Nous remercions Melissa Griffin et Jenna Rozacky pour leurs soins de poissons d&#39;experts. PDM grâce EGN pour aide à la rédaction, la générosité et la patience. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCR R01DE020884 à JKE.

Une. Elevage et Mutant allèles <ol><li> Élever du poisson zèbre comme décrit 21. </li><li> Allèles mutants de poisson zèbre utilisés dans cette étude étaient PDGFRA b1059 16, B1100 Smad5 22, et SMO b577 23. Sources de ces souches de poisson zèbre comprennent ZIRC. </li></ol> 2. Préparation des solutions et met en œuvre Remarque: Toutes les solutions et les outils peuvent être faites à l&#39;avance et stockés pour une utilisation future. <ol><li> Sensibiliser les médias de l&#39;embryon (EM) comme décrit précédemment 21. </li><li> Faire 4 g / L MS-222 (Tricaine). Dissoudre 4 g de phosphate disodique (Na 2 HPO 4) dans 450 ml d&#39;eau stérile. Ajouter 2 g de MS-222 à la solution. Ajuster le pH à l&#39;intérieur de 7,0 à 7,2. Ajouter de l&#39;eau stérile pour obtenir un volume total de 500 ml. </li><li> Facultatif: Faire 4 g / L d&#39;huile de clou de girofle. Peser 0,2 g de l&#39;huile de girofle pure dans un tube conique de 50 ml. Ajouter EM pour un volume total de 50 ml. Stocker à 4 ° C. </li><li> Faire 3% methylcellulose. Apportez 50 ml de EM + 0,1 M HEPES à ébullition. Retirer du feu. Incorporer 1,5 g méthylcellulose jusqu&#39;à ce que la solution est homogène. Stocker à 4 ° C. </li><li> Faire 0,2% d&#39;agarose. Ajouter 0,1 g d&#39;agarose à 50 ml EM. EM apporter à ébullition dans le four micro-ondes ou sur une plaque chauffante et de vérifier que l&#39;agarose soit dissous. Aliquote dans 500 volumes ul dans des microtubes et conserver à 4 ° C. Remarque: Les volumes peuvent être ajustés au besoin. </li><li> Assurez-pokers capillaires. Déposer une goutte de super glue intérieur d&#39;un tube capillaire 0,9 mm d&#39;identité. Insérez une longueur de 4-5 cm de 6 ligne de pêche monofilament de livres test à l&#39;intérieur du tube capillaire de telle sorte que d&#39;environ 3-4 mm de la ligne s&#39;étend au-delà de la fin du tube. </li><li> Faire deux lamelles pontés par spécimen. Super-colle 22 x 22-1 couvercle verre à chaque extrémité d&#39;un couvercle en verre 24 x 60-1 quitter le milieu libre. Faire simple (1 petit verre de couverture par la fin) pour les embryons de moins d&#39;un jour vieux, double (deux petits verres de couverture sur le dessus de l&#39;autre par la fin) pour les embryons de une à quatre days vieux, ou triples (3 petits verres de couverture sur le dessus de l&#39;autre par la fin) pour les embryons de cinq jours ou plus âgés. </li><li> Remplir une seringue de 10 ml avec de la graisse à vide élevé. Remarque: de la graisse à vide sert de matériau d&#39;étanchéité pour prévenir la déshydratation des échantillons sur de longues périodes de temps, et a une faible toxicité potentielle par rapport à des produits d&#39;étanchéité plus volatils. </li></ol> 3. Montage embryons de poisson zèbre pour la microscopie confocale (voir la figure 1) <ol><li> Préparer milieu anesthésique. Faire fondre une aliquote de 0,2% d&#39;agarose par micro-ondes dans toutes les 20 secondes jusqu&#39;à ce que complètement liquide. Mélanger 8 pi de MS-222 dans 192 ul de 0,2% d&#39;agarose ou de 5 pi de 4 g / L de l&#39;essence de girofle dans 195 ul de 0,2% d&#39;agarose. Maintenir dans un bloc de chauffage à 42 ° C. Remarque: Une longue exposition au MS-222 provoque des retards de développement plus fort que l&#39;huile de clou de girofle fait chez le poisson zèbre embryonnaire 24. </li><li> Si nécessaire: dechorionate manuellement embryons transgéniques non éclos à analyser juste avant l&#39;analyse. En utilisant des pinces, lentement tear le chorion ouvert jusqu&#39;à l&#39;embryon est libéré. </li><li> Anesthésier les embryons de poisson zèbre. Ajouter 1 ml d&#39;une 4 g / L stock de MS-222 24 ml de médias de l&#39;embryon. Sinon, ajouter 390 ul de 4 g / L d&#39;huile de clou de girofle pour 24 ml d&#39;eau du poisson 24. Remarque: les actes de l&#39;huile de girofle lentement pour effectuer cette étape au moins 15-20 minutes avant la microscopie time-lapse. </li><li> Placer un cordon de graisse à vide autour de l&#39;espace central d&#39;une lamelle couvre-ponté orientée vers le haut. Pousser lentement la graisse à vide hors de la seringue, ce qui rend, d&#39;un cordon lisse continue qui est adjacent à et à l&#39;intérieur des ponts et le bord de la lamelle. </li><li> Etaler un cercle de 4% de méthylcellulose dans le milieu de la lamelle couvre-objet en utilisant un applicateur à pont en bois. </li><li> Transférer l&#39;embryon à imager. Lorsque l&#39;embryon est anesthésié tirer vers le haut dans une pipette en verre. Maintenir la pipette à la verticale afin de permettre à l&#39;embryon de couler au fond du liquide dans la pipette. Déplacer la pipette dans la solution d&#39;agarose et permettre à l&#39;embryon de tomberdans l&#39;agarose. Ne pas expulser le liquide. </li><li> Placer l&#39;échantillon. Dessiner une partie de la solution d&#39;agarose et l&#39;embryon dans la pipette. Expulser l&#39;embryon dans une goutte de solution d&#39;agarose sur le dessus de la méthylcellulose. Utilisez un tisonnier capillaire pour pousser l&#39;embryon à la baisse sur la méthylcellulose et orienter l&#39;embryon comme on le souhaite pour l&#39;imagerie. </li><li> Sceller l&#39;échantillon. <ol><li> Placez une lamelle pont au-dessus d&#39;une montée, vers le bas. Appliquer une pression uniforme sur les deux côtés des lamelles en sandwich jusqu&#39;à ce que les ponts sont en contact direct et les joints d&#39;abandon agarose à deux lamelles. Vérifiez que l&#39;embryon est correctement orienté. </li><li> Frottez un applicateur en bois le long de la vitre pour lisser les fissures et les lacunes dans le bourrelet de graisse à vide. Essuyez l&#39;excès de graisse à partir des bords. </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse imagerie confocale de poisson zèbre transgénique embryons (Ce protocole a été optimisé pour un Zeiss LSM 710 microscope confocal nousment logiciel d&#39;imagerie ZEN, et peuvent être modifiés pour être utilisés avec d&#39;autres systèmes.) <ol><li> Activer équipement. Allumez le microscope confocal et des dispositifs laser externes. Allumer l&#39;ordinateur connecté au microscope confocal. Logiciel d&#39;imagerie confocale Open et sélectionnez &quot;Système Start&quot; pour activer les commandes d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Préparer stade chauffé. Abaissez la plate-forme de mise en scène du microscope confocal et déplacer les lentilles de l&#39;objectif hors de position. Remplacer la scène par défaut avec une scène électronique chauffée. Allumez le contrôleur de la platine chauffante et régler la température de 29,5 ° C. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans le champ de vision. Placer l&#39;échantillon montés sur la scène. Déplacez la lentille de l&#39;objectif 20X en position et soulever la plate-forme de mise en scène. Activer l&#39;émetteur de lumière visible et de regarder à travers les oculaires. Centrer la tête de l&#39;embryon dans le champ de vision. </li><li> Définir les paramètres du test. <ol><li> Activer les canaux de fluorescence en sélectionnantla longueur d&#39;onde de fluorescence à détecter et choisissez tables des couleurs (LUT) pour chaque canal. Si nécessaire, utiliser les commandes manuelles dans le logiciel pour activer les lasers nécessaires (par exemple 561 nm pour DP). Pour chaque canal de fluorescence, réglez l&#39;intensité du laser à 10,0 et la tension photomultiplicateur (HV ou le gain) entre 600-700. Réglez le calcul de la moyenne de quatre et la profondeur de bits à 16 bits. </li><li> Activer les modules de la série Z-stack et time. Réglez le trou pour un Z-résolution 5 pm ou moins, et définir le Z-intervalle à la distance optimale suggéré. Remarque: En général, 5 um Z-résolution permet chaque image Z-stack à collecter assez rapidement pour un «instantané» de l&#39;embryon à un point de temps particulier, tout en la résolution des cellules individuelles. L&#39;abaissement de la moyenne réduit également la quantité de temps par image. </li><li> Définir l&#39;intervalle de temps désiré entre les images (généralement 10 à 20 mn) et la durée totale de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Définir positioninformation. <ol><li> Mettez l&#39;appareil photo en mode direct. Réglez la mise et augmenter l&#39;intensité laser si nécessaire pour voir fluorescence. Réglez le zoom numérique à 0,6 pour une vue plus large, si désiré. </li><li> Placez la scène de telle sorte que toutes les structures d&#39;intérêt sont visibles et il ya de la place dans le champ de vision pour le dos prolongement et en avant. Concentrer l&#39;embryon à travers les limites supérieure et inférieure de la fluorescence. Définissez les première et dernière positions Z-stack tranche d&#39;au moins 100 um ou plus au-delà de ces limites. </li></ol></li><li> Optimiser l&#39;intensité de la fluorescence. <ol><li> Réglez le LUT d&#39;affichage à aller indicateur. Structures fluorescentes doivent maintenant apparaissent en blanc, et le reste du champ de vision doivent être bleues (pas de détection) ou noir. </li><li> Augmenter HT / le gain à un niveau juste en dessous saturé (rouge) pixels apparaissent. Si nécessaire, régler le décalage si une majorité de l&#39;arrière-plan n&#39;est pas détecté (bleu). Remarque: diamètre du trou microscopique petit et augmentation de l&#39;intensité du laser à la fois d&#39;améliorer l&#39;image defnition, mais intensité du laser doit être faible pour préserver les tissus vivants. Augmentation HT / gain et diamètre du trou microscopique (&lt;5 um) sont généralement préférable d&#39;augmentation de l&#39;intensité du laser. </li><li> Gardez le diamètre de trou d&#39;épingle assez large pour recueillir des images en temps opportun, la moyenne des jeux à 4. Le Z-intervalle doit toujours être réglé à la distance optimale suggérée pour le diamètre de trou d&#39;épingle. Effectuer des analyses de courte durée (moyenne = 1) avec des paramètres différents, et d&#39;utiliser l&#39;intensité du laser minimum qui permet d&#39;atteindre la résolution désirée. </li></ol></li><li> Exécutez l&#39;expérience pour la durée souhaitée. Ensuite, retirez embryon du stade chauffée et séparer lentement les lamelles. Immerger la lamelle et l&#39;embryon dans EM dans une boîte de Pétri de 30 mm. En utilisant une pipette en verre laver doucement l&#39;embryon hors de la lamelle et enlever la lamelle de la boîte de Pétri. Placez l&#39;embryon dans un incubateur à 28,5 ° C pour continuer à se développer. </li><li> Comparer la croissance. A la fin de l&#39;expérience, prendre individu Zsimages de selleries d&#39;embryons de frères agarose monté qui ont été mis en scène de manière similaire à l&#39;échantillon au début de l&#39;expérience, mais ont été soulevées dans EM dans un incubateur à 28,5 ° C. </li><li> Mesurer arcs pharyngiens, au besoin. Les mesures peuvent être effectuées dans certaines suites logicielles confocale. Mesures trouvés ici ont été réalisées à l&#39;aide Fiji25 par l&#39;importation et Z saillie fichiers. LSM de cadres individuels. </li></ol>

<ol>
	<li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution.">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li><li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly.">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li><li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia.">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li><li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm.">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li><li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes.">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li><li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function.">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3 (1996).</li><li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs.">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li><li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton.">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li><li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors.">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li><li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+signalling+in+craniofacial+development.">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li><li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton.">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li><li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton.">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li><li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis.">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites.">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li><li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells.">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li><li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells.">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li><li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+A+(pdgf-a)+expression+during+zebrafish+embryonic+development.">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches.">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533 (2013).</li><li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation.">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li><li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning.">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube.">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Time-lapse microscopie confocale est un outil puissant pour l&#39;analyse du développement. Ici, nous démontrons l&#39;utilité de la méthode dans l&#39;étude de la morphogenèse arc branchial chez le poisson zèbre qui sont mutantes pour voies de signalisation importantes en utilisant un transgéniques qui marque les cellules de la crête neurale. En plus du niveau des tissus analyses, des analyses de déchéance de temps sont également applicables à des analyses à l&#39;échelle cellulaire 28. De nom...

Morphogenèse craniofaciale est un processus multi-étapes complexe qui nécessite des interactions coordonnées entre plusieurs types de cellules. La majorité du squelette cranio-facial est dérivé de cellules de la crête neurale, dont beaucoup doivent migrer du tube neural dorsal dans des structures appelées transitoires arcs branchiaux 1. Comme avec de nombreux tissus, la morphogenèse du squelette cranio-facial est plus complexe que ce qui peut être compris par des images statiques d&#39;embryons à des points spécifiques de temps de développement. Bien que cela prend beaucoup de temps pour réaliser, in vivo microscopie time-lapse donnent un aspect continu à des cellules et des tissus d&#39;un embryon en développement. Chaque image dans une série time-lapse prête contexte aux autres, et permet un mouvement d&#39;enquêteur vers déduire pourquoi un phénomène se produit plutôt que de déduire ce qui se passe à ce moment-là. L&#39;imagerie in vivo est donc un outil descriptif puissant pour des approches expérimentales dedéconstruire les voies qui guident la morphogenèse. Le Danio rerio est un modèle génétique populaire du développement embryonnaire des vertébrés, et est particulièrement bien adapté pour l&#39;imagerie in vivo de la morphogenèse. Moderne, des méthodes pratiques pour la transgenèse et la modification génomique sont progressent rapidement le nombre d&#39;outils disponibles pour les chercheurs de poisson zèbre. Ces outils améliorent les méthodes déjà robustes pour la manipulation génétique et la microscopie. L&#39;imagerie in vivo de presque n&#39;importe quel tissu dans presque n&#39;importe quel contexte génétique désiré est plus proche de la réalité que l&#39;imagination. Mouvements morphogénétiques des arcs branchiaux sont guidés par les interactions entre la crête neurale et l&#39;épithélium adjacent, à la fois l&#39;ectoderme et l&#39;endoderme de signalisation. Il existe de nombreuses molécules de signalisation exprimés par l&#39;épithélium qui sont nécessaires pour conduire la morphogenèse des éléments du squelette cranio-faciales. Parmi ces molécules de signalisation, Sonic Hedgehog (Shh) est d&#39;une importance cruciale fou développement cranio-facial 2-8. Shh est exprimé à la fois par l&#39;ectoderme bouche et du pharynx endoderme 2,6,9,10. L&#39;expression de Shh dans l&#39;endoderme régule les mouvements morphogénétiques des arceaux 10, la structuration de la crête neurale dans les arches 10, et la croissance du squelette cranio-facial 11. Signalisation BMP est également d&#39;une importance cruciale pour le développement cranio-facial 12 et peut modifier la morphogenèse des arcs branchiaux. Signalisation de la Bmp régule dorsale / ventrale structuration de crête dans les arcs branchiaux 13,14. Perturbation des Smad5 chez le poisson zèbre provoque des malformations graves palatines et un échec des cartilages de Meckel à fusionner de manière appropriée à la ligne médiane 15. En outre, les mutants présentent également des réductions et de la fusion des éléments du cartilage ventrale, avec le 2 ème, 3 ème et 4 ème éléments parfois pharyngée arc soudés à la ligne médiane 15. Ces fusions suggèrent fortement que la signalisation BMP dirige la morphogenèse de ces éléments du pharynx. Signalisation PDGF est nécessaire pour le développement cranio-facial, mais a des rôles inconnus en arc branchial morphogenèse. La souris et le poisson zèbre ont mutants PDGFRA profonde clefting midfacial 16-18. Au moins chez le poisson zèbre ce clefting midfacial est due à un échec de la migration des cellules de la crête neurale bon 16. Cellules de la crête neurale continuent d&#39;exprimer PDGFRA après qu&#39;ils ont pénétré dans les arcs branchiaux. En outre, les ligands de PDGF sont exprimés par l&#39;épithélium du visage et dans les arcs branchiaux 16,19,20, ainsi signalisation Pdgf pourraient également jouer un rôle dans la morphogenèse des arcs pharyngiens après la migration. Toutefois, les analyses de la morphogenèse des arcs pharyngiens dans des mutants de PDGFRA n&#39;ont pas été effectuées. Ici, nous démontrons dans la microscopie confocale in vivo de pharyngulune étape de poisson zèbre transgénique et décrire la morphogenèse des arcs pharyngiens dans ce délai. Nous démontrons en outre les comportements de tissus qui sont touchés par des mutations qui perturbent le BMP, le PDGF, et les voies de signalisation de Shh.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

Imagerie time-lapse est une technique qui permet l&#39;observation directe du processus de morphogenèse, ou la génération de forme. En raison de leur clarté optique et la susceptibilité à la manipulation génétique, la embryon de poisson zèbre est devenu un organisme modèle populaire avec laquelle effectuer l&#39;analyse time-lapse de la morphogenèse des embryons vivants. L&#39;imagerie confocale d&#39;un embryon de poisson zèbre direct requiert qu&#39;un tissu d&#39;intérêt est constamment marqué avec un marqueur fluorescent, comme un transgène ou d&#39;un colorant injecté. Le processus exige que l&#39;embryon est anesthésié et maintenu en place de manière à ce que le développement sain se déroule normalement. Paramètres pour l&#39;imagerie doivent être définis pour tenir compte de la croissance en trois dimensions et à concilier les exigences de la résolution des cellules individuelles tout en obtenant des clichés de développement. Nos résultats démontrent la possibilité d&#39;effectuer à long terme dans l&#39;imagerie in vivo d&#39;embryons de poisson zèbre de marquées par fluorescence et de détecter des comportements de tissus variés dansla crête neurale crânienne qui causent des anomalies cranio-faciales. Les retards de développement causés par l&#39;anesthésie et le montage sont minimes, et les embryons sont sains et saufs par le processus. Embryons Time-lapse imagées peuvent être retournés pour un milieu liquide et ensuite imagés ou fixés à des points plus tard dans le développement. Avec une abondance croissante des lignes de poisson zèbre transgénique et cartographie sort bien caractérisé et techniques de transplantation, imagerie n&#39;importe quel tissu désiré est possible. En tant que tel, time-lapse imagerie in vivo combine puissamment avec des méthodes génétiques de poisson zèbre, y compris les analyses des embryons mutants et micro-injection.

Chez les embryons de type sauvage, à la suite de neurones population de crête, les arcs pharyngiens allongés le long des antérieure / postérieure et dorsale / ventrale axes tout en se déplaçant dans une direction rostrale (Film 1). 30 heures après la fécondation (HPF), la longueur antérieure / postérieure du premier arc pharyngien est comprise entre 1.8 à 1.9 fois sa dorsale / ventrale hauteur. Dorsale / ventrale allongement procède régulièrement, plus rapide que l&#39;extension antérieu...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy at JoVE.com

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K vues.  The University of Texas at Austin.  Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants. 

Vidéo: Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation de Mesenchyme craniofaciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l&#39;aide Time-lapse de microscopie confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Mesure simultanée du pH dans endocytose et cytosoliques compartiments dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

Microscopie 4D de levure

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...