l&#39;aide Cuffmerge 16 sous la NGS: Menu ARN analyse. Choisissez d&#39;utiliser l&#39;annotation de référence (fichier gtf de l&#39;étape 4.7) et les données de séquence (de l&#39;Histoire, fichier fasta de l&#39;étape 4.7). </li><li> Comparer les fichiers générés par BAM TopHat2 pour chaque échantillon en utilisant Cuffdiff 16 sous la NGS: Menu ARN analyse. Dans les transcriptions de terrain sélectionner le moitranscriptome rged généré par Cuffmerge et activer les options Effectuer correction du biais (de l&#39;Histoire, fichier fasta de l&#39;étape 4.7) et multi-usage lire correct. </li><li> Trier expression différentielle tester tables numérique croissant dans la colonne 13 (valeur de q) à l&#39;aide de l&#39;outil Trier sous le filtre et le menu Trier. NOTE: Les gènes / transcriptions montrant une expression différentielle significative entre les conditions expérimentales présentera les valeurs de q plus bas. </li><li> Pour vérifier les résultats visuellement avec des graphiques de couverture, d&#39;abord convertir les fichiers au format BAM bedGraph utilisant l&#39;outil Créer une BedGraph de couverture du génome 17 sous le menu bedtools. Désactiver le rapport de régions sans couverture, choisir de traiter les entrées d&#39;épissage que des intervalles distincts et l&#39;échelle de la couverture par un facteur qui normalise profondeur de séquençage pour tous les ensembles de données comparées. </li><li> Convertir le fichier résultant au format bedGraph Bigwig l&#39;aide de laoutil perruque / BedGraph à gros bonnet ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) dans le menu des formats de convertir. Téléchargez les fichiers gros bonnets comme des pistes coutume dans le navigateur de génome UCSC ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) pour l&#39;assemblage galGal4 et rechercher un gène d&#39;intérêt à visualiser la couverture dans les ensembles de données. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ici nous fournissons des lignes directrices pour l&#39;analyse des effets après l&#39;électroporation de la poule de la moelle épinière. Bien que l&#39;électroporation de vecteurs d&#39;ADN est plus fréquemment utilisé pour surexprimer un gène d&#39;intérêt, on peut aussi utiliser des constructions codant des dominants négatifs, protéines quimeric ou précurseurs de siRNA pour créer les conditions fonction des gènes knock-down 19-21. En effet, la comparaison des profils de transcriptome résulta...

Les études génétiques sur les organismes vivants utilisent fréquemment l&#39;embryon de poulet comme modèle parce que dans l&#39;électroporation in ovo représente un moyen rapide et peu coûteux pour la transfection partiellement structures embryonnaires in vivo avec des constructions d&#39;ADN 1-5. Des vecteurs d&#39;expression bicistronique qui codent pour un produit de transcription contenant un rapporteur fluorescent en même temps que le gène d&#39;intérêt, comme pCIG 6 ou 7 PMES, permettent une vérification rapide de la qualité de la transfection dans la région souhaitée sous un stéréomicroscope avant de traiter les embryons pour l&#39;analyse en aval. Avec les progrès récents dans le séquençage de l&#39;ADN, il est maintenant possible d&#39;obtenir des profils d&#39;expression numériques entières du transcriptome à partir d&#39;échantillons d&#39;ARN en utilisant l&#39;ARN-Seq 8,9. Par conséquent, au lieu des méthodes fastidieuses qui permettent l&#39;analyse de seulement un petit nombre de produits de gènes en parallèle, telles que l&#39;hybridation in situ, immunohistochimie et PCR quantitative, la préparation de banques d&#39;ADNc pour enséquençage à haut débit peut fournir des informations de l&#39;ensemble du transcriptome. Observation des effets expérimentaux sur les niveaux de tous les gènes d&#39;expression peut à son tour conduire à dégager sur les voies modifiés par la construction utilisée. Ceci est particulièrement facile si un assemblage génomique de l&#39;organisme utilisé est disponible, donc l&#39;embryon de poulet est de nouveau un modèle approprié. Si l&#39;utilisateur a accès à un centre de séquençage du génome fiable, le principal problème est l&#39;obtention d&#39;échantillons d&#39;ARN de haute qualité. Ce travail démontre une méthode pour obtenir des échantillons d&#39;ARN à partir de tubes de neurones transfectées appropriés pour l&#39;ARN-Seq, ainsi que les étapes en aval pour l&#39;analyse in silico des ensembles de données obtenus. Après électroporation à HH12-13 suivie par 48 heures d&#39;incubation, le tronc transfectées moitiés de la moelle épinière ont été disséqués dans des conditions exemptes de ribonucléase, immédiatement lysées et plus protégés de la dégradation par ultra-bas jusqu&#39;à ce que le gel purification d&#39;ARN et bibliothèque preparation. Le serveur public Galaxy 10 donne accès à des ressources gratuites pour l&#39;analyse des données de séquençage à haut débit. La quantité d&#39;espace offert pour les utilisateurs enregistrés est suffisant pour de petites expériences, éliminant ainsi le besoin d&#39;une infrastructure informatique locale. L&#39;analyse des données de l&#39;ARN-Seq comprend le filtrage, l&#39;alignement et la quantification / comparaison de l&#39;expression du gène. Bien qu&#39;il existe des lignes directrices générales pour l&#39;analyse des données de l&#39;ARN-Seq, les paramètres de filtrage dépendra en grande partie sur la qualité de séquençage et devraient être déterminés après analyse de contrôle de la qualité des données brutes. Ce protocole décrit les étapes pour obtenir et comparer les profils d&#39;ARN-Seq de poulet embryonnaire de la moelle épinière transfectées in vivo. Comme un résultat représentatif, la comparaison des ensembles de données obtenues à partir de deux échantillons de contrôle indépendants transfectées avec un vecteur vide ont montré que le procédé est reproductible et devrait permettre l&#39;identification de différentiellement exprestranscriptions sed dans les échantillons expérimentaux. Par conséquent, l&#39;application de cette méthode a le potentiel d&#39;augmenter considérablement le nombre de découvertes après une expérience unique et de fournir ainsi un vaste ensemble de données pour l&#39;enquête subséquente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indian &#236;nk</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18G x 1 1/2 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F D &#38; C Blue 1</td>
			<td>Spectra Colors Corporation</td>
			<td>5.FC.0010P0</td>
			<td>Food Dye used to visualize DNA injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ringer&#39;s solution (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 7.2 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.37 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.225 g CaCl2.2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.217 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.02 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Filter and autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 8 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1.15 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L and filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sieved spoon</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZap RNase decontamination solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine point surgical scissors</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Straight fine point tweezers</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>40A502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9&#39;&#39; glass Pasteur pipette</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Manual pipette pump</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAlater solution for RNA stabilization</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAqueous total RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Biology Grade Ethanol</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001/RS-122-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

Pour valider la méthode décrite, deux échantillons de contrôle ont été générés à partir d&#39;embryons électroporées avec le vecteur PMES vide 7 et un échantillon à partir d&#39;embryons transfectées avec le même vecteur contenant l&#39;insert construire SCRT2-ZNF, qui code pour les domaines en doigt de zinc de poulet SCRT2 18. Les échantillons donnant des 11 à 22 pg d&#39;ARN total ont été obtenus chacun à partir de pools de 8 à 12 embryons. Les trois échantillons ont obtenu...

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RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K vues.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Vidéo: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Recherche

Neurosciences

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

La moelle épinière électrophysiologie II: fabrication des électrodes extracellulaires d&#39;aspiration

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Dissection et la culture de cellules de ganglions et de Chick Statoacoustic explants moelle épinière dans des gels de collagène pour des essais de neurites

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissection et montage latéral embryons de poisson zèbre: Analyse de la moelle épinière développement

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...