Les auteurs tiennent à remercier tous les collègues qui ont rendu ce travail possible, en particulier Maya Balamane, Elizabeth Johnston Blanc, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, et Lungani Ndwandwe. Les auteurs tiennent aussi à remercier tout le personnel du ministère de la Santé et le personnel du Centre Afrique qui travaillent le traitement du VIH Hlabisa et programme de soins.

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<div> Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Union européenne (2007 SANTE 147-790), le Centre américain pour le contrôle des maladies par CAPRISA (titre du projet: Renforcement des systèmes de santé et l&#39;échec de traitement du VIH (VIH- TFC)), et le Programme commun de recherche suisse africain du Sud (SSJRP) subvention de recherche intitulé «Swiss Prot / Afrique du Sud: Protein Bioinformatics développement des ressources pour importants pathogènes liés à la santé&quot;. RL est soutenu par le Wellcome Trust (numéro de licence 090 999 / Z / 09 / Z). Les bailleurs de fonds n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents. </div>

Plusieurs faible coût des méthodes internes ont été décrits dans les efforts pour tenter de faire génotypage de la pharmacorésistance du VIH plus abordables 33, 34, 36. Il ne fait aucun doute de la nécessité d&#39;intégrer les tests de résistance aux médicaments dans le continuum de soins pour les personnes sous traitement antirétroviral dans les pays à ressources limitées. Cependant, la plupart des méthodes déclarés se concentrent sur l&#39;application de génotypage de la pharmacorésistance dans la surveillance de la résistance aux médicaments au niveau de la population. La méthode de génotypage Saturne / Life Technologies est un protocole entièrement intégrée pour la surveillance et le suivi de la résistance aux médicaments. Cette méthode a été conçue pour être un protocole abordable mise en œuvre de la plupart open source et open ressources accès bioinformatiques pour l&#39;interprétation de la résistance aux médicaments et la production de rapports de gestion clinique. Il a été démontré par la comparaison avec la méthode de génotypage ViroSeq approuvé par la FDA pour êtreprécis dans l&#39;identification des mutations de résistance aux médicaments à partir d&#39;un panel de l&#39;ANRS échantillons d&#39;essais d&#39;aptitude, dans 100% des échantillons de panneaux de laboratoire qui ont été amplifiés avec succès. La précision a également été évaluée sur des échantillons cliniques de virus de sous-type C, le sous-type le plus dominant en Afrique australe. Le procédé était le plus précis sur des échantillons de sous-type C tel qu&#39;il était sur le sous-type A et B. Cependant, si le procédé sera utilisé dans d&#39;autres parties du monde où CRF02_AG est répandue, il existe un besoin pour la modification des amorces puisque le procédé pas amplifier un des échantillons du panel qui a été montré pour avoir CRF02_AG. En variante, un ensemble d&#39;amorces sensibles à tous les virus du groupe M 33 dégénérée, 36 pourrait être utilisé dans les régions où le sous-type de la distribution est plus hétérogène 38. La sensibilité de la transcription inverse et la PCR peut être augmentée par l&#39;extraction de l&#39;ARN à partir de l&#39;augmentation des volumes de plasma, telles que 500 ml. Le plasma peut être centrifuged à 21 000 g pendant 90 min à concentrer les particules virales avant de poursuivre avec le protocole tel que décrit par le mini kit d&#39;extraction d&#39;ARN viral QIAamp. Comme indiqué, la nouvelle méthode présente un avantage supplémentaire qu&#39;il produit des rapports complets pour la gestion individuelle du patient. Ces rapports sont une consolidation du génotype, immunologiques et des données de surveillance virologique ainsi que l&#39;histoire clinique et le traitement de RegaDB. Ceci est accompagné par une interprétation de laboratoire détaillée du profil de résistance suivie par un examen aussi détaillé de l&#39;histoire clinique du patient ainsi que des recommandations de traitement. L&#39;utilisation d&#39;un spécialiste médecins d&#39;examiner les rapports et faire des recommandations de traitement pour les patients fournit le mentorat bien nécessaire pour les infirmières praticiennes ainsi que des cliniciens expérimentés, qui sont de plus en plus offrent ART en Afrique du Sud dans le cadre des recommandations de l&#39;OMS pour la délégation des tâches. Ces cliniquerapports ont été montrés comme des aides d&#39;enseignement efficaces pour les cliniciens ayant peu ou pas d&#39;expérience dans la gestion de la résistance aux médicaments. Du point de vue du patient, notre méthode réduit le besoin de se déplacer vers des sites centralisés pour accéder à des services spécialisés pour le VIH. Ainsi, le protocole décrit dans son ensemble constitue une bonne plate-forme à travers laquelle la gestion de la résistance du VIH aux médicaments peut être intégré, à un coût abordable, dans le continuum de soins pour les personnes infectées par le VIH ART défaut. Les données générées peuvent être utilisés à des fins épidémiologiques pour évaluer l&#39;évolution et la transmission de la résistance aux médicaments dans la communauté. La taille du fragment pol généré est assez bon pour l&#39;analyse phylogénétique plus complexe qui va produire une meilleure compréhension de l&#39;épidémie au niveau de la population.

L&#39;épidémie de VIH en Afrique australe a connu une évolution rapide 1 avec une augmentation exponentielle concomitante chez les personnes sous traitement antirétroviral (ART), en particulier en Afrique du Sud 2, 3. Comme preuve de l&#39;impact épidémiologique des programmes de traitement à grande échelle pour réduire l&#39;incidence 4 et l&#39;augmentation de l&#39;espérance de vie dans les pays à ressources limitées (RLS) 5 continue à s&#39;accumuler, les efforts visant à accroître la couverture du traitement antirétroviral seront intensifiés. L&#39;évolution des lignes directrices à l&#39;utilisation du traitement comme outil de prévention 6, 7 au titre des programmes de test et traitement signifie que le nombre absolu de personnes sous traitement va encore augmenter. Un grand nombre de personnes seront sous ARV pendant de longues périodes de temps que l&#39;espérance de vie moyenne des individus sur ART se rapproche de celui de la population non infectée du VIH 8. Le développement et la transmission de la pharmacorésistance du VIH a Always été considéré comme une menace pour les réalisations de l&#39;art 9-12. Ainsi, il est nécessaire pour la surveillance et le suivi de la résistance aux médicaments plus rigoureux que plusieurs personnes sont engagées sur ART. Tester la résistance aux médicaments génotypique (GRT) a été utilisé avec succès dans les pays développés, à la fois pour la surveillance ainsi que la surveillance du VIH-1 la résistance aux médicaments chez les personnes recevant un traitement antirétroviral. Dans ces contextes, GRT a été intégrée dans le continuum de soins pour le VIH-1 individus infectés. La plupart des directives internationales recommandent TJB pour les patients adultes ou pédiatriques défaut ART (première ligne et de deuxième ligne) 13-15, les patients de pédiatrie exposés à la prévention de la transmission mère-enfant (PTME), mais par la suite les régimes infectés 16, et dans les endroits où hauts niveaux de résistance aux médicaments transmis entre les individus présentant une infection aiguë 13-15. Toutefois, les exigences de coûts, de la technologie et de l&#39;infrastructure ont limité la miseœuvre des approches similaires à la surveillance de la résistance aux médicaments dans le SJSR. Le traitement du VIH d&#39;Afrique du Sud et des lignes directrices de suivi ne recommande pas actuellement l&#39;utilisation de GRT dans le choix de guidage de l&#39;ART pour les personnes défaillantes schémas de première intention 17. Les individus sont mis basée principalement sur virologique (ARN VIH-1 charge virale) paramètres. Cependant en 2012, l&#39;Afrique australe cliniciens du VIH Société a publié les premières lignes directrices 18 tests de résistance aux médicaments ARV Afrique du Sud. Ces lignes directrices recommandent de tester GRT pour tous les adultes à défaut de première ligne et de deuxième intention et pour les nourrissons infectés et les enfants exposés à la PTME 18. Cependant, GRT n&#39;est pas recommandé pour les personnes de 18 infection aiguë, car il n&#39;existe aucune preuve réelle des niveaux élevés de résistance aux médicaments transmis dans le sud de l&#39;Afrique 19-29. Il est prévu que certaines de ces recommandations seront intégrés au fil du temps dans le tre nationalatment et suivi les directives des différents pays de la région. Déjà, en 2013 des lignes directrices de traitement en Afrique du Sud il ya maintenant recommandation du GRT au moment de l&#39;échec de deuxième ligne pour les adultes et au moment de la première ou de deuxième ligne échec thérapeutique à base d&#39;IP pour les enfants 30. Il a été démontré que l&#39;incorporation de GRT dans les directives de traitement en Afrique du Sud serait potentiellement coût-neutre. Compte tenu du coût des médicaments de deuxième ligne de traitement qui sont relativement plus chers que les médicaments de première ligne, en utilisant GRT pour identifier les patients qui ont vraiment besoin d&#39;être passé à un traitement de deuxième ligne n&#39;entraînera pas de coût supplémentaire pour le programme. En outre, GRT peut également identifier d&#39;autres raisons de l&#39;échec, de conserver les options de traitement et de générer des informations sur les profils de résistance émergents 31. Par conséquent, il est nécessaire de réduire le coût des méthodes de surveillance de la résistance aux médicaments encore plus loin afin d&#39;améliorer l&#39;accès, la qualité des soins d&#39;und résultats. Ici, nous présentons une méthode de GRT conçu pour utiliser génériques (open source) des amorces pour la transcription inverse, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage (tableau 1), ainsi que les logiciels open source pour la plupart de la pharmacorésistance interprétation. Pour la gestion clinique, le protocole est complété par un examen et un signalement méthode complète avec interprétation spécialiste du rapport de la résistance aux médicaments de laboratoire avec un strict respect des directives nationales de traitement. Le protocole est divisé en quatre composantes différentes: 1) acide ribonucléique du VIH (ARN) de l&#39;extraction, 2) la transcription inverse et Polymerase Chain Reaction (PCR) de cibles virales, 3) séquençage et 4) les méthodes de bio-informatique pour l&#39;analyse des chromatogrammes, alignement, curation et l&#39;interprétation des données de séquence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

VIH-1 de la pharmacorésistance a le potentiel de compromettre sérieusement l&#39;efficacité et l&#39;impact de la thérapie antirétrovirale (ART). Comme les programmes de traitement antirétroviral en Afrique sub-saharienne continuent à se développer, les personnes sous ARV doivent être étroitement surveillés pour l&#39;émergence de la résistance aux médicaments. La surveillance de la résistance aux médicaments transmis pour suivre la transmission de souches virales déjà résistantes à l&#39;ART est également critique. Malheureusement, les tests de résistance aux médicaments n&#39;est pas encore facilement accessibles en situation de ressources limitées, car le génotypage est coûteux et nécessite laboratoire sophistiqué et l&#39;infrastructure de gestion des données. Une méthode génotypique d&#39;accès ouvert de surveillance de la résistance aux médicaments de gérer des individus et évaluer la résistance aux médicaments transmis est décrite. La méthode utilise un logiciel libre et open source pour l&#39;interprétation des profils de résistance aux médicaments et la génération de rapports individuels des patients. Le protocole de génotypage a un taux d&#39;amplification supérieur à 95% pour les échantillons de plasma avec avcharge IRAL&gt; 1000 VIH-1 copies d&#39;ARN / ml. La sensibilité diminue de manière significative pour les charges virales &lt;copies 1000 ARN VIH-1 / ml. La méthode décrite ici a été validé contre une méthode de VIH-1 de la pharmacorésistance tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), la méthode de génotypage ViroSeq. Limites de la méthode décrite ici comprennent le fait qu&#39;il n&#39;est pas automatique et qu&#39;elle a également échoué pour amplifier la forme circulante recombinante CRF02_AG partir d&#39;un panneau de validation d&#39;échantillons, bien qu&#39;il amplifie les sous-types A et B d&#39;un même panneau.

La méthode validée est une modification d&#39;un procédé précédemment rapporté 20. Le procédé de génotypage ViroSeq, qui a été approuvé par la FDA, a été utilisé comme la méthode de référence dans la validation. Un panel d&#39;échantillons d&#39;essais d&#39;aptitude obtenues auprès des Agences nationales françaises pour la recherche sur le sida et les hépatites virales (ANRS) a été utilisé dans la comparaison primaire entre les deux méthodes. Les deux méthodes de génotypage ont été de 100% dans l&#39;identification concordante toutes les mutations associées à la résistance des médicaments cliniquement importants tel qu&#39;il est interprété par le programme HIVDB pour les échantillons qui ont été amplifiés avec succès par les deux méthodes. Comme le montre le tableau 6, les séquences nucléotidiques des trois paires sont identiques à 99,5%. Les séquences d&#39;acides aminés prédites sont identiques à 100%. Un échantillon de cinq n&#39;a pas pu être amplifié avec succès par ViroSeq. En plus de l&#39;échantillon non amplifié par ViroSeq, le procédé à l&#39;interne n&#39;a pas réussi à amplifier un second échantillon qui a été montréêtre un virus recombinant de circulation (CRF02_AG) par ViroSeq. Les trois échantillons qui ont amplifié avec les deux méthodes ont été sous-type B (deux échantillons) et le sous-type A (un échantillon). <img alt="Figure 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> Figure 5. Utilisation d&#39;un voisin de démarrage arbre HKY fait dans le cadre de l&#39;assurance qualité de la séquence. Il ya quatre paires / groupes de séquence avec les distances génétiques très courts. La distance génétique entre RES655 et RES655_1 (mêmes échantillons séquencés sur plusieurs jours) est de 0,003. L&#39;erreur est un potentiel de la paire de RES637_1/RES638 que leur distance génétique est trop courte (0,075) pour les échantillons provenant de différents individus non couplés sur le plan épidémiologique. Il existe une autre RES637 sur l&#39;arbre avec une distance de 0,075 par rapport à RES638_1. La grappe CQ01/CQ02 suggère que les deux échantillonsà partir du panneau sont des copies de la même échantillon. Ils se regroupent avec la séquence de référence sous-type B confirme le sous-type attribué par l&#39;outil REGA sous-typage. CQ05 CQ04 et regroupés avec les sous-types A et G, respectivement, alors que l&#39;outil REGA de sous-typage entre eux dans la catégorie A et CRF02_AG respectivement. Un autre outil utile pour le sous-typage et la recombinaison du VIH est SCUEL, qui est disponible à http://www.datamonkey.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> Un panel de cinq échantillons a été utilisée pour évaluer la précision de la méthode en interne. Dix génotypes réplicats ont été générées pour chacun des cinq échantillons. Utilisation de l&#39;analyseur génétique 16 capillaire 3130xl, 48 des 50 génotypes ont été générés à partir de 24 pistes, préparés le jour même. Pour tous les cinq échantillons, les séquences d&#39;acides aminés prédites sont de 100% concordant entre les répétitions. Pour les séquences d&#39;acide nucléique, eavant était&gt; 99% de similarité par paires. Au cours des deux premières années de l&#39;utilisation de ce procédé, soixante échantillons ont été répétés de manière aléatoire à partir de l&#39;extraction d&#39;ARN à un séquençage. Il n&#39;y avait pas de différences statistiquement significatives entre le score de qualité de la séquence et le nombre de bases mixtes entre les répétitions. Tant le nucléotidiques et d&#39;acides aminés pour des comparaisons par paire des soixante paires sont supérieure à 99% identique. Ainsi, les mutations de résistance aux médicaments pour toutes les paires concordantes sont de 100%. Réduction des coûts Les volumes de réaction de RT, la PCR et le séquençage ont été réduites d&#39;au moins la moitié, par rapport à la méthode d&#39;origine 20, 32, sans compromis sur la qualité des séquences générées. Cela a permis une réduction de coût de 50% pour les étapes de RT et de PCR. La nouvelle méthode a été initialement conçu pour fonctionner avec six amorce de séquençage de la séquence<html> les 99 codons du gène de la protéase et les 300 premiers codons du gène de la transcriptase inverse 20, 32. Des méthodes similaires utilisent également six à huit amorces 33, 34. Certaines méthodes récemment publiées ont utilisé moins de six amorces, même si parfois, le séquençage de la protéase et des gènes RT seprately 35, 36. Nous avons cherché à réduire le nombre d&#39;amorces de séquençage de six à quatre, (figure 6) <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> Figure 6. La comparaison des séquences contiguës à partir de six contre quatre amorces de séquençage pour la génération de la séquence de pol 1197 pb couvrant l&#39;ensemble des 99 codons du VIH-1 de la protéase et les 300 premiers codons du gène de la transcriptase inverse.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. Des séquences provenant d&#39;un ensemble de 17 échantillons générés à partir de six amorces ont été comparées à des séquences générées après exclusion des deux amorces (MAW46 et RTY). Les sous-types étaient 14 sous-type C, deux sous-type B, et un sous-type A. Il n&#39;y avait pas de différences significatives dans les scores de qualité de la séquence. Là encore, l&#39;identité par paires entre la moyenne des 17 paires d&#39;acides nucléiques est de 99% et de 100% au niveau des acides aminés. Ainsi, en réduisant les amorces de séquençage de six à quatre ont donné lieu à une réduction du coût de mise en séquence de presque un tiers. Le seul outil logiciel propriétaire utilisé dans ce protocole était Geneious pour l&#39;assemblage de la séquence. Les outils résistance aux médicaments d&#39;interprétation, ainsi que le rapport des outils génération sont tous des outils gratuits en libre accès. Cela réduit le coût en outre en éliminant les coûts associés à l&#39;utilisation d&#39;un logiciel propriétaire. En outre, collectivistee la négociation a permis aux réactifs de ce protocole à être emballés dans un kit pour faciliter l&#39;accès de Life Technologies et est disponible comme les Technologies Saturne / Vie méthode 37 génotypage. En outre, les membres peuvent accéder à Saturne réactifs à un prix réduit. Cadre clinique Le protocole décrit a été mis en œuvre dans le suivi et la surveillance de la résistance aux médicaments dans une communauté rurale du KwaZulu-Natal. Un total de 604 génotypes ont été générées à partir d&#39;échantillons cliniques entre Décembre 2010 et mai 2013 à un taux d&#39;amplification de 95% pour les échantillons ayant une charge virale&gt; 1000 copies d&#39;ARN / ml. Cette étude clinique VIH de la résistance aux médicaments a été approuvé par le Comité de recherche d&#39;éthique biomédicale de l&#39;Université de KwaZulu-Natal (réf. BF052/10) et le Comité de recherche en santé du ministère de KwaZulu-Natal de la Santé (réf. HRKM 176/10). Les rapports individuels des patients ont été générés et envoyés vers les cliniquespour la gestion des patients. Soixante-douze (72) génotypes ont été générées dans le cadre d&#39;une surveillance de transmis étude de la résistance aux médicaments, imbriqués dans une grande étude prospective de surveillance du VIH dans la population. Les échantillons primaires sont tout aiguille piqûre sang recueilli dans des microtubes EDTA. Au génotypage il y avait un taux de 79% 19 d&#39;amplification. Approbation éthique de la génotypage des échantillons de l&#39;étude de surveillance a été obtenue à partir de l&#39;Université du comité d&#39;éthique de la recherche biomédicale KwaZulu-Natal (réf. BE066107). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nom Primer </td><td> Séquence </td><td> Longueur </td><td> Direction </td><td> Position HXB2 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Avant </td><td> 2028-2050 </td><td> 1er tour PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Inverse </td><td> 3539-3509 </td><td> 1er tour PCR </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Avant </td><td> 2147-2166 </td><td> 2e cycle de PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Inverse </td><td> 3462-3441 </td><td> 2e cycle de PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Avant </td><td> 2486-2508 </td><td> Séquençage </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Inverse </td><td> 2630-2604 </td><td> Séquençage </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Avant </td><td> 2956-2994 </td><td> Séquençage </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Inverse </td><td> 3129-3101 </td><td> Séquençage </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Inverse </td><td> 2967-2946 </td><td> Séquençage </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Avant </td><td> 2251-2277 </td><td> Séquençage </td></tr></tbody></table> Tableau 1. La transcription inverse, une PCR, des amorces et des produits personnalisés de séquençage utilisées dans la génération d&#39;un fragment de 1197 pb de pol couvrant l&#39;ensemble des 99 codons du VIH-1 de la protéase et les 300 premiers codons du gène de la trascriptase inverse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. dNTP / mélange d&#39;amorces pour la réaction de transcription inverse. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Réactif </td><td> Volume (ml) / réaction </td><td> Concentration / réaction </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Exposant III de la transcriptase inverse (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Enzyme de mélange pour la réaction de transcription inverse. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Volume (ml) / réaction </td><td> Concentration finale / Réaction </td></tr><tr><td> Eau traitée au DEPC </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR Buffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Amorce Froward (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Amorce inverse (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq polymerase (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Master mix pour la PCR nichée. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Volume (ml) / réaction </td><td> Concentration / réaction </td></tr><tr><td> Eau traitée au DEPC </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Séquençage tampon (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye Terminator séquençage mélange </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Total </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 5. Master mix pour les réactions de séquençage. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> ViroSeq </td><td align="center" colspan="4"> Interieur </td><td rowspan="2"> NA% de similarité </td></tr><tr><td> ID échantillon </td><td> Sous </td><td> Le niveau de qualité </td><td> PR mutations </td><td> Mutations RT </td><td> Sous </td><td> Le niveau de qualité </td><td> mutations de relations publiques </td><td> RT mutations </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99,9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98,4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tableau 6. Résul comparatifts d&#39;une analyse parallèle entre la méthode de génotypage ViroSeq et la méthode en interne en utilisant un panel d&#39;échantillons fournis par l&#39;ANRS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

tests de résistance des médicaments pour le VIH-1 individus infectés échec d&#39;un traitement antirétroviral (ART) peut guider les futurs traitements et d&#39;améliorer les résultats du traitement. Optimisation des individus et des populations résultats pour la santé de la prévalence élevée du VIH, mais les pays à ressources limitées finira par exiger le génotypage de la résistance aux médicaments abordables et accessibles et méthodes d&#39;interprétation.

Une méthode de surveillance abordable VIH-1 pour la résistance aux médicaments à ressources limitées

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

an-affordable-hiv-1-drug-resistance-monitoring-method-for-resource

Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K vues.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  tests de résistance des médicaments pour le VIH-1 individus infectés échec d'un traitement antirétroviral (ART) peut guider les futurs traitements et d'améliorer les résultats du traitement. Optimisation des individus et des populations résultats pour la santé de la prévalence élevée du VIH, mais les pays à ressources limitées finira par exiger le génotypage de la résistance aux médicaments abordables et accessibles et méthodes d'interpréta...

Vidéo: An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Les techniques de traitement des yeux implantés avec une prothèse rétinienne pour localisée histopathologique Analyse: Partie 2 épirétinienne implants avec des bords de la rétine

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation thermogénique préadipocytes pour la transplantation dans dépôts de tissu adipeux

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implémentation de<em&gt; In Vitro</em&gt; Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Méthode tumeur Quantification bioluminescence-Basé pour Progression Surveillance de la tumeur et les effets de traitement dans les modèles de souris lymphome

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

Perfusion de canal pancréatique: une méthode efficace et sélective d’administration de médicaments et de virus

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimisé méthode LC-MS/MS pour l’analyse de haut débit d’échantillons cliniques de Ivacaftor, ses principaux métabolites et Lumacaftor dans les fluides biologiques des patients atteints de fibrose kystique

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...