Ce nouveau protocole décrit l’utilisation de multiples séquences distinctes de l’acide nucléique synthétique imitent le gamma PNA pour former des nanostructures dans des mélanges spécifiques de solvants organiques. Les analyses décrites ici montrent la nécessité d’adapter les protocoles existants de nanotechnologie de l’acide nucléique aux solvants organiques où peu ou pas de protocoles ont été publiés. Les praticiens nouveaux à cette technique pourraient avoir du mal à adapter les protocoles existants développés pour les environnements riches en aqueux en environnements organiques riches en solvants en raison de la propension de l’ANP nanomatériau à s’agréger.
Commencez par préparer les stocks gamma de pna. Après avoir obtenu des brins de PNA gamma purifiés de qualité HPLC auprès d’un fabricant commercial, resuspendez chaque brin dans de l’eau déionisée à 300 concentrations de micromolaires. Conservez les PNA gamma à moins 20 degrés Celsius jusqu’à plusieurs mois.
Lorsqu’il est prêt à effectuer l’auto-assemblage, préparer des échantillons de lots anneaux dans 75%DMSO, 75%DMF, et 40%1, 4-dioxane. Tout d’abord, préparez 20 sous-stocks micromolaires de chaque oligomer en incitant 0,67 microlitres du stock principal et en ajoutant de l’eau déionisée pour un volume final de 10 microlitres. Ajoutez un microlitre de chaque oligomer des 20 sous-stocks micromolaires à un tube PCR de 200 microlitres, qui se chiffrera à un volume total de neuf microlitres pour neuf oligomers.
Ajouter 30 microlitres de DMSO anhydre ou de DMF avec un microlitre supplémentaire d’eau déionisée pour un volume final de 40 microlitres. Pour préparer le lot de 40%1, 4-dioxane, ajouter 16 microlitres de 1, 4-dioxane et porter le volume à 40 microlitres avec de l’eau déionisée. Anneal les échantillons pendant 22,5 heures dans un cycleeur thermique de refroidissement de 90 à 20 degrés Celsius.
En règle générale, les températures de fonte obtenues pour deux sous-ensembles oligomer et trois sous-ensembles gamma oligomer PNA se situent entre 40 et 70 degrés Celsius pour différentes conditions de solvant. Programmez le cycleur thermique selon les directives manuscrites. Une fois l’annealage terminé, les échantillons peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant 12 à 24 heures avant la caractérisation.
Faites une chambre d’humidité à partir d’une boîte vide de bouts de pipette en remplissant la boîte avec approximativement cinq millilitres d’eau. Préparez une dilution 20 fois de 2% collodion disponible dans le commerce en acétate d’amyle avec solvant d’acétate d’isoamyle pour créer la solution de nitrocellulose. Utilisez des pinces à épiler pour tremper un coverslip dans la solution de nitrocellulose et lui permettre de sécher à l’air libre, puis faire une chambre d’écoulement à partir d’une diapositive microscope, deux bandes de ruban à double face, et le coverslip enduit de nitrocellulose.
Préparez la solution BSA de biotine en pesant un milligramme de biotine BSA et en la dissolvant en un millilitre de PBS. Pipette 15 microlitres de la biotine BSA dans le canal d’écoulement à un angle et l’incuber pendant deux à quatre minutes à température ambiante dans la chambre humidifiée. Soufflez 15 microlitres du tampon de lavage, qui se compose d’un milligramme de BSA dans un millilitre de PBS, dans le canal pour laver l’excès de biotine BSA, puis passer la surface en incubant le canal d’écoulement pendant deux à quatre minutes dans la chambre humidifiée.
Mesurer 0,5 milligramme de streptavidine et un milligramme de BSA, puis dissoudre les deux dans un millilitre de PBS. Pipette 15 microlitres de la solution streptavidine dans le canal d’écoulement et le placer dans la chambre humidifiée pendant deux à quatre minutes et laver le canal en écoulant 15 microlitres de tampon de lavage. Ensuite, coulez 15 microlitres du lot annelé d’oligomers gamma PNA dans la chambre humidifiée, puis lavez les nanostructures non liées en écoulant 15 microlitres d’un millimolaire Trolox dans la même composition de solvant que les nanostructures.
Transférez le canal d’écoulement vers le support de diapositives et imagez-le avec un microscope à fluorescence équipé de l’imagerie TIRF, d’un objectif d’immersion d’huile de 60X et d’une loupe de 1,5 X. Scannez le canal d’écoulement à un grossissement de 60 ou 90X tout en surveillant le canal Cy3. Préparez des stocks de 20 et 6% de SDS selon les instructions manuscrites, puis anneal les oligomers gamma PNA en ajoutant un microlitre de chaque oligomer de 20 micromolaires à un tube PCR de 200 microlitres.
Ajoutez 30 microlitres de DMSO anhydre et un microlitre de 6%ou 20%SDS aux tubes PCR pour un volume final de 40 microlitres, ce qui se traduira par une concentration finale de SDS de 5,25 ou 17,5 millimolaires respectivement. Anneal les PNA gamma dans le thermocycleur comme précédemment décrit. Caractériser les nanostructures gamma PNA en présence de SDS à l’aide du protocole TIRF ou TEM.
La formation image de TIRF des oligomers gamma de PNA annealed dans 75%DMSO a montré des architectures bien organisées tandis que l’annealing dans 75%DMF a eu comme conséquence les nanostructures spicule-formées ou aiguille-comme. L’état de 40%1, 4-dioxane a produit une décoration clairsemée des nanostructures filamenteuses. En outre, les échantillons de nanotubes gamma PNA formés dans 75%DMSO ont démontré le regroupement des nanofibres à grossissement élevé ou des résolutions nanoscopiques pendant l’imagerie TEM.
L’analyse quantitative de la largeur des nanostructures a montré une largeur médiane de 16,3 nanomètres avec des valeurs maximales au-delà de 80 nanomètres. Les oligomers isosequential d’ADN qui ont remplacé les PNA gamma contigus ont formé les structures filamenteuses droites tandis que le remplacement des PNA gamma de croisement a comme conséquence des structures stellaires. Les nanostructures qui ont été remplacées par des oligomers d’ADN contigus avaient des largeurs médianes d’environ 19 nanomètres.
À des concentrations élevées de SDS, les nanofibres gamma PNA adoptent également des morphologies fortement en réseau par rapport à ses concentrations critiques de micelle lorsqu’on les regarde avec l’imagerie TIRF. L’imagerie TEM indique que l’assemblage gamma de PNA en SDS de 5,25 millimolaires a les réductions les plus substantielles du regroupement structurel. Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de se rappeler de maintenir les compositions de solvants mentionnées en raison de la propension des nanostructures à s’agréger.
Ces méthodes encouragent les praticiens à rechercher d’autres avenues inexplorées de différentes compositions de solvants, surfactants et autres nanostructures d’ADN PNA.
