DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOTE: Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices fixées par le comité soin et l&#39;utilisation institutionnelle animale de l&#39;Université de Louisville, en adhérant à la réglementation fédérale. 1. Préparation de faible Ca 2+ et 2 mM de Ca 2+ liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) perfusats <ol><li> Préparer faible teneur en Ca 2+ (0,1 mm) C tampon 2x, 2x Ca normale 2+ (2 mm) Un tampon, et le tampon 2x Stock B comme décrit dans le tableau 1. Les solutions d&#39;achat d&#39;actions individuelles permettent de modifier le contenu d&#39;ions (par exemple, faible ou nulle Ca2 +) et peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> Pour perfusion intracardiaque lors de la dissection, ajouter 100 ml de 2x faible teneur en Ca 2+ Stock C et 100 ml de 2x Stock B dans une bouteille de plastique pour faire faible teneur en Ca 2+ 1x aCSF. Mélanger et stocker une nuit à 4 ° C ou faire frais. </li><li> Pour perfusion ex vivo de la moelle épinière au cours imagING, ajouter 500 ml de 2x normale Ca 2+ Stock A et 500 ml de 2x Stock B dans une bouteille en verre de 1 L pour générer 1x aCSF. Mélanger et stocker nuit à la température ambiante ou faire des frais. </li><li> Ajuster le pH de tampons ACSF à 7,4. Tout en gardant l&#39;aCSF à la température ambiante, placez le bas Ca 2+ aCSF sur la glace, puis bulle deux tampons avec du gaz carbogène (95% de O 2; 5% de CO 2) pendant 30 minutes avant utilisation et en continu pendant la perfusion. </li></ol> 2. Préparation de Ex Vivo Chambre Imaging <ol><li> Enveloppez une couverture chauffante (pas de coupure automatique) autour de la bouteille de aCSF et ajuster la chaleur à basse température / moyen. </li><li> Insertion d&#39;une ligne de perfusion aCSF dédié dans la bouteille reliée à une pompe de perfusion et en ligne chauffage qui est commandé par une sonde de température du régulateur de température et de rétroaction bipolaire comme représenté sur la figure 1A. </li><li> Fixez un insert de platine du microscope plat (152 x 102 mm) à la 2-photon excitation / confvecinal platine du microscope équipé d&#39;un récipient de déversement. </li><li> Placez une grande chambre de perfusion bain ouvert (L x P x H; 12 x 24 x 8 mm) dans le récipient de déversement d&#39;accueillir et de fournir un flux continu de frais oxygénée aCSF à l&#39;ex vivo de la moelle épinière (voir Figure 1B pour un ex appropriée imagerie in vivo conception de la chambre). </li><li> Connectez le port de sortie de métal de l&#39;appareil de chauffage en ligne à la chambre ex vivo d&#39;imagerie utilisant des tubes appropriés. Placez un tampon absorbant mince sous la chambre ex vivo d&#39;imagerie pour aider à maintenir la température de la mémoire tampon / tissu lors de l&#39;imagerie. </li><li> Respecter la chambre ex vivo d&#39;imagerie au fond de l&#39;insert conteneur de déversements / stade utilisant gommette amovible. La malléabilité du collant collant permettra à la chambre d&#39;être ajusté selon les besoins pour assurer trajet de la lumière de l&#39;objectif soit perpendiculaire à la surface du tissu. Si nécessaire, utilisez un niveau à bulle pour ajuster la chambre. </li><li> Fixer unsonde en ligne rétroaction température du dispositif de chauffage à proximité de l&#39;entrée de fluide de la chambre et un tube d&#39;aspiration en acier inoxydable reliée à une ligne de vide à la sortie de la chambre. Supports de bande magnétique et micropipette appropriée sont utiles à cet égard. Allumer la source de vide. </li><li> Tournez sur la pompe à perfusion de commencer à remplir la chambre d&#39;imagerie avec aCSF oxygéné. Régler la pompe de perfusion à 1,5-2 ml par min. </li><li> Contrôler le volume de aCSF dans la chambre de formation d&#39;image en ajustant la ligne de vide. Il est important qu&#39;il y ait suffisamment aCSF dans la chambre de formation d&#39;image afin de couvrir le segment de la moelle épinière et permettre distance de travail suffisant entre un objectif d&#39;immersion de l&#39;eau et la surface du tissu. Myéline et les axones peuvent être altérées si le segment de tissu ne est pas complètement immergé dans l&#39;eau douce oxygénée aCSF leader artefacts expérimentateur induits. </li><li> Ajuster le contrôleur de température en ligne du dispositif de chauffage de sorte que la température de liquide de perfusion dans la chambre d&#39;imagerie est proche de la température ambiante. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissection des adultes de la moelle épinière cervicale murin <ol><li> Euthanasier un adulte âgé de 6 à 10 semaines Thy1 YFP souris transgénique (utilisation souche appropriée qui a expression de la protéine fluorescente dans des neurones ganglionnaires de la racine dorsale) par injection d&#39;une dose excessive de l&#39;anesthésie au pentobarbital de sodium (200 mg / kg) par injection intrapéritonéale. </li><li> Une fois sous le niveau approprié de l&#39;anesthésie (par exemple, pas de réaction à pincement de l&#39;orteil et la perte de réflexe de clignement), raser soigneusement la peau recouvrant la moelle épinière et le cerveau avec une tondeuse chirurgicales. Nettoyer la peau à l&#39;aide de la bétadine et plaquettes éthanol 70%. </li><li> Vaporiser le buste / abdomen avec 70% d&#39;éthanol, puis perfuser le sujet transcardiaque utilisant réfrigérés, carbogène-barboter faible teneur en Ca 2+ aCSF. (Voir la figure 1C pour suggéré banc de dissection supérieure mis en place). </li><li> Comme le foie ne est rien, fixer l&#39;aiguille de perfusion dans le coeur en utilisant un petit clip. Tourner le sujet au cours d&#39;accéder à la face dorsale rasée dele sujet et essuyez la zone rasée avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Faire une incision de la peau dorsale le long de la ligne médiane à partir de nez à la hanche avec des ciseaux de dissection pour exposer le cerveau et la colonne vertébrale (figure 2A). Fixer la préparation en plaçant broches au niveau du nez et de jarret. </li><li> En utilisant un microscope de dissection partir de ce point, bien couper à travers la surface dorsale du crâne au niveau des bulbes olfactifs. Insérez l&#39;un des conseils de ciseaux dans les bords latéraux de l&#39;incision et couper le long des bords de la calotte bilatéralement jusqu&#39;à ce que le cervelet. REMARQUE: Ne pas exciser complètement la calotte comme il est nécessaire plus tard pour soulever le tissu recouvrant de la moelle épinière à travers la dissection (voir la figure 2B). </li><li> Soulevez la calotte d&#39;exposer le cerveau. Couper délicatement les bords gauche et droit de l&#39;os interpariétal (situé au cervelet) et le tirer en arrière pour exposer caudale du tronc cérébral / moelle épinière (figure 2C </strong&gt;). </li><li> Utilisez des ciseaux fine pointe de détenus à un angle de 45 ° par rapport à la surface de la table et couper les vertèbres bilatéral juste inférieur aux racines nerveuses postérieure. REMARQUE: Eviter le contact avec les colonnes dorsales blanches lumineuses. Ces fibres sont ceux qui seront imagés (Figure 2D) et peuvent être facilement endommagés. </li><li> Soulevez la surface de la calotte et dorsale de la colonne vertébrale avec pince fine à pointe, en tirant doucement le tissu recouvrant en une seule pièce que les coupes sont faites pour exposer la moelle épinière. Continuer à couper vertèbres au niveau thoracique supérieure pour isoler un segment de 1-2 cm de la moelle cervicale pour l&#39;imagerie ultérieure (figure 2E). </li><li> Utilisez des ciseaux pour couper le tissu / os parallèlement à la colonne vertébrale et les tissus clair sous la colonne. Faire ces coupures que le niveau que possible. Il est très important que le tissu se trouve à plat dans la chambre de manière que le cordon soit au niveau de l&#39;imagerie. </li><li> Utiliser un scalpel # 11 à sectionner le tronc cérébral (au-delà ducessation des fibres de faisceau gracile) et au niveau thoracique supérieure pour isoler le segment cervical de la moelle épinière (Voir Figure 2F). Utilisez des ciseaux pour couper le tissu / os à ces deux mêmes points. Le tissu isolé devrait contenir 2/3 de la colonne vertébrale qui englobe le tronc cérébral caudal, l&#39;élargissement du col, et la moelle épinière thoracique supérieure (figure 2G). </li><li> Placez la colonne vertébrale isolée dans une boîte de Pétri de carbogène-barboter, faible teneur en Ca 2+ aCSF réfrigérés. Si nécessaire, couper le tissu en dessous de la colonne vertébrale jusqu&#39;à ce qu&#39;il repose à plat dans le plat. </li><li> Transférer la colonne vertébrale isolée à la chambre d&#39;imagerie ex vivo et augmenter progressivement la température de perfusion en 1 heure à 36-37 ° C. Maintenir cette température pendant l&#39;imagerie. </li></ol> 4. Le placement des ex vivo de la moelle épinière en imagerie Chambre et myéline marquage avec du Nil Rouge <ol><li> Fixez soigneusement la colonne vertébrale dans le ichambre de forgemagie d&#39;une tranche raccord approprié maintenez enfoncée modifié avec une plate-forme de grille verticale composée de fins fils de lycra (retirer les fils moyen de plate-forme de grille pour laisser place à la moelle épinière; voir la figure 3A). </li><li> Décongeler une aliquote de rouge Nil (5 mM dans du DMSO et 0,22 um filtré; peuvent être stockées pendant 1 mois à 4 ° C ou 6 mois à -20 ° C dans l&#39;obscurité). Juste avant l&#39;ajout de rouge Nil à la chambre de formation d&#39;image, de réduire le débit de la pompe de perfusion et d&#39;ajuster la ligne de vide pour assurer le fluide dans la chambre recouvre toujours la moelle épinière. </li><li> Ajouter 5-10 ul rouge Nil solution stock à la chambre d&#39;imagerie près de l&#39;extrémité caudale du cordon (figure 3B). Utilisez un 1 ml pipette pour mélanger doucement rouge Nil dans toute la chambre. Laisser rouge Nil de rester dans la chambre pendant 1-2 min, puis placez ligne de vide en arrière et régler la pompe de perfusion à 1,5-2 ml par min pour perfuser constamment la moelle épinière. </li><li> Soulevez avec précaution la platine du microscopeet aligner l&#39;objectif avec le centre du segment de la moelle épinière et en dedans sur les colonnes dorsales jusqu&#39;à ce que l&#39;objectif à immersion dans l&#39;eau est d&#39;environ 10 mm de la surface de la aCSF dans la chambre. Utilisez le microscope roue nez de mise au point porter lentement l&#39;objectif jusqu&#39;à ce qu&#39;il touche légèrement la surface de la aCSF. Utilisez une source de lumière épifluorescente de concentrer les colonnes dorsales dans le champ de vision (figure 3C). </li></ol> 5. imagerie ex vivo de la moelle épinière de souris avec TPLSM et induite par laser Spinal Cord Injury (Lisci) NOTE: La veine postérieure fournit un marqueur utile de centrer le tissu que les fibres de faisceau gracile (proviennent de corps cellulaire des ganglions rachidiens et monter de T6 et ci-dessous le long de la ligne médiane de la moelle épinière) se étendent parallèlement à ce vaisseau sanguin. Les plus épais YFP + cervicales projections de racine dorsale fournissent également un marqueur utile que les fibres montent et descendent latéralement au YPF + faisceau gracile fibres qui sont plus petites en diamètre. <ol><li> Une fois le tissu de la moelle épinière est aligné correctement, passez en mode de balayage laser pour effectuer l&#39;imagerie de base des fibres myélinisées de faisceau gracile ascendant. Pour exciter les deux YFP et rouge Nil, utiliser une source laser à deux photons réglé à 950 nm de longueur d&#39;onde (~ 17 mW mesurée à la sortie d&#39;un 25X, 1,1 objectif NA) et dichroïques appropriés (DM) et les filtres passe-bande pour isoler l&#39;émission fluorescente des fluorophores (nous utilisons 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 et, pour séparer la YFP et rouge Nil en jaune-orange, et étendus canaux rouge, respectivement). <ol><li> Si plus de 3% des axones montrent sphéroïdes axonales lors de l&#39;imagerie de base (30-60 min), jeter la préparation en raison d&#39;artefacts induite expérimentateur. </li></ol></li><li> Induire une Lisci en grossissant le champ de vision à 30.3X (pour créer un diamètre ablation ~ 20 um). Accorder le laser à 800 nm, et d&#39;augmenter la puissance du laser de 110 mW à ~l&#39;échantillon. Autoriser 5 champ complet de balayages laser vue d&#39;assurer fibres sont complètement sectionnés. </li><li> Confirmez Lisci en modifiant les paramètres de laser aux paramètres d&#39;imagerie (950 nm, 17 mW à l&#39;échantillon, 2.08X) et numériser le tissu de visualiser l&#39;ablation. Vérifiez que le diamètre de l&#39;ablation et que les axones ablation primaires sont complètement sectionné (voir la figure 3D). Utiliser les paramètres time-lapse sur le microscope combiné avec z capture pour enregistrer la réponse dynamique des axones et la myéline d&#39;une blessure jusqu&#39;à 8-10 + h après une blessure. NOTE: Si l&#39;ablation est incomplète (ie, transection incomplète de fibres), jeter la préparation, que la détermination des mécanismes de blessures primaires et secondaires seront confondus. En outre, des segments isolés de la moelle épinière peuvent être imagés jusqu&#39;à 24 heures après l&#39;Lisci avec seulement légère à modérée des lésions tissulaires Lisci indépendant. </li></ol>

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J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous décrivons un procédé d&#39;imagerie ex vivo de la moelle épinière axones myélinisés (c.-à faisceau gracile) associée à une lésion de la moelle épinière induite par laser pour étudier la progression dynamique de dégénérescence axonale myélinisées fois primaire et secondaire dans le temps. Imagerie ex vivo de la surface de la moelle épinière à bout de bien des complications associées à l&#39;imagerie in vivo tels que les artefacts de mouvement et le potentie...

La dégénérescence des axones est une cause importante de morbidité couvrant plusieurs conditions neurologiques, y compris la neurotraumatologie, accident vasculaire cérébral, auto-immune, et les maladies neurodégénératives. Contrairement au système nerveux périphérique (SNP), système nerveux central (SNC) axones ont une capacité limitée de se régénérer une fois blessés en raison de deux obstacles intrinsèques et extrinsèques (ce est à dire, des molécules inhibitrices de la croissance axonale produite pendant la formation de cicatrice et libéré lors de la dégénérescence de la myéline) 1 -7. Bien que plusieurs de ces obstacles ont été largement exploré, interventions thérapeutiques visant à prévenir CNS dégénérescence axonale, robuste promouvoir la régénération axonale, et restaurer connectively fonctionnelle, restent limités. Axones fois séparés de leur soma subissent un processus stéréotypée de la dégénérescence connue sous le nom wallérienne dégénérescence qui se caractérise par un gonflement axonal, la formation et la fragmentation éventuelle sphéroïde (revue dans 8). Encontraste, le moignon proximal qui reste dans la continuité avec le soma d&#39;un axone périphérique sectionné, forme une enflure à son extrémité, meurt sur le nœud le plus proche de Ranvier, et peut alors initier la formation du cône de croissance, une condition essentielle nécessaire à la régénération axonale ultérieure 9-11. En revanche, les terminaisons axonales proximales de nombreux axones centraux forment &quot;endbulbs&quot; caractéristiques ou des ampoules de rétraction, ne parviennent pas à former des cônes de croissance, et au lieu rétracter loin du site de la lésion où ils restent pendant des mois après une blessure 12-15. En plus de la blessure axonale primaire, plus axonale dommages / perte peut également se produire aux axones qui ont été largement épargnés par la blessure initiale. Cette perte axonale tardive des axones initialement épargnées est appelée dégénérescence axonale comme secondaire. Cette réponse inhérente des axones du SNC d&#39;une blessure rend la régénération axonale fonctionnelle un objectif encore plus difficile à réaliser dans le cerveau et la moelle épinière. Bien hallmarks de lésions axonales (par exemple, la formation sphéroïde, ampoules de rétraction) ont été bien caractérisés à partir de tissus post-mortem et des modèles expérimentaux de dégénérescence axonale, l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces processus dynamiques a été restreint. La plupart de ces études se est appuyé sur les observations finaux statiques qui intrinsèquement échoué à capturer réponses axonales individuels au fil du temps. Bien appliquées de manière exogène traceurs axonales ont été utiles pour élucider réponses axonales des sections statiques et pendant l&#39;imagerie en direct, la disponibilité de marqueurs axonales génétiquement codés a grandement amélioré notre capacité à visualiser axones en temps réel en utilisant la microscopie de fluorescence. En effet, un rapport séminal du Kerschensteiner et collègues ont d&#39;abord fourni une preuve directe de la dégénérescence axonale et la régénération in vivo utilisant des souris Thy1 GFP-S qui codent pour une protéine fluorescente verte dans les sous-ensembles de neurones qui envoient leurs projections dans les colonnes dorsales de la moellecordon 16. L&#39;imagerie en direct approches utilisant deux microscopie à balayage laser de photons (TPLSM) et génétique fluorescente marquage des protéines de cellules d&#39;intérêt continue de fournir une preuve directe et une approche mécanistique dans de nombreux processus dynamiques diverses telles que la dégénérescence axonale, Ca 2+ signalisation, la régénération axonale, astrocyte physiologie, la physiologie de la microglie, et la réponse à la blessure 17-25. Contrairement aux axones, on sait très peu de réponses de la myéline des blessures en temps réel. La myéline est une composante essentielle de la matière blanche produite et entretenue par les oligodendrocytes dans les cellules du système nerveux central et de Schwann dans le PNS. Myéline isole 99% de la surface des axones et, ce faisant fournit une haute résistance, faible capacité gaine protectrice qui soutient propagation de l&#39;influx saltatoire rapide et efficace, a récemment examiné par Buttermore et al., 26. Pour capturer la réponse dynamique de la myéline d&#39;une blessure, nous utilisons le solvatochrome, lipophilecolorant fluorescent du Nil 27 Rouge. Les propriétés de ce solvatochromes colorant vital permettent décalages spectraux de son spectre d&#39;émission qui dépend de l&#39;environnement physico-chimique 28,29. Ces propriétés sont utiles pour mieux comprendre les mécanismes de blessure axomyelinic et peuvent être visualisées en utilisant convenablement choisis dichroïques et filtres d&#39;émission ou résolus en utilisant la microscopie spectrale 27. Par exemple, le spectre d&#39;émission de rouge Nil est décalée vers le bleu dans des environnements moins polaires, riches en lipides tels que ceux trouvés dans les adipocytes et la myéline normale CNS (~ pic d&#39;émission de 580 à 590 nm) 27. En revanche, les pics du spectre d&#39;émission de ce colorant vital à ~ 625 nm dans endbulbs formées comme des axones 27 subissent un dépérissement axonale. Bien que les mécanismes précis qui sous-tendent ces décalages spectraux spécifiquement dans endbulbs contre la myéline normale restent floues, de telles modifications spectrales peuvent révéler des modifications sous-jacentes à l&#39;accumulation de protéines ou de désorganisation conduisant àexposition des sites de liaison hydrophobes 27. Alors que l&#39;imagerie in vivo est la métrique ultime pour observer la moelle épinière dynamique de lésions axonales dans leur environnement natif, il est techniquement difficile et nécessite une expertise chirurgicale importante, et répéter souvent chirurgies pour exposer la colonne dorsale qui peuvent introduire des artefacts expérimentaux (par exemple, l&#39;inflammation et la cicatrice formation). En outre, un équipement coûteux est souvent nécessaire pour permettre la suspension et le positionnement d&#39;un animal intact sous l&#39;objectif de microscope. Les animaux doivent être soigneusement surveillés aussi bien pour se assurer qu&#39;ils restent au chaud, pour assurer fluides sont reconstituées, et pour se assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de signes d&#39;hypoxie en raison de séances d&#39;imagerie anesthésiés prolongées. Ce dernier point est extrêmement important que les axones et la myéline exigent absolument un niveau adéquat d&#39;oxygène perfusion constante et de rester viable. Cependant, ce ne est souvent pas signalée ou contrôlée dans la plupart des études in vivo aujour. En outre, le mouvement artefacts dus à la fréquence cardiaque et de la respiration (isoflurane anesthésiés souris adulte: ~ 300-450 battements par minute (BPM) est optimale pour maintenir 97-98% de saturation en oxygène (normal taux ~ 632 BPM) et ~ 55-65 respirations par minute (taux normal est de ~ 163 respirations par minute), respectivement)) 30 rencontrés lors in vivo moelle imagerie de cordon marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l&#39;aide de haute résolution microscopie à fluorescence difficile que même les plus rapides balayages laser inévitablement soumis à ces mouvements artefacts. Les progrès de la ultrarapides scanners résonance combinés avec un vertébrale rigide fenêtre encadrée implantable peut permettre l&#39;imagerie de la moelle épinière de souris chez les animaux éveillés, mais les temps de numérisation plus rapide réduisent inévitablement le rapport signal sur bruit qualité d&#39;image dégradants. D&#39;autres améliorations dans les techniques d&#39;imagerie de la moelle épinière comme actuellement utilisés pour l&#39;imagerie cérébrale peuvent surmonter nombre de ces obstacles et de limiter les facteurs de confusion potentiels introduits par l&#39;INAdequate perfusion tissulaire, par exemple, de 31 à 33. Une grande partie de ce qui est connu à propos de White physiologie et mécanismes des lésions de la substance blanche question a été déterminée en utilisant in vitro ou ex vivo des préparations de la substance blanche du nerf optique, nerf périphérique, et des bandes de la moelle épinière substance blanche 34-41. Ces préparatifs se poursuivent pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de lésions de la substance blanche, car ils permettent des changements dans les facteurs environnementaux, de l&#39;application contrôlée de médicaments et des réactifs, des évaluations fonctionnelles en utilisant électrophysiologie, et des observations de microscopie par fluorescence directs des axones et la myéline dans les tissus vivants contrôlés. Pourtant, certaines approches précédentes pour observer les axones de la moelle épinière bandes de colonne dorsale ou ventrale bandes de la substance blanche blesser inévitablement axones de surface lors de l&#39;étape d&#39;élimination qui peuvent influencer la réponse des axones près opposés. Afin de capitaliser sur les manipulations expérimentales ci-dessus et éviter d&#39;endommager le vefibres ry objet d&#39;une enquête, nous utilisons un modèle ex vivo col de l&#39;utérus de la moelle épinière, car il empêche le contact direct de la face dorsale de la moelle. Ainsi, l&#39;architecture de la pie-mère et les axones des colonnes adjacentes dorsales superficielle reste viable et imperturbable pendant l&#39;isolement. Nous décrivons ici une approche relativement simple qui permet la visualisation directe des axones myélinisés centrales car ils répondent dynamiquement d&#39;une blessure focale en temps réel jusqu&#39;à 8 - 10+ h après une blessure. La blessure de la moelle épinière (Lisci) modèle induit par laser permet la différenciation entre les mécanismes de lésions axonales primaires et secondaires que la lésion primaire (site d&#39;ablation) reste spatialement limitées dans le temps. La chambre de l&#39;imagerie en plein bain est accessible à une intervention thérapeutique, la livraison de réactifs et manipulations de l&#39;environnement. Agents de protection axomyelinic putatifs peuvent être rapidement évaluées en temps réel par des observations directes contre des expériences longues et coûteuses impliquant processus de tissusING, le sectionnement, immunomarquage, capture d&#39;image, et l&#39;analyse et fournit donc un modèle de substitution utile pour évaluer les réponses aiguës et les manipulations de protection avant de tester les agents expérimentaux d&#39;animaux vivants.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Axones du SNC blessés ne parviennent pas à se régénérer et se rétracter souvent loin de l&#39;endroit de la blessure. Axones épargnés par la blessure initiale peuvent subir tard dégénérescence axonale secondaire. L&#39;absence de formation du cône de croissance, la régénération et la perte de projections axonales myélinisées supplémentaires au sein de la moelle épinière limite grandement la récupération neurologique après une lésion. Pour évaluer dans quelle centrale axones myélinisés de la moelle épinière répondent à des blessures, nous avons développé un ex vivo modèle vivant de la moelle épinière en utilisant des souris transgéniques qui expriment la protéine fluorescente jaune dans les axones et un foyer et des blessures de la moelle épinière induite par laser hautement reproductible pour documenter le sort des axones et la myéline (lipophile colorant fluorescent rouge Nil) au fil du temps en utilisant excitation à deux photons time-lapse microscopie. Processus dynamiques tels que lésion aiguë axonale, la rétraction des axones et la dégénérescence de la myéline sont les mieux étudiés en temps réel. Cependant, la nature non-focal de blessures, fondé contusion-et artefacts de mouvement a rencontréin vivo au cours de la moelle épinière de l&#39;imagerie marque différencier les réponses de lésions axonales primaires et secondaires à l&#39;aide de microscopie à haute résolution difficile. Le modèle ex vivo de la moelle épinière décrit ici imite plusieurs aspects de contusion / pathologies axonales cliniquement pertinentes induite compression y compris gonflement axonal, la formation sphéroïde, transection axonale, et péri-axonale gonflement fournir un modèle utile pour étudier ces processus dynamiques en temps réel. Les principaux avantages de ce modèle sont une excellente résolution spatio-temporelle qui permet la différenciation entre l&#39;insulte primaire qui blesse directement axones et des mécanismes de blessures secondaires; perfusion contrôlée de réactifs directement au bain de perfusion le cordon; modifications précises du milieu de l&#39;environnement (par exemple, le calcium, les ions sodium, contributeurs connus de lésions axonales, mais près impossible de manipuler in vivo); et des modèles murins offrent également un avantage car ils fournissent l&#39;occasion de visualiser etmanipuler les populations de cellules génétiquement identifiés et structures sous-cellulaires. Ici, nous décrivons comment isoler et de l&#39;image de la moelle épinière de souris vivant pour capturer la dynamique de lésions axonales aiguë.

Détails d&#39;un laboratoire approprié mis en place nécessaire d&#39;isoler, de maintenir la viabilité, et l&#39;image l&#39;ex vivo de la moelle épinière est montré à la figure 1. Le microscope doit être équipé d&#39;un laser accordable pulsé femtoseconde, dicroics appropriées et filtres d&#39;émission et une eau trempage objectif avec une ouverture numérique élevée (≥1.0). Pour assurer la viabilité de la moelle épinière lors de la dissection, la procédure doit être eff...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K vues.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Vidéo: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

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Neurosciences

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-étiquetage des neurones DRG pour l&#39;étude de branchement axonal dans une préparation Mont entiers de souris embryonnaires de la moelle épinière

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Un dosage Neurosphère pour évaluer l’Activation endogène cellules souches neurales dans un modèle murin de minime de la moelle épinière

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

La formation axée sur l’activité sur un tapis roulant avec la moelle épinière blessée des Rats Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induction d’une lésion complète de la moelle épinière de type transection chez la souris

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...