Ce protocole confocal microscopique permettra l’interprétation du comportement écologique et des adaptations des microalgues issues d’environnements extrêmes à croissance lente en laboratoire en utilisant l’autofluorescence de leurs pigments. Cette technique n’est pas invasive et minimise les artefacts car les composés chimiques ne sont pas utilisés. Connaître la performance des pigments des autotrophes et la croissance correspondante permettra de concevoir les méthodes de contrôle qui sont le plus grand intérêt pour les grottes touristiques et les monuments architecturaux.
Commencez à préparer l’inoculum de Chroothece mobilis en le transférant de la culture gélose au milieu eau de mer ou au milieu liquide SWES. Maintenir toutes les cultures pendant deux semaines avec une période de photo de 16 à 8 lumières sombres à 20 degrés Celsius sous une faible intensité de lumière blanche et sans agitation jusqu’à ce que la densité cellulaire désirée soit obtenue. Utilisez un millilitre de culture en phase exponentielle ayant cinq fois 10 à la densité cellulaire de cellules tiers par millilitre pour inoculer dans une plaque de 24 puits pour différentes expériences.
Pour reproduire l’effet de lumière monochromatique, utilisez le filtre vert permettant à la lumière verte de passer de 470 à 570 nanomètres avec un pic à la longueur d’onde de 506 nanomètres et à la lumière rouge ajustée à l’aide d’un filtre entre 590 et 720 nanomètres et des pics à 678 nanomètres. Exposez les cultures cellulaires à cette lumière pendant deux semaines. Allumez tous les composants du microscope confocale inversé à balayage laser, y compris le laser.
Montez les cellules dans le milieu de croissance SWES de chaque puits expérimental de la plaque de 24 puits sur une antenne de fond en verre de 35 millimètres pour l’imagerie. Choisissez l’objectif d’immersion de glycérol 63X ou 1,30 ou NA et placez le glycérol sur l’objectif. Ensuite, placez la plaque de puits sur la platine du microscope en veillant à ce que l’échantillon ne bouge pas pendant l’acquisition de l’image.
Centrez l’échantillon dans le trajet lumineux et concentrez-vous sur le centre de la cellule en sélectionnant le plan avec l’intensité de fluorescence la plus élevée. Une fois cela fait, ouvrez le logiciel d’acquisition d’images et choisissez XY lambda dans la liste déroulante en mode acquisition. Sélectionnez la ligne d’excitation du laser 561 nanomètres, huit bits de plage dynamique et 1024 par 1024 pixels.
Collectez les spectres d’émission de fluorescence dans la bande passante de 10 nanomètres et la taille de pas lambda de quatre nanomètres dans la plage de 570 à 760 nanomètres. Réglez le trou d’épingle sur une unité d’air et exécutez l’acquisition du scan lambda. Après avoir répété ce processus dans différents champs de vision et dans les différentes conditions des lumières rouges et vertes, enregistrez toutes les données.
Une fois le lambda scan acquis, cliquez sur la fenêtre de quantification en haut du logiciel pour évaluer les spectres d’émission de fluorescence collectés. Accédez à la fenêtre d’ouverture du projet et sélectionnez un fichier lambda XY. Sélectionnez l’analyse de profil empilé dans le logiciel d’imagerie et définissez une région d’intérêt de quatre micromètres carrés au centre d’une cellule pour analyser l’intensité moyenne de fluorescence.
Exportez les données et le fichier CSV avant de répéter le processus avec différentes cellules dans différentes conditions. Ensuite, ouvrez les fichiers CSV pour sélectionner les différents pics d’émission de fluorescence de toutes les régions d’intérêt mesurées en sélectionnant les données de fluorescence maximale de phycoérythrine phycocyanobiline, C. phycocyanine, allophycocyanine et chlorophylle A respectivement dans le fichier CSV. Une fois cela fait, créez un nouveau tableau avec toutes les valeurs de fluorescence maximales obtenues à partir de chaque pic de phycobiliprotéine et de chlorophylle et tracez les données sur un graphique.
Des différences significatives dans l’intensité moyenne de fluorescence ont été observées. L’intensité moyenne de fluorescence de la phycoérythrine phycocyanobiline a significativement diminué lorsque les cellules ont été exposées à la lumière verte monochromatique. En revanche, aucune différence n’a été observée en lumière rouge par rapport au témoin.
La lumière verte a eu l’effet inverse sur l’allophycocyanine et la chlorophylle A dans laquelle l’intensité moyenne de fluorescence a considérablement augmenté en raison de l’adaptation des complexes d’antennes en raison de l’augmentation de la quantité ou de l’amélioration de la connectivité des complexes d’antennes entre autres. La lumière rouge a produit une augmentation non significative de la fluorescence de l’allophycocyanine et de la chlorophylle. Pour étudier l’effet de différentes conditions de croissance sur les cellules en culture, il est crucial d’effectuer les mesures avec exactement les mêmes réglages de microscope.
Il est possible d’analyser d’autres paramètres environnementaux pertinents pour la culture d’organismes d’autofluorescence, ainsi que le signal de fluorescence dans le spectre visible. Cette technique est une approche très puissante pour étudier les organismes vivants avec plusieurs pigments d’autofluorescence.
