Nous remercions Gordon Freeman pour fournir l&#39;anticorps bloquant anti-PD-L1. Nous remercions le personnel clinique et de laboratoire à l&#39;Hôpital général du Massachusetts et tous les participants à l&#39;étude pour leur rôle inestimable dans ce projet. Cette étude a été financée par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health (SP1 AI-080192; DEK), le coeur-poumon National and Blood Institute des National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK est soutenu par une bourse de carrière bourse de recherche du Fonds de recherche en santé du Québec (FRQS). FP est soutenu par une subvention de la communion de l&#39;Assemblée générale Comité exécutif Hôpital Massachusetts sur la recherche et le Global Health Institute de Harvard (HGHI).

Une. L&#39;épuisement et l&#39;isolement des PBMC par Ficoll séparation <ol><li> Épuiser les cellules T CD8 + en ajoutant humain CD8 + Depletion Cocktail à 50 ul / ml de sang entier. </li><li> Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante (18-25 ° C). </li><li> Après incubation, mélanger le sang total avec HBSS (solution saline équilibrée de Hank sans Ca 2 + ou Mg 2 +) et couche sur Histopaque. Tourner à 340 rcf pendant 30 min (pas de frein, accélération lente). </li><li> Recueillir les CMSP et transférer à une nouvelle conique de 50 ml. Laver 2 fois avec 45 ml de RPMI 1640 supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1% de HEPES et en faisant tourner pendant 10 min à 340 rcf. </li></ol> 2. Blocus d&#39;anticorps et de stimulation spécifique de l&#39;antigène des cellules <ol><li> Resuspendre les cellules à 2x10 6 pour la condition dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES,représentant 500 pi par état. </li><li> Aliquote de 500 ul de suspension cellulaire par FACS tube. </li><li> En fonction de la voie d&#39;une enquête, ajouter PD-L1, l&#39;IL-10Rα anticorps de blocage et / ou des contrôles isotypiques à 10 ug / ml et incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Stimuler les cellules avec une piscine de peptide Gag VIH-1 à 1 pg / ml / peptide concentration finale. Inclure aussi un contrôle &quot;pas de stimulation&quot; pour chaque condition de blocage. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures. </li></ol> 3. Collecte et analyse de surnageant <ol><li> Après 48 heures, centrifuger les tubes FACS pendant 7 minutes à 340 FCR. </li><li> Recueillir soigneusement les 2 x 225 pi surnageant dans des tubes Eppendorf pour Luminex arrangements de billes sans perturber le culot. </li><li> Inactiver les virus dans le surnageant recueilli avec 25 ul de 0,5% de PBS-Tween pour donner une concentration finale de 0,05% de PBS-Tween. </li><li> Magasin recueillies surnageants qui ne sont pas immediately utilisé dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Mesurer les concentrations de cytokines souhaitées en utilisant le kit Millipore Luminex selon le protocole du fabricant. </li></ol> 4. Collecte et Analyse phénotypique des cellules par cytométrie en flux <ol><li> Après avoir recueilli le surnageant, laver les cellules dans 3 ml de PBS. Spin cellules pendant 7 minutes à 340 FCR et décanter excès lavage. </li><li> Teinture de viabilité en utilisant un kit portable de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. </li><li> Laver les cellules dans du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS. </li><li> Si la coloration pour les monocytes ou d&#39;autres cellules présentatrices d&#39;antigènes, les récepteurs de Fc bloc en ajoutant 1,4 ul de réactif de blocage des FcR et vortex pour mélanger. </li><li> Incuber pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter les anticorps de surface, les vortex, et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, décanter excès de lavage, et ajouter 200 ul paraformaldéhyde 4%. Incuberà la température ambiante pendant 20 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et d&#39;acquérir une multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSRII ou Fortessa). </li></ol> 5. Analyse des cellules par qRT-PCR <ol><li> Pour les cellules non analysé par cytométrie de flux: après la collecte de surnageant, lyser les cellules dans 300 ul de tampon RLT Qiagen contenant 1% de bêta-mercaptoéthanol. Si ce n&#39;est pas en continuant avec le protocole, les cellules peuvent être congelées à -80 ° C après ce point. </li><li> Isoler l&#39;ARN en utilisant un kit d&#39;isolement d&#39;ARN en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Synthétiser un ADNc à partir d&#39;ARN en utilisant un kit de synthèse d&#39;ADNc en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Faire la PCR quantitative en utilisant la technologie SYBR Green. </li><li> Création d&#39;un mélange d&#39;amorces pour chaque amorce utilisée, y compris des gènes domestiques (par exemple, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) par l&#39;addition d&#39;amorces à la nucléase sans eau pour donner une concentration finale de 10uM. Garder sur la glace. </li><li> Créer un mélange maître pour chaque amorce en ajoutant 10,5 pi d&#39;eau sans nucléase, 12,5 pi SYBR vert, et 1 pi mélange d&#39;amorces par plaque bien. Garder sur la glace. </li><li> Pipette 24 ul mélange maître dans chaque puits de la plaque qui sera utilisé. </li><li> Ajouter 1 ul d&#39;ADNc à chaque puits selon modèle. </li><li> Cap puits et la plaque de centrifuger 3 min à 800 rcf. </li><li> Exécutez plaque sur une machine qRT-PCR, par exemple, un instrument Stratagene MX3005P. </li></ol> 6. Adaptation pour intracellulaire de cytokines coloration à 48 h Ajouter Brefeldin monensin et 6 heures avant la coloration des cytokines intracellulaires. Brefeldin est ajouté à une concentration de 10 ug / ml tandis que la monensine est ajoutée selon les instructions du fabricant. Pour plus de commodité, la Bréfeldine peut être ajouté 12 heures avant la teinture, à une concentration de 5 pg / ml. <ol><li> Après coloration de surface, laver les cellules avec du PBS 1% de FBS et tache danscytokines intracellulaires telles que l&#39;IL-12, IFN-γ et TNF-α en utilisant un kit de fixation / perméabilisation de solutions et de protocole. </li><li> Laver les cellules, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et fonctionner sur un multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSR II ou Fortessa). </li></ol> 7. Adaptation pour le tri des cellules <ol><li> 16 heures après la stimulation, la tache pour la viabilité cellulaire en utilisant le kit de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. Gardez les cellules sur la glace durant la procédure entière. </li><li> Laver les cellules avec du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS. </li><li> Ajouter des anticorps de surface, vortex pour mélanger et incuber les cellules sur la glace dans l&#39;obscurité pendant 20 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS à 340 rcf et à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de milieu RPMI 1640 froid contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% HEPES. </li><li> cellules de filtrage à l&#39;aide de 5 ml Polystyrene Tube à fond rond avec bouchon Cell-passoire. </li><li> Préparer des tubes de collecte pour trier par addition de 200 ul de milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES à chaque tube. Conservez tous les tubes sur la glace pendant le tri. </li><li> Trier en direct les sous-ensembles de cellules d&#39;intérêt sur ​​un instrument (par exemple BD FACS Aria II) situé dans un établissement équipé pour matières infectieuses. </li><li> Après que les cellules ont été triées, place des cellules dans l&#39;incubateur pour la durée souhaitée et suivre l&#39;analyse collection surnageant / Luminex et d&#39;analyse collecte de culot cellulaire / PCR. </li></ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++CD25++regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes.">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

collecte de surnageant est une composante essentielle de cette conception expérimentale. Lors de la récolte des surnageants pour l&#39;analyse Luminex, des aliquotes ont été établis et conservés à -80 ° C pour éviter la dégradation des protéines en raison de cycles gel-dégel. La congélation et la décongélation peut être processus rigoureux pour les protéines, et en minimisant gel-dégel, le signal sera maximisé dans les essais. Par conséquent, il est plus facile d&#39;obtenir des données plus précis...

Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d&#39;infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l&#39;IL-2, TNF- α et IFN-γ 1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l&#39;IL-10, sont régulés à la hausse au cours des infections chroniques et de contribuer à un dysfonctionnement des cellules T (revue dans 3,4). Administration in vivo d&#39;anticorps bloquants contre ces voies inhibitrices chez la souris de LCMV modèle de fonction des cellules T spécifiques du virus épuisés et amélioré la clairance virale rétablie, ce qui indique que l&#39;épuisement de cellules T est un phénomène partiellement réversible (revue dans 5). Conclusions sur ee modèle de LCMV ont été rapidement étendu à des infections virales chroniques humaines telles que le VHB, le VHC et le VIH 5. Dans chronique par le VIH-1 infection, PD-1 et IL-10 sont régulés à la hausse dans les voies sujets infectés et en corrélation avec les paramètres de la progression de la maladie, directement avec la charge virale et inversement proportionnelle à la numération des CD4 8.6. Blocage des anticorps PD-1 ou l&#39;IL-10 in vitro des voies restauré la prolifération des cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH, indiquant que, comme dans le modèle de la souris LCMV, T épuisement des cellules chez l&#39;homme est un phénomène partiellement réversible. Toutefois, en raison de la nature délicate des expériences sur des échantillons humains ainsi que les limites de la sensibilité des tests in vitro, étude approfondie des profils de restauration fonctionnelle obtenus par ces interventions est frappante absent. Les tests de prolifération ont été, jusqu&#39;à présent, le seul test fiable in vitro testé dans la plupart des études, mais il ya un manque remarquable de preuves sur l&#39;impact de ces interventionsinterventions sur: 1) la capacité de destruction des cellules T cytotoxiques, 2) l&#39;effet antiviral des lymphocytes T sur la réplication virale, 3) le profil de sécrétion des cytokines, et 4) l&#39;effet sur CD4 aide des lymphocytes T sur d&#39;autres sous-ensembles de cellules. Coloration intracellulaire des cytokines (ICS) est un courant très utile et largement utilisé dosage basé sur une cytométrie qui est utilisé pour détecter la production de cytokines dans divers types de cellules chez les souris et les humains. Il a également été utilisé pour étudier l&#39;effet de l&#39;anticorps au blocage des voies inhibitrices. Dans les dosages de l&#39;ICS, la sécrétion de cytokines est bloquée par l&#39;addition de Brefeldin et / ou de monensin. Les cytokines piégées à l&#39;intérieur des cellules sont ensuite détectés avec des anticorps fluorescents en utilisant la cytométrie en flux polychromatique. La durée de l&#39;essai est généralement limité à 6 ou 12 h après la stimulation antigénique puisque les deux Brefeldin et monensine, qui sont typiquement ajoutés en 2 heures de l&#39;addition de l&#39;antigène, sont toxiques pour les cellules. Le dosage des ICS est une technique puissante qui a été i utilesn l&#39;investigation de l&#39;effet de l&#39;administration in vivo d&#39;anticorps de blocage intervention chez les souris où les cellules ont été extraites, après une certaine période de temps après l&#39;exposition de l&#39;anticorps 9. Cependant, il existe plusieurs limitations à l&#39;application de cette approche expérimentale pour évaluer l&#39;impact de blocage des récepteurs inhibiteurs dans les échantillons humains. Lors d&#39;interventions d&#39;anticorps de voies inhibitrices dans une stimulation 6 ou 12 heures in vitro (typiquement le cas avec des échantillons humains), le blocage des récepteurs inhibiteurs dans la plupart des cas, ne modifie pas la fréquence de la réponse des cellules T spécifiques de l&#39;antigène, mesurée par des dosages de l&#39;ICS standards 6, 7. Les mesures de la production de cytokines par des cellules, mesurée par l&#39;intensité moyenne ou la médiane de fluorescence ont donné des résultats incohérents 6, 7, 10. D&#39;autre part, lorsque ICS est effectuée à un point de temps après la fin de la stimulation (par exemple six jours), les changements dans le nombre de cytokine sécrétant caunes peuvent être observées. Les différences sont un effet combiné de la prolifération altérée, la survie et l&#39;évolution de la fonction d&#39;effecteur qui s&#39;accumulent au cours de la période de temps spécifiée 6. Une façon de surmonter une partie de ces limitations est à incuber pendant de longues périodes de temps (par exemple 36 h, 60 h, etc.) Avec l&#39;antigène avant l&#39;ajout de l&#39;inhibiteur de sécrétion des cytokines sans attendre à la prolifération de se produire. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour déterminer la cinétique de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH 11,12, mais cette approche n&#39;est pas en mesure de détecter des réponses petites et ne donnera pas un résultat intégré de la sécrétion de cytokine totale survenant car la stimulation. Par conséquent, ICS n&#39;est pas une méthode suffisamment sensible pour détecter l&#39;impact de blocage des voies inhibitrices de la quantité de cytokines produites par les cellules T activées par rapport à la quantification de l&#39;ARNm de cytokines ou des mesures de la sécrétion de cytokines dans le supernatant aux mêmes points dans le temps. En outre, la plupart des cytokines produites par les lymphocytes T activés agissent de façon autocrine, en contribuant à la rétroaction positive ou négative par une interaction avec des boucles de cellules présentatrices d&#39;antigène. Par conséquent, l&#39;addition de Brefeldin monensin ou au cours de l&#39;essai de ICS empêche la sécrétion de cytokines et donc la stimulation des cellules T n&#39;est pas optimale. Enfin, la détection de multiples cytokines avec ICS est limitée par la disponibilité d&#39;anticorps et de la sensibilité pour la détection des cytokines avec la cytométrie de flux, ainsi que par des contraintes dans le nombre des fluorochromes qui peuvent être utilisés simultanément dans n&#39;importe quel panneau donné. Nous avons développé une approche très sensible in vitro expérimentale pour évaluer l&#39;impact des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH et par la suite CD4 aide à cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA) et les cellules tueuses naturelles (cellules NK). Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer l&#39;impact de blocus de molécules inhibitrices de la fonction des cellules T CD8 par épuiser les cellules de PBMC T CD4 ou en stimulant des peptides optimales reconnues uniquement par les cellules T CD8. Contrairement à intracellulaires dosages de cytokines de coloration, nous avons décidé de ne pas interférer avec la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH afin d&#39;être en mesure de: 1) réaliser une quantification plus précise des niveaux de cytokines produites; 2) étudier un panel plus large des cytokines ou des molécules effectrices, et 3) évaluer l&#39;impact de cytokines produites par les cellules T CD4 spécifiques du VIH sur les autres sous-ensembles de cellules. On stimule CD8 PBMC déplétées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide, en présence d&#39;anticorps bloquants pour la voie immunorégulateur d&#39;intérêt. Après le temps désiré d&#39;incubation, généralement 48 heures, nous recueillons les surnageants de mesurer la sécrétion de cytokines avec des tableaux de perles et de recueillir les culots cellulaires soit pour l&#39;analyse phénotypique des différents sous-ensembles de cellules ou pour l&#39;analyse de la transcription. De noter, à tson article 48, point de temps h, on ne détecte pas une population significative de la prolifération des cellules T 12. Il s&#39;agit d&#39;une approche souple et plusieurs adaptations de cette conception peut être appliquée pour répondre à différentes hypothèses. Par exemple, les sous-ensembles de cellules individuelles (telles que des cellules T CD4 spécifiques du VIH ou de PD-1 des cellules de haute T CD4, etc.) Peuvent être triées après 12 h d&#39;incubation avant incubation supplémentaire pendant 36 heures puis on a recueilli les surnageants et les culots de cellules d&#39;enquêter plus spécifiquement l&#39;impact des interventions du blocus sur la sécrétion de cytokines par les sous-populations définies de CMSP.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9394</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0883</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human Serum AB</td>
			<td>Gemini BioProducts</td>
			<td>100-512</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>30 001 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25 005 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FcR blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail </td>
			<td>Stem Cell </td>
			<td>15663</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Improm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IFN-&gamma; primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAPDH primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vitro assay to evaluate the impact of immunoregulatory pathways on hiv-specific cd4 t cell effector function

T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l&#39;agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l&#39;antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l&#39;infection par LCMV, l&#39;administration d&#39;anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n&#39;existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l&#39;impact d&#39;un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d&#39;échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH. Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur ​​les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l&#39;IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO 2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l&#39;analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l&#39;analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l&#39;épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d&#39;être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l&#39;antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.

Pour effectuer des mesures de cytokines en utilisant ce système in vitro, il est essentiel d&#39;être capable de distinguer les réponses spécifiques de l&#39;antigène par rapport au pas de commande de stimulation. En général, nous avons considéré que les réponses positives des valeurs de la stimulation antigénique qui donnent au moins trois fois plus dans les niveaux de cytokine par rapport au pas de commande de stimulation et qui étaient dans la plage linéaire du dosage. Nous utilisons sensibilit?...

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In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

14.0K vues.  The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard.  Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH. 

Vidéo: In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Recherche

Immunologie et infection

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation de queue peau d&#39;étudier allogéniques CD4 réponses des cellules T chez la souris

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Basée sur l&#39;image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In Vitro Differentiation of Human CD4 + FOXP3 cellules + Induced T régulatrices (de iTregs) de Naïf cellules T CD4 + en utilisant un protocole TGF-β contenant