Le soutien financier a été fourni à JMS du NIH biomécanique dans le programme de formation T32 médecine régénérative (2T32EB003392), à QJ du Dowd-CIEM bourse et à la FAE de New Innovator Award du directeur des NIH (1DP2HL117750).

1. Fabrication de moule Master en utilisant la photolithographie <ol><li> Les nanofibres de protéines ECM, nanofabrics et nanostructures à être fabriqués sont d&#39;abord conçus à l&#39;aide Conception Assistée par Ordinateur (CAO). Ce fichier CAO est ensuite transféré à un photomasque. Le type de photomasque dépendra de la résolution des caractéristiques; avec un masque photographique basée sur la transparence adéquate pour fonction de tailles jusqu&#39;à ~ 10 um. Caractéristiques petits &lt;10 um, il faudra un chrome sur masque à verre. Toutes les nanofibres et nanostructures présentées ici ont été fabriqués en utilisant un masque photographique basée sur la transparence, et donc étaient à l&#39;échelle nanométrique d&#39;épaisseur, mais pas les dimensions latérales. Remarque: Il est important de distinguer les régions du photomasque seront sombres (empêcher la lumière UV de passer à travers) et qui sera transparent (permettre à la lumière UV de passer à travers) comme cela, avec le type de résine photosensible (positive ou négative) , déterminera la topographie finale du moule maître. </li><li> Pour commencer la fabrication du moule maître, déshydrater une plaquette 4 &quot;de silicium en le plaçant sur une plaque chauffante réglée sur 150 ° C pendant 15 min. </li><li> Centrez la plaquette sur le mandrin à vide d&#39;un spin-coater. Verser SU8-2015 résine photosensible négative sur le milieu de la plaquette et poursuivre la coulée en cercles concentriques jusqu&#39;à environ deux tiers de la plaquette est recouverte. Remarque: Conservez la bouteille de SU8 près de la plaquette lors de la coulée de minimiser la formation de bulles. </li><li> Programmer le spincoater comme suit: <ul><li> cycle de propagation: 500 tours par minute avec une accélération de 100 tr / s pendant 10 s. </li><li> le cycle d&#39;essorage: 4000 tours par minute avec une accélération de 100 tr / sec pendant 30 sec. </li></ul> Remarque: cette recette de spincoating formera une couche de résine photosensible qui est de ~ 10 um d&#39;épaisseur. En changeant la vitesse de filage ou de la formulation SU8, l&#39;épaisseur peut être ajustée. </li><li> Doux cuire la galette en le plaçant sur une plaque chauffante réglée sur 95 ° C pendant 3 min. </li><li> Exposer la plaquette avec une lumière UV à traversle photomasque pour une dose totale de 140 mJ / cm 2. Remarque: SU8 est une résine photosensible négative donc les régions où la lumière UV est capable de passer à travers le photomasque resteront après le développement et devenir des éléments en relief sur le moule de maître. </li><li> Post-exposition cuire la galette en le plaçant sur une plaque de cuisson réglé sur 95 ° C pendant 4 min. </li><li> Développer la plaquette en la plaçant dans un révélateur SU8 pendant 3 min. Après 3 min, rincer la plaquette avec de l&#39;alcool isopropylique. Si un film blanc est produit lors du rinçage, la plaque n&#39;est pas complètement développée et il doit être placé en arrière dans le révélateur pendant 30 sec. Rincer à nouveau avec de l&#39;alcool isopropylique. Répétez ce processus jusqu&#39;à ce que un film blanc ne fait pas lors du rinçage de l&#39;alcool isopropylique. </li><li> Sécher la plaque dans un courant d&#39;azote et les placer dans une boîte de Pétri de 150 mm à l&#39;abri de la poussière. </li></ol> 2. Faire les PDMS Timbres <ol><li> Préparer le prépolymère PDMS en combinant la base d&#39;élastomère et d&#39;agent de durcissement dans un10:1 w / w. Généralement on utilise 80 g de base et 8 g d&#39;agent de durcissement pour s&#39;assurer qu&#39;il est PDMS suffisants pour couvrir le moule maître dans une couche de 1 cm d&#39;épaisseur. </li><li> Mélanger et dégazer les PDMS en utilisant un mélangeur centripète défini comme suit: <ul><li> Mélanger: 2000 rpm pendant 2 min </li><li> Degas: 2000 rpm pendant 2 min. </li></ul></li><li> Si un mélangeur est indisponible mélanger les PDMS à la main pendant 10 min en utilisant une pipette sérologique de 10 ml. Dégazer le mélange en le plaçant dans un dessicateur sous vide pendant 30 min pour éliminer les bulles. </li><li> Verser suffisamment prépolymère PDMS sur le moule maître (pastille de silicium à motifs) pour former une couche de 1 cm d&#39;épaisseur. Guérir les PDMS par cuisson à 65 ° C pendant 4 heures ou à température ambiante pendant 48 heures. </li><li> Une fois durci, Les régions contenant les motifs peuvent être découpées pour former les timbres PDMS. Pour distinguer le côté caractéristique de l&#39;arrière du timbre de PDMS, une entaille sur l&#39;un des coins sur le dos du timbre. </li></ol> 3. Microcontact PrInting de modèles ECM <ol><li> Nettoyer les lamelles de verre de 25 mm de diamètre par ultrasons dans 95% d&#39;éthanol pendant 1 heure et puis sécher dans un four à 65 ° C. </li><li> Préparer la solution en dissolvant PIPAAm PIPAAm dans le 1-butanol à une concentration de 10% (en poids / volume, typiquement 1 g dans 10 ml). </li><li> Centrer une lamelle de verre sur le mandrin à vide et des spincoater pipette 200 ul de la solution PIPAAm sorte que la surface du verre est recouverte. </li><li> Spincoat la lamelle à 6000 rpm pendant 1 min. </li><li> Nettoyez les timbres PDMS par sonication dans 50% d&#39;éthanol pendant 30 min, puis sec sous un courant d&#39;azote. Remarque: Séchage et les étapes ultérieures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité pour les applications où les nanostructures ECM seront utilisés avec des cellules. </li><li> Manteau de la surface à motif de chaque timbre PDMS avec 200 pi de la solution de protéines, généralement de 50 pg / ml dans l&#39;eau distillée stérile pour FN. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Remarque: Th.est le revêtement de volume est un timbre PDMS 1,5 cm 2 et devra être ajustée en fonction de la taille du tampon de PDMS, la protéine d&#39;ECM utilisés et la concentration de la protéine en solution ECM. </li><li> Laver les timbres PDMS dans l&#39;eau distillée pour enlever l&#39;excès de protéines et de sécher sous un courant d&#39;azote. Remarque: l &#39;eau restant sur le timbre va déclencher la dissolution prématurée du revêtement PIPAAm sur la lamelle et empêcher le transfert correct de la protéine. </li><li> Pour la fabrication aseptique, placer les lamelles PIPAAm enrobés dans une boîte de Pétri fermée et stériliser en utilisant l&#39;exposition aux UV, 45 min sous la lumière UV dans une enceinte de sécurité biologique est suffisante. Si la stérilité n&#39;est pas nécessaire, cette étape peut être omise. </li><li> Effectuer l&#39;impression par microcontact en plaçant du côté de la caractéristique de la marque PDMS en contact avec la lamelle PIPAAm-enduit. Si nécessaire, utilisez une pince à taper légèrement sur le dos des timbres pour éliminer les bulles d&#39;air et assurer un contact uniforme. </li><li> Après 5 kmn, décoller le timbre de PDMS de la lamelle. </li><li> A ce stade, les protéines de la MEC supplémentaires peuvent être modelé pour créer des structures plus complexes et à multi-composants. Jusqu&#39;à 3 impressions ont été vérifiées à travailler avec ce processus, et plus peut-être possible. </li></ol> 4. Sortie de l&#39;ECM nanofibres et Nanostructures <ol><li> Placez le PIPAAm lamelle enduit modelé dans une boîte de Pétri de 35 mm et d&#39;inspecter la fidélité du motif en utilisant la microscopie à contraste de phase. Selon le modèle, une caméra CCD peut être nécessaire de régler les caractéristiques de la forme. La microscopie à fluorescence peut également être utilisé pour inspecter le motif à condition que les protéines de la MEC sont marqués par fluorescence. </li><li> Ajouter 3 ml d&#39;eau distillée à 40 ° C à la boîte de Pétri et laisser l&#39;eau refroidir progressivement. </li><li> La dissolution de la couche PIPAAm et la libération des motifs de protéines d&#39;ECM peuvent être surveillés en utilisant la microscopie à contraste de phase. Si l&#39;application ne permet pas l&#39;utilisation de tec optiquehniques, la libération peut être contrôlée en mesurant la température de la solution. Typiquement, l&#39;eau est refroidie à la température ambiante, bien en dessous de la LCST du PIPAAm (32 ° C), afin d&#39;assurer les nanostructures de protéines d&#39;ECM ont été libérés. </li><li> Après la libération, les nanofibres, nanofabrics et autres nanostructures flottent dans l&#39;eau. Pour les utiliser pour d&#39;autres applications dont ils ont besoin pour être manipulé. La méthode exacte dépendra de l&#39;objectif expérimental et peut comprendre des étapes telles que l&#39;immobilisation sur une autre surface, le déplacement d&#39;un système de micromanipulateur ou enrobage dans un hydrogel. </li></ol>

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

La méthode présentée ici SIA imite assemblage de la matrice à médiation cellulaire et permet l&#39;ingénierie des ECM nanofibres de protéines et de nanostructures avec la taille accordable, l&#39;organisation et la composition. Bien que n&#39;étant pas identique à ECM généré cellulaire, SIA crée ECM composée de fibrilles protéiques nanométriques 20 qui subissent pliage réversible / dépliage pendant contrainte mécanique 21 et peuvent se lier les cellules 20. Ceci permet...

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est composée de protéines multifonctionnelles impliquées dans la régulation physique et chimique des processus cellulaires multiples, y compris l&#39;adhérence, la prolifération, la différenciation, l&#39;apoptose et 3.1. L&#39;ECM est synthétisé, assemblé, et organisée par les cellules et les fibrilles protéiques constitutifs ont des compositions uniques, la taille des fibres, des géométries et des architectures interconnectés qui varient selon le type de tissu et le stade de développement. Des travaux récents ont montré que l&#39;ECM peut fournir des indices instructifs pour guider les cellules pour former des tissus modifiés 4, ce qui suggère que récapitulant l&#39;ECM en termes de composition et de la structure pourrait permettre le développement de matériaux biomimétiques pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie. Un certain nombre de méthodes de fabrication ont été développés pour concevoir des échafaudages polymères qui peuvent imiter les aspects de l&#39;ECM dans les tissus. Par exemple, électrofilature et la phase separation ont démontré à la fois la capacité de former des matrices poreuses de fibres avec des diamètres allant de quelques dizaines de micromètres à plusieurs dizaines de duvet 5-7 nanomètres. Les deux techniques ont également montré que des matrices très poreuses de nanofibres peuvent supporter l&#39;adhérence cellulaire et l&#39;infiltration dans l&#39;échafaud 8. Cependant, ces approches sont limitées dans les géométries possibles de fibres, les orientations et les architectures 3D qui peuvent être créés. Électrofilage produit typiquement échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire soit ou très alignés tandis que la séparation de phase produit échafaudages avec des fibres orientées de façon aléatoire. Il existe aussi des limitations concernant les matériaux, typiquement avec des chercheurs utilisant des polymères synthétiques, tels que le poly (ε-caprolactone) 8 et le poly (acide lactique-co-glycolique) 9, qui sont ensuite revêtu avec des protéines de la MEC pour favoriser l&#39;adhérence cellulaire. Biopolymères naturels sont également utilisés, y compris le collagène de type I 10, 11 de la gélatine, du fibrinogène 12,chitosane 13 et 14 soie, mais ne représentent qu&#39;une petite partie des protéines trouvées dans le tissu natif. La plupart des tissus contiennent un plus grand milieu de protéines et de polysaccharides y compris la MEC de la fibronectine (FN), la laminine (LN), le collagène de type IV et d&#39;acide hyaluronique qui sont difficiles ou impossibles à fabriquer des nanofibres en utilisant des procédés existants. Pour relever ce défi, nous avons concentré nos efforts de recherche sur imitant la façon dont les cellules synthétisent, former et organiser des fibrilles de protéines ECM dans leur environnement. Alors que le processus de fibrillogénèse spécifique varie pour différentes protéines de la MEC, typiquement un changement conformationnel dans la molécule de protéine d&#39;ECM est déclenchée par une interaction enzymatique ou médiée par les récepteurs, ce qui expose des sites cryptiques d&#39;auto-assemblage. Ici, nous utilisons FN comme un système modèle pour mieux comprendre le processus de fibrillogenèse. Brièvement, des homodimères FN se lient à des récepteurs d&#39;intégrine sur la surface cellulaire par l&#39;intermédiaire de la séquence d&#39;acides aminés RGD dans le 10 type IIJe le répète unité. Une fois lié, les intégrines s&#39;écartent par actomyosin contraction et se déroulent les dimères FN pour exposer les sites d&#39;auto-assemblage cryptiques. L&#39;exposition de ces sites de liaison FN-FN permet aux dimères FN à assembler en un fibrilles insolubles à droite sur la surface de la cellule 15. Travail dans les systèmes sans cellules a démontré que les sites de liaison FN-FN cryptiques peuvent être révélées par dépliage utilisant dénaturants 16 ou tension de surface à un-liquide-solide sur l&#39;interface radio 17-19. Cependant, les fibres FN créés par ces techniques sont limitées à des tailles et géométries de fibres spécifiques et sont généralement liés à une surface. Nous décrivons ici un appelé ensemble de la surface à l&#39;initiative approche (SIA) 20 qui surmonte ces limitations en utilisant des interactions protéine-surface pour créer de libre-debout nanofibres insolubles, nanofabrics (feuilles 2D) et d&#39;autres nanostructures composées de protéines de la MEC simples ou multiples (figure 1 ). Dans cette process, protéines de la MEC sont adsorbées à partir, une conformation globulaire compact en solution et partiellement dénaturé (déplié) sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) des motifs timbre. Les protéines de la MEC sont ensuite transférés dans cet état ​​sur ​​un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface par microcontact impression 22. Lorsqu&#39;il est hydraté avec 40 ° C de l&#39;eau au PIPAAm reste d&#39;un solide, mais lorsqu&#39;il est refroidi à 32 ° C, il passe par une température de solution critique inférieure (LCST) où elle devient hydrophile, gonflant à l&#39;eau puis se dissout, libérant les nanostructures ECM assemblés hors de la surface. La méthode SIA permet de contrôler les dimensions avec une précision nanométrique. En contrôlant les paramètres clés tels que la composition, la géométrie de la fibre, et de l&#39;architecture, il est possible de récapituler nombreuses propriétés de l&#39;ECM trouvés in vivo et de développer des échafaudages avancés pour des applications de génie tissulaire et de la biotechnologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

La matrice extracellulaire (ECM) dans les tissus est synthétisée et assemblée par les cellules pour former un fibrillaire 3D, réseau de protéines étroitement régulé avec le diamètre des fibres, de la composition et son organisation. En plus de fournir un support structurel, dont les propriétés physiques et chimiques de l&#39;ECM jouent un rôle important dans de multiples processus cellulaires, y compris l&#39;adhérence, la différenciation et l&#39;apoptose. In vivo, l&#39;ECM est assemblé en exposant cryptique d&#39;auto-assemblage (fibrillogenèse) des sites au sein de protéines . Ce processus varie pour des protéines différentes, mais la fibronectine (FN) fibrillogénèse est bien caractérisée et sert de système modèle pour l&#39;ensemble de l&#39;ECM à médiation cellulaire. Plus précisément, les cellules utilisent des récepteurs de l&#39;intégrine sur la membrane des cellules pour se lier dimères FN et les forces contractiles actomyosine généré à déplier et exposer les sites de liaison pour l&#39;assemblage sous forme de fibres insolubles. Ce processus médiée par le récepteur des cellules permet d&#39;assembler et d&#39;organiser l&#39;ECM à partir du cellulaire à sca tissulaireles. Ici, nous présentons une méthode appelée surface initiative assemblage (SIA), qui récapitule assemblage de la matrice à médiation cellulaire utilisant des interactions protéine-surface à déplier protéines de la MEC et les assembler en fibres insolubles. Tout d&#39;abord, les protéines de la MEC sont adsorbées sur un polydiméthylsiloxane hydrophobe (PDMS) de surface où ils dénaturent partiellement (dépliante) et exposent domaines de liaison cryptiques. Les protéines dépliées sont ensuite transférés dans bien définis micro-et nanomotifs grâce à l&#39;impression par microcontact sur un poly sensible à la chaleur (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Dissolution thermique déclenché de la PIPAAm conduit à l&#39;assemblage final et la libération de protéines insolubles nanofibres de ECM et nanostructures avec des géométries bien définies. Architectures complexes sont possibles en ingénierie défini motifs sur les PDMS cachets utilisés pour l&#39;impression par microcontact. En plus de FN, le processus SIA peut être utilisé avec la laminine, le fibrinogène et les collagènes de type I et IV de créer plusieurs composants ECM nanostructurestures. Ainsi, SIA peut être utilisé pour fabriquer des matériaux à base de protéines ECM avec un contrôle précis de la composition des protéines, la géométrie de la fibre et de l&#39;architecture de l&#39;échafaudage pour récapituler la structure et la composition de la MEC in vivo.

SIA est capable de ECM d&#39;ingénierie nanofibres de protéines avec un contrôle précis sur les dimensions des fibres. Pour le démontrer, des tableaux de nanofibres FN avec des dimensions planes de 50 x 20 um ont été modelés sur une lamelle enduit PIPAAm (figure 2A). Lors de la libération, les fibres contractées parce qu&#39;ils étaient sous une pré-stress inhérent quand modelé sur la surface PIPAAm (figure 2B). Analyse des nanofibres FN a révélé qu&#39;ils étaient pr?...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l&#39;architecture pour une utilisation dans une variété d&#39;applications d&#39;ingénierie tissulaire et de la biotechnologie.

Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l&#39;assemblage de la surface à l&#39;initiative Nanostructures Engineered

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K vues.  Carnegie Mellon University.  Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l'architecture pour une utilisation dans une variété d'applications d'ingénierie tissulaire et de la biotechnologie. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Recherche

Bio-ingénierie

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

L&#39;utilisation de nanostructures cristal plasmonique et photoniques pour la manipulation des micro-et nanoparticules améliorée

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Conçu vascularisé Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Mise à l&#39;échelle de l&#39;ingénierie vasculaire Greffes Utilisation 3D Printed Guides et Méthode d&#39;empilage Anneau

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Contrôles non destructifs suivi du développement de dégradable axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Greffe tissulaire pour la reconstruction oesophagielle circonférence chez les rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-assemblage d’acides nucléiques peptides gamma modifiés en nanostructures complexes dans des mélanges de solvants organiques

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

Assemblage rapide de constructions multigéniques à l’aide du clonage modulaire golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...