Nous remercions E. et J. Massicotte Seigneur pour l&#39;assistance technique d&#39;experts lors de la cytométrie de flux et les expériences de triage des cellules. Aussi, nous tenons à remercier le personnel de la clinique de l&#39;IRCM et tous les donateurs pour fournir des échantillons de sang. Échantillons de sang périphérique ont été obtenus à partir de donneurs adultes en bonne santé qui ont donné leur consentement écrit conformément à la Déclaration d&#39;Helsinki le cadre de protocoles de recherche approuvés par l&#39;éthique de la recherche Conseil de l&#39;Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM). Les réactifs suivants ont été obtenus grâce au Programme Réactif NIH sida, Division du sida, NIAID, NIH: cellules MT4 du Dr Douglas Richman; et rIL-2 humaine du Dr Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Dr Cohen est le récipiendaire de la Chaire de recherche du Canada en rétrovirologie humaine. Ce travail a été financé par des subventions de l&#39;IRSC (111226) au Dr Cohen et du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) réseau SIDA Dr Bego et le Dr Cohen.

Notes générales Il est important de garder les cellules en culture sans antibiotique, puisque les infections bactériennes, même contrôlées peuvent être détectées par les CMSP. Cette détection de composants bactériens va induire une production d&#39;interféron de fond qui ne peut être distinguée de celle déclenchée par spécifique du VIH-1 sensible. En outre, toutes les cellules doivent être testés en routine pour l&#39;absence de contamination par des mycoplasmes. Utilisez toujours des solutions sans endotoxine chaque fois que possible. Cytométrie en flux caractérisation des différentes cellules pour être utilisé dans les co-cultures (CMSP, pDC, MT4 et des cellules T CD4 +) est une étape facultative, mais fortement recommandée car elle peut fournir de précieuses informations nécessaires pour une interprétation correcte d&#39;une expérience donnée. 1. Préparation des cellules cibles infectées <ol><li> Maintenir la lignée cellulaire T CD4 + humains MT4 dans RPMI 1640 mediun supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), visé à partir de maintenant que milieu RPMI-1640 complet. </li><li> Isolement de cellules T CD4 + primaires. <ol><li> Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique humain par gradient de densité centrifugation. </li><li> Isoler lymphocytes T CD4 + en utilisant un kit de sélection négative des cellules T CD4 +, suivant les recommandations du fabricant. </li><li> Activer les lymphocytes avec PHA-L (5 ug / ml) T CD4 + pendant 48 heures, puis de maintenir les cellules dans du milieu RPMI-1640 complet additionné de IL-2 recombinante (100 U / ml). Infecter les cellules T 5 jours après l&#39;isolement primaire. </li></ol></li><li> L&#39;infection des cellules cibles (lignée cellulaire MT4 T ou des cellules hétérologues primaires CD4 + T). <ol><li> Deux jours avant de co-culture, infecter les cellules T avec virus VIH-1. Dans l&#39;exemple spécifique décrit ici pNL4.3-GFP_ires_Nef type sauvage (WT) ou virus pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) ont été utilisés. Ces souches virales représentent green protéine fluorescente (GFP) marqué de clones moléculaires infectieux isogéniques qui diffèrent seulement par leur capacité à exprimer Vpu. </li><li> Utilisez différentes multiplicités d&#39;infection (MOI) et sélectionnez les cultures ayant des niveaux d&#39;infection pour les co-cultures. Le jour de la co-culture, à déterminer le pourcentage de cellules GFP + par cytométrie en flux en tant que marqueur de l&#39;infection. Utilisez uniquement des cultures avec une gamme de 20-50% de cellules infectées pour co-cultures. </li></ol></li></ol> Étapes Facultatif: Procédez flux coloration par cytométrie à ce stade d&#39;évaluer l&#39;expression de surface des molécules / ligands d&#39;intérêt tels que BST2, et CD4. Pour la coloration de surface cellulaire, remettre en suspension 0,5 x 10 6 cellules T dans 100 ul de solution de lavage, ajouter 1 pl d&#39;anti-CD4_PerCP / Cy5.5 et 1 ul d&#39;anti-BST2_A660. Incuber les tubes pendant 45 min à 4 ° C, avant de le laver avec de cytométrie de flux de solution de lavage. Si les études visent à évaluer le rôle de Vpu médiation antagonisme BST2, effectuer un VIH-1 particulesdosage de libération à ce moment, comme décrit précédemment 15. 2. Isolement et l&#39;enrichissement des cellules de détection (CMSP entiers ou enrichis pDC) Remarque: Lorsque CMSP sont utilisés pour la détection, commencer isolement au sein demi-heure après la collecte de sang et de mener en temps opportun. Utilisez CMSP immédiatement pour co-cultures ou l&#39;enrichissement de pDC. <ol><li> Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique humain par gradient de densité centrifugation. Etape facultative: Effectuez multi-paramétrique coloration de la cytométrie de flux pour confirmer que les PBMC fraîchement isolés contiennent les différentes lignées cellulaires à des taux physiologiques. Pour la coloration de surface cellulaire, la remise en suspension de 10 6 cellules PBMC dans 100 ul de solution de blocage Fc, et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Après le blocage, ajouter 1 pl de l&#39;anti-CD3_Pacific Bleu (pour les cellules T), 1 pl de l&#39;anti-CD14-PE_Texas rouge (pour les cellules myéloïdes), 4 ul d&#39;anti-BDCA2_APC et 1 pi d&#39;anti-ILT7_PE (pour pDC). Incubertubes pendant 45 min à 4 ° C, avant de les laver avec de cytométrie en flux solution de lavage. </li><li> Enrichissez pDCs en utilisant un kit de sélection négative pDC, suivant les recommandations du fabricant. Il est recommandé de travailler vite, garder les cellules du froid, et utiliser des solutions pré-refroidi. Cela permettra d&#39;éviter le bouchage des anticorps sur la surface cellulaire et marquage des cellules non spécifiques tout en assurant l&#39;activité maximale de pDC. <ol><li> Effectuer multi-paramétrique analyse de cytométrie de flux des pDC fraîchement isolés pour confirmer la pureté, le pourcentage d&#39;enrichissement, et les quantités relatives de pDC- marqueurs de surface spécifiques (comme ILT7 et BDCA2). Pour la coloration de surface cellulaire, les pDC 4 10 remettre en suspension dans 100 ul de solution de blocage Fc, et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Après le blocage, ajouter 1 pl de l&#39;anti-CD3_Pacific Bleu, 1 pl de l&#39;anti-CD14_PE_Texas Rouge, 4 ul d&#39;anti-BDCA2_APC et 1 pi d&#39;anti-ILT7_PE. Incuber les tubes pendant 45 minutes à 4 ° C, avant de le laver avec de cytométrie de flux de solution de lavage (PBS, 5mM d&#39;EDTA, 5% de FBS). Un minimum de 40% de pureté PDC est recommandé (si le matériau de départ a 0,4% pDC, ce serait l&#39;équivalent d&#39;un enrichissement de 100 fois). </li></ol></li></ol> 3. Co-culture de cellules infectées CD4 + T et les cellules de détection (CMSP entiers ou enrichis pDC) <ol><li> Mélanger 220 pi de CMSP (dilué à 850.000 cellules / ml) ou 220 pi de pDC (à une concentration allant de 100.000 à 500.000 cellules / ml) avec 30 pi de cellules infectées T (dilué à 10 6 cellules / ml) par puits dans une plaque de fond en U 96. <ol><li> Comme témoins, CMSP de plaque ou PDC et les cellules T seules. Ajuster le volume dans le puits 250 pi avec du milieu RPMI 1640 complet. </li><li> Évaluez les réponses cellulaires aux agoniste connu des voies TLR7 et TLR9. À cette fin, la plaque 220 pl de CMSP (dilué à 850.000 cellules / ml) ou 200 pi de pDC (à une concentration allant de 100.000 à 500.000 cellules / ml) par puits dans un fond en U plaque de 96 puits et ajouter TLR7 agoniste ( Imiquimod, concentration finale: 2,5 ug / ml) ou agoniste TLR9 (ODN CpG-A 2216, concentration finale: 5 uM). Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 18 à 22 h et de les traiter d&#39;une manière similaire aux co-cultures décrites ci-dessous. </li></ol></li><li> Incuber co-cultures à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 18-22 h, puis de les transférer à une plaque de 96 puits de V-bas. Centrifuger pendant 5 minutes à 400 x g. <ol><li> Transfert surnageants à une plaque bien-fond plat 96. Les surnageants peuvent être stockés à -80 ° C ou utilisés pour la détection d&#39;IFN de type I immédiatement. </li><li> Remettre en suspension les cellules co-cultivées dans du paraformaldehyde à 2% et de les analyser en utilisant la cytométrie en flux. En raison des différences de taille et de granulation, des cellules MT4 sont facilement distingués des CMSP ou pDCs en fonction de leur dispersion latérale (SS) par rapport à l&#39;avant-scatter (FS) profils. Si les cellules T primaires sont utilisées comme cellules cibles infectées, elles peuvent être colorées avec du colorant de traçage quelconque de cellules, par exemple CSFE, de co-culture préalable. </li></ol></li><li> Mesure de bioactif de type I IFN en utilisant des cellules ß rapporteurs HEK-Bleu IFN-a /. Note: Ces cellules ont été produites par transfection stable de cellules HEK293 avec les gènes humains IRF9 STAT2 et d&#39;obtenir un type entièrement active I IFN voie de signalisation. Ils contiennent également le gène rapporteur de la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP) sous le contrôle de l&#39;IFN-α / ß promoteur inductible ISG54. La stimulation de ces cellules avec l&#39;IFN de type I active la voie JAK / STAT / ISGF3 voie et induit la production de SEAP. <ol><li> Maintenir des cellules HEK-IFN-α Bleu / ß dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Plate eux à une densité de 50.000 cellules par puits dans une plaque à fond plat 96, dans un volume final de 180 pi. </li><li> Ajouter 20 pi de surnageant de co-culture de chaque puits en double. Chaque plaque exige également un ensemble de contrôles internes standard (de l&#39;IFNa humaine, concentration finale de 100 U / ml à 2,500 U / ml). Incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 18-22 H. </li><li> Déterminer les niveaux d&#39;activité de la phosphatase alcaline en utilisant une solution de Quanti-Bleu, qui change du rose au violet / bleu dans la présence de l&#39;enzyme. Préparer QUANTI-Bleu en suivant les recommandations du fabricant. Ajouter 180 pi de cette solution à chaque puits d&#39;une plaque à fond plat 96. Pour chaque puits, ajouter également 20 pl des HEK-IFN-α Bleu / ß cellules surnageants induits, et incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la couleur se développe dans les puits standards de contrôle IFN. </li><li> Évaluer les niveaux de SEAP l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre à 620-655 nm et déterminer la concentration de type I IFN par extrapolation à partir de la partie linéaire de la courbe standard IFN. </li></ol></li></ol>

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Les protocoles décrits ici mesurent détection de cellules T infectées par le GFP-tagged virus VIH-1 qui diffèrent seulement par leur capacité à exprimer Vpu, comme décrit dans notre récent rapport 18. Cependant, ces méthodes pourraient facilement être modifiés pour étudier détection de virus non marqués ainsi que les virus dépourvus d&#39;autres gènes viraux qui pourraient moduler détection innée. Si les virus utilisés ne pas exprimer la GFP, le pourcentage de cellules cibles infectées doivent être déterminés par un autre moyen avant la co-culture, comme p24 (capside) coloration intracellulaire et cytométrie en flux ou par ELISA p24. Par ailleurs, ces protocoles peuvent être utilisés avec différentes cellules T cibles, y compris une variété de lignées cellulaires et des cellules primaires disponibles. Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont un certain nombre d&#39;avantages par rapport aux premières méthodes utilisées pour étudier le VIH-1 de détection. Tout d&#39;abord, il a été établi par un certain nombre de groupes que acellulaire VIH-1 pdes articles sont des inducteurs pauvres de type I IFN 2,13,14. En outre, les premières études comptaient sur les méthodes basées sur ELISA IFNa âgés de quantifier la quantité de type I IFN produit. Une limitation de cette technique de détection est que la plupart des kits ELISA IFNa âgés seule mesure un type d&#39;IFNa, tout en donnant sur les autres types de IFNa et IFNß. L&#39;utilisation des lignées de cellules rapporteurs décrits surmonte cette limitation que la concentration de toutes les formes bioactives de IFN humains de type I peut être mesurée à la fois. La technique est très sensible, moins cher que la nouvelle génération de kit ELISA IFN et pour de nombreux donateurs de grandes quantités d&#39;IFN de type I peuvent être facilement détectés. Néanmoins, ce protocole peut être facilement adapté pour une utilisation avec d&#39;autres type I IFN méthodes de lecture tels que ELISA. Les étapes critiques: Il est important que la qualité de tous les composants cellulaires (deux cibles et effecteurs) être étroitement contrôlée. Contamination potentielle, même lorsque asympmatique, doit être surveillée et contrôlée. Comme nous l&#39;avons mentionné précédemment, antibiotiques contrôlé contamination bactérienne asymptomatique, et potentiellement d&#39;autres pathogènes intracellulaires tels que les mycoplasmes, peut générer des réponses immunitaires similaires à ceux observés après infection VIH-1, à savoir la production d&#39;IFN de type I. En outre, tous les réactifs doivent être libres de LPS ou d&#39;autres endotoxines potentiels. De même, le suivi des CMSP et pDC est également important car les échantillons humains peuvent souvent être amorcés par des infections en cours sous-jacents, qui peuvent affecter la détection normale. Nous vous recommandons de toujours, y compris les contrôles négatifs proposées, telles l&#39;absence de cellules cibles ainsi que les co-cultures avec des cellules pseudo-infectées. La viabilité des cellules infectées est également important pour une détection correcte pDC depuis l&#39;IFN de type I ne se produit après co-culture avec des cellules apoptotiques 2,14. Une limitation importante de la technique est la nécessité pour les cellules primaires fraîchement isolées. Cette procédure n&#39;a pas ététesté en utilisant CMSP ou pDCs qui ont été soit préalablement congelés ou maintenues en culture. L&#39;isolement des PBMC est de main-d&#39;oeuvre et ces cellules ont une durée de vie très limitée. En outre, des protocoles standards pour la protection contre les agents pathogènes transmissibles par le sang devraient être utilisées tout en travaillant avec du sang humain. Il ya souvent plusieurs sources de variabilité associées au travail impliquant des cellules humaines fraîchement isolées. Parmi eux se trouvent les différentes procédures mises en œuvre pour isoler ces cellules, et la variabilité hérité rencontrées du donneur à donneur. Bien qu&#39;il soit impossible d&#39;éviter la variabilité entre les bailleurs de fonds, l&#39;utilisation des contrôles positifs proposées, telles que la mesure réponse à des agonistes connus de TLR7 et TLR9 voies, serait de fournir un contrôle interne important pour ces expériences. Nous avons observé qu&#39;une réponse robuste à des agonistes TLR9 de la voie pourrait être corrélée avec une réponse pDC en bonne santé, tandis qu&#39;une voie TLR7 sensibles est nécessaire pour une bonne réponse contre le VIH-1 3. 2, l&#39;enrichissement des PDC à partir de PBMC est souvent pas nécessaire. Toutefois, si le protocole expérimental l&#39;exige (par exemple dans le contexte où l&#39;épuisement des marqueurs spécifiques de la surface est nécessaire pDC) sélection négative est préférable à une sélection positive, les cellules restent libres de l&#39;anticorps après le processus de sélection. PDCs isolés apoptose rapide dans la culture. Pour les expériences qui ont besoin de ces cellules à cultiver pendant une période de temps prolongée, les milieux de culture peuvent être complétés avec de l&#39;IL-3. Cette cytokine induit pDC prolifération et l&#39;apoptose inhibe leur 16. Cependant, l&#39;IL-3 utilisation doit être étroitement contrôlé car il peut conduire à la maturation des pDC ou la différenciation. La méthode décrite ici combine cible du VIH-1 des cellules infectées avec CMSP ou pDCs fraîchement isolés afin de recréer les étapes initiales impliqués pendant la détection innée. Cette méthode sera sans doute utile de Explore événements immunitaires innées précoces associés à l&#39;infection à VIH. Bien que les protocoles associés visent à mesurer l&#39;IFN de type I, ils pourraient facilement être modifiés pour mesurer d&#39;autres molécules bioactives libérées de pDC lors de la reconnaissance des cellules infectées. Celles-ci peuvent inclure: l&#39;IFN de type III (IFN-λ), cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF-α et IL-6) et le chimiokines CXCL10, CCL4, CCL5 et 17.

Type I IFN-production pDCs représentent la première ligne de défense contre les infections virales, et en tant que telle servent de lien vital entre l&#39;immunité innée et adaptative 1. Bien que le VIH-1 sans cellule particules sont mal détectées par le système immunitaire inné, cellules T CD4 + HIV-1-infected sont effectivement détectés par les pDC 2. Le mécanisme de détection nécessite un contact initial entre la glycoprotéine d&#39;enveloppe virale (gp120) à la surface de la cellule T infectée et molécules de CD4 sur le contrôleur principal, qui est ensuite suivie de la capture du virus et l&#39;internalisation par les pDC. La reconnaissance ultérieure de transfert ARN VIH-1 par TLR7 déclenche l&#39;activation de la / voie de IRF7 MyD88 et conduit à de type I production d&#39;IFN 3 en fin de compte. Fait important, la seconde voie présente dans pDC de détection, qui est médiée par TLR9, est inhibé par l&#39;interaction de la glycoprotéine virale gp120, avec le PDC spécifique marqueur de surface BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; Les TLR7 et TLR9 voies de détection de pDC peuvent éventuellement être modulés négativement par l&#39;engagement de BST2 (également désigné Tetherin ou CD317) avec un autre inhibiteur de récepteur de surface spécifique pDC-ILT7 5. BST2 est exprimé à des niveaux élevés à la surface des pDC et certaines cellules cancéreuses, mais à des niveaux relativement plus bas à d&#39;autres types de cellules, comme les cellules B, les macrophages et les lymphocytes T. Fait important, BST2 peut être induite par l&#39;IFN de type I dans un certain nombre de lignées de cellules transformées ainsi que dans des cultures de cellules primaires d&#39;origines humaines et murines 6. Outre sa fonction de régulation immunitaire, BST2 a récemment été trouvée pour inhiber la libération de VIH-1 et d&#39;autres particules virales enveloppé par des particules virales naissantes de reticulation sur la surface des cellules infectées 7. Dans le cas du VIH-1, la protéine codée par le virus accessoire U (Vpu) a été représenté à agir comme un antagoniste de BST2. On pense que Vpu BST2 régule à la baisse de la surface cellulaire de cellules VIH-1 infectées par le site de son attacheing activité et par conséquent augmente le dégagement et la propagation virale 7, bien que cette notion a été contestée 8,9. En l&#39;absence de Vpu, un grand nombre de descendants entièrement formés et matures du VIH-1 à particules sont retenues la surface de la cellule. Que ces particules captifs pourraient représenter des cibles efficaces pour la détection immunitaire reste encore une question ouverte. En outre, il est difficile de savoir si Vpu pourrait dysréguler production d&#39;IFN-I Type de pDC par la surface moduler BST2 niveaux. Les premières études visant à évaluer le VIH-1 de détection ont été menées en utilisant sans cellules du VIH-1 particules, qui sont généralement considérés comme des inducteurs pauvres de type I IFN 3,10-12. Étant donné que les études récentes suggèrent que les CMSP et pDCs détectent efficacement infecté par le VIH lymphocytes T CD4 + 2,13,14, que nous décrivons ici une méthode simple pour mesurer les réponses innées déclenchées par pDCs sur la reconnaissance des cellules VIH-1-infected in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

VIH-1 détection innée nécessite un contact direct des cellules T CD4 + infectées avec des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Afin d&#39;étudier ce processus, les protocoles décrits ici utilisent des cellules fraîchement isolées humains périphériques mononucléaires du sang (CMSP) ou des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) afin de détecter les infections dans les deux lignée de cellules T (MT4) ou des cellules primaires hétérologues T CD4 +. Afin d&#39;assurer une bonne détection, il est essentiel que les PBMC sont isolés immédiatement après la collecte de sang et que le pourcentage optimal de cellules T infectées sont utilisés. De plus, la coloration multi-paramétrique par cytométrie de flux peut être utilisée pour confirmer que les échantillons de PBMC contiennent les différentes lignées cellulaires à des taux physiologiques. Un certain nombre de commandes peuvent également être inclus pour évaluer la viabilité et la fonctionnalité des pDC. Ceux-ci comprennent la présence de marqueurs de surface spécifiques, l&#39;évaluation de la réponse cellulaire à agoniste connu des récepteurs Toll-like (TLR) voies, et confirmant l&#39;absence de Spontané interféron de type I (IFN) production. Dans ce système, des PBMC fraîchement isolées ou des pDC sont co-cultivées avec des VIH-1 des cellules infectées dans des plaques à 96 puits pour 18 à 22 h. Les surnageants provenant de ces co-cultures sont ensuite utilisées pour déterminer les niveaux d&#39;IFN de type I bioactives en contrôlant l&#39;activation de la voie de ISGF3 dans des cellules HEK-Blue cellules / ß IFN-a. Avant et pendant des conditions de co-culture, les cellules cibles peuvent être soumis à une analyse par cytométrie flux afin de déterminer un certain nombre de paramètres, y compris le pourcentage de cellules infectées, les niveaux de marqueurs de surface spécifiques, et de tuer différentielle des cellules infectées. Bien que, ces protocoles ont été initialement développées pour suivre la production d&#39;IFN de type I, ils pourraient être utilisés pour étudier d&#39;autres molécules Imuno-modulatrices libérés de PDC et pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent le VIH-1 détection innée.

Le système de co-culture décrite sur la figure 1 permet une étude contrôlée de détection du VIH-1 inné. En raison de la nature variable des cellules primaires, il est important que les taux normaux de myéloïdes et les cellules T (cellules CD14 + et CD3 +, respectivement) sont observés, comme dans l&#39;exemple représenté sur la figure 2A. En outre, seul un faible nombre de cellules T activées (FS niveaux plus élevés et plus élevés par rapport CD3 de cellules T non activées) sont souhaitables dans les cultures PBMC fraîchement isolées. PBMC avec des rapports anormaux entre les différents types de cellules sont souvent incapables de monter une réponse immunitaire innée approprié in vitro, probablement due à un phénotype déjà activé en tant que conséquence d&#39;une infection en cours. Plus important encore, le pourcentage relatif de pDC doit être évaluée comme illustré dans la figure 2B. Bien que ce pourcentage peut varier de 0,2 à 1,2%, un phénotype anormal de détection est également observée avec les deux extremes de cette gamme. Enrichissement des PDC en utilisant la sélection négative donne souvent 50-95% pDC pureté, comme on le voit dans les deux exemples de la figure 2B (92% et 72%). Un exemple typique pour l&#39;expérience globale est montrée sur les figures 3 et 4. Dans cet exemple, des cellules MT4 ont été infectées avec pNL4.3 GFP_ires_Nef-WT ou delta Vpu infection pour atteindre 30% au moment de la co-culture (figure 3A). Comme décrit précédemment, uniquement les infections par le virus WT donné lieu à une régulation à la baisse significative de BST2 de surface (Figure 3B). En raison de leurs différences de taille et la granularité, des cellules MT4 peuvent être facilement distingués des PBMC par cytométrie de flux (Figure 4A). Après l&#39;incubation de co-culture, seuls les CMSP en contact avec connue TLR7 ou TLR9 agoniste et CMSP en contact avec le VIH-1 quantités importantes cellules infectées libérés de type I IFN (figure 4B). N IFN a été détecté dans des PBMC seul, dans les CMSP cu co-ltured avec des cellules MT4 pseudo-infectées ou dans les cellules MT4 infectées seulement de (figure 4B). Dans l&#39;exemple présenté ici, la détection inné de cellules MT4 VIH-1 infectées par des PBMC a été trouvé être sensiblement réduite en présence de Vpu. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Figure 1:. Aperçu schématique de la conception expérimentale SUP: surnageant <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Figure 2: La caractérisation phénotypique des CMSP et enr fraîchement isoléspDCs iched. (A) de la distribution normale des cellules myéloïdes et les cellules T observées dans les CMSP isolées à partir d&#39;un donneur sain (Pourcentage de cellules myéloïdes devraient varier entre 10-20% et les cellules T comprise entre 55-65%). Échantillon PBMC ont été colorées en utilisant des anticorps conjugués à un fluorophore qui reconnaissent CD14 de surface (marqueur de lignée myéloïde) et CD3 (marqueur des cellules T). (B) de la caractérisation phénotypique des PDC. Avant pDC enrichissement représentent entre 0,2 à 1,2% du nombre total de cellules dans les PBMC (0,99% dans l&#39;exemple représenté). Ces cellules peuvent être identifiées sur la base de l&#39;expression de marqueurs spécifiques tels que BDCA2 et ILT7, présents à la surface cellulaire. La sélection négative peut être utilisé pour enrichir de manière significative le nombre de PDC et d&#39;éliminer les contaminations potentiellement nuisibles, tels que CD14 + cellules myéloïdes (enrichissement atteignant 92% et 72% dans les deux exemples représentés). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Figure 3:. Caractérisation des cellules MT4 cibles HIV-1-infected (A) Pourcentage de cellules infectées dans les cultures de MT4 infectées par pNL4.3 GFP_ires_Nef-WT ou dVpu tel que déterminé par le pourcentage de cellules GFP-positives. (B) les cellules de surface BST2 expression dans les cellules infectées a été évaluée après coloration de surface. Les histogrammes gris rempli représentent des cellules pseudo-infectées colorées avec du sérum de lapin pré-immun (témoin non coloré); les histogrammes restants représentent cellules colorées avec anti-BST2 sérum polyclonal de lapin. Histogrammes avec des lignes pleines représentent contrôle négatif de la GFP (neg) des cellules; tout en histogrammes avec pointillés correspondent à (POS) des cellules infectées GFP positives. Grippe moyennel&#39;intensité de orescence (IMF) valeurs sont indiquées pour chaque échantillon. La cytométrie en flux a été réalisée et analysée comme décrit dans la figure 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Figure 4:. Co culture des PBMC fraîchement isolés et des cellules MT4 infectées T (A) Comparaison de cytométrie en flux profils FS / SS observés pour les cellules MT4 T seul, seul CMSP, ou co-cultures entre les CMSP et des cellules MT4 T. En raison des différences de taille et de granularité, les cellules MT4 T ​​peuvent être facilement distingués des CMSP en co-cultures en utilisant la cytométrie de flux. (B) d&#39;un exemple représentatif de la quantité de type I IFN libéré après stimulation de PBMC avec TLR7 ou TLR9 agoniste (il ya), ou après co-cultures avec maquette ou les cellules MT4 indiqués infectées par pNL4.3-GFP_ires_Nef WT ou dVpu. Les données brutes présentés comme OD 650 valeurs et de leur converseion correspondant au type I IFN concentration exprimée en U / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Contrairement aux particules du VIH-1 sans cellules, les cellules T CD4 + infectées sont effectivement détectés par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Ce manuscrit décrit une méthode où les cellules périphériques mononucléaires du sang (PBMC) ou des pDC isolées sont co-cultivées avec le VIH-1 des cellules T infectées par détection d&#39;évaluer innée par les pDC évaluée par la libération de l&#39;IFN de type I.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K vues.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  Contrairement aux particules du VIH-1 sans cellules, les cellules T CD4 + infectées sont effectivement détectés par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Ce manuscrit décrit une méthode où les cellules périphériques mononucléaires du sang (PBMC) ou des pDC isolées sont co-cultivées avec le VIH-1 des cellules T infectées par détection d'évaluer innée par les pDC évaluée par la libération de l'IFN de type I. 

Vidéo: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

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Immunologie et infection

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Évaluer le développement de cellules murines dendritiques plasmacytoïdes dans les plaques de Peyer Utiliser le transfert adoptif de progéniteurs hématopoïétiques

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In Vitro génération de cellules dendritiques plasmacytoïdes murin de Common lymphoïde progéniteurs utilisant le système de chargeur AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC Based protéomique Caractérisation des exosomes du VIH-1 des cellules infectées

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...