Le soutien financier à VECT-HORUS est reconnu dans le Fonds Unique Interministériel (projet FUI / MEDUL) et à Vect-Horus et le laboratoire UMR7259 de l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, l&#39;ADHOC et des projets de collaboration PREVENTAD) . Le laboratoire UMR7259 reconnaît également le soutien financier du CNRS et de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille.

1. Production de Rat astrocytes Pour chaque préparation utiliser 10 rats Wistar néonatale de l&#39;autre sexe. <ol><li> Sacrifier les rats par des têtes de coupe avec une paire de ciseaux et de les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les transférer immédiatement dans une boîte de Pétri contenant un tampon de dissection froid: HBSS complété avec 1% de sérum-albumine bovine (niveau bas d&#39;endotoxine BSA), de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml. </li><li> Couper le cerveau en deux, pour séparer les deux hémisphères cérébraux et les transférer dans une boîte de Pétri propre avec un tampon de dissection sur la glace. Couper le nerf optique et retirez les méninges sous un stéréomicroscope. </li><li> Laver les morceaux corticales largement dans 50 ml de tampon de dissection froide. </li><li> Placez les morceaux corticales de 3 cerveaux dans un tube Falcon de 15 ml et dissocier par aspiration et refoulement d&#39;un couple de fois avec une pipette jetable de 10 ml équipé d&#39;une pointe bleue dans 6 ml de trypsine à 0,05% - EDTA 0,02% pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 24 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques suivants pénicilline, 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml, un milieu appelé milieu cellulaire gliale (MCG), et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Lots de FBS ont été sélectionnés et validés pour la croissance et la survie de cutures d&#39;astrocytes. </li><li> Reprendre le culot contenant les cellules dissociées dans 10 ml GCM et la plaque en 75 cm 2 T-ballon (T75). Changer le support le lendemain pour enlever les débris de cellules et de l&#39;ADN. Remplacez le support de culture deux fois par semaine. </li><li> Après 1 semaine de la prolifération, secouez doucement les cellules gliales avec un agitateur orbital à 60 rpm pendant 24 heures à 37 ° C dans GCM. Si le T75 ne peut pas être placé dans un incubateur avec 5% de CO 2/95% d&#39;air à 37 ° C atmosphère humidifiée, compléter les médias mM HEPES 5. Laver les cellules deux fois pour rEDéplacez les cellules microgliales non-adhérentes. </li><li> Trois semaines après le semis, laver les cellules deux fois avec DPBS sans calcium et magnésium. Ajouter 3 ml de trypsine chaud 0,05%-EDTA 0,02%, incuber à 37 ° C et attendre jusqu&#39;à ce que la couche de cellules est dispersée (généralement 5 min). Inhiber l&#39;activité de la trypsine en ajoutant 10 ml de GCM, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et Falcon à 120 g pendant 8 min. </li><li> Reprendre le culot des astrocytes dans 90% de FBS - 10% de DMSO, les transférer dans des cryotubes (2 x 10 6 cellules par tube cryogénique) et magasin dans l&#39;azote liquide. </li></ol> 2. Isolement des microvaisseaux du cerveau de rat Nos procédures expérimentales sont approuvés par le comité d&#39;éthique de la faculté de médecine de Marseille et sont conformes aux réglementations nationales et européennes (directive européenne n ° 86/609). Tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum la souffrance des animaux et de réduire le nombre d&#39;animaux utilisés. <ol><li> Pour chaque préparation et pour un experimenter, utiliser 3 vieilles cinq semaines des rats Wistar. </li><li> Lundi de la première semaine, de préparer deux flacons T75 par revêtement avec du collagène de type IV et de la fibronectine, à la fois à 1 pg / cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (10 ml par T75). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que microvaisseaux semis. </li><li> Mercredi matin de la première semaine, euthanasier les rats sous un flux croissant de CO 2 pour induire la somnolence, la perte de la posture et la respiration interruption, suivie d&#39;une dislocation cervicale. Vaporiser les têtes avec 70% d&#39;éthanol. Couper les têtes avec une paire de ciseaux et de les transférer dans une boîte de Pétri sec sous une hotte à flux laminaire. </li><li> Retirer le cerveau du crâne sans le cervelet et les nerfs optiques, puis de les transférer dans une boîte de Pétri refroidi sur de la glace et rempli avec du tampon de dissection froide (HBSS complété avec 1% de BSA, de la pénicilline à 100 unités / ml et streptomycine 100 pg / ml) . </li><li> Couper le cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux et le mésencéphale séparée de pourebrain. Transférer les forebrains dans une boîte de Petri propre sur la glace avec un tampon de dissection. </li><li> Prenez quelques hémisphères dans une nouvelle boîte de Pétri avec un tampon de dissection froide pour enlever soigneusement les méninges des forebrains sous un stéréomicroscope avec N ° 5 des pinces courbes. Ensuite, nettoyer l&#39;intérieur du cerveau pour enlever la couette de la myéline et obtenir une enveloppe de cortex. Ces mesures ne devraient pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire. </li><li> Dissocier le cortex du cerveau en 3 6 ml de tampon de dissection froide dans un 7 ml DOUNCE homogénéisation par 10 de haut en bas coups avec chacun des deux pilons de différents jeux, 71 pm suivie par 20 um. </li><li> Diviser la suspension pour obtenir l&#39;équivalent d&#39;une cortex dans 1 ml d&#39;un tube Falcon de 50 ml et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer la suspension de 1 cortex avec 1 ml d&#39;une solution enzymatique contenant un mélange de collagénase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), la DNase de type I (35 ug / ml - 20 K unités / ml) et de la gentamicine (50 pg / ml) dans un agitateur pendant 30 minutes à 37 ° C. </li><li> Mélanger le 1 ml de digérer 1 cortex avec 10 ml de 25% de BSA / HBSS 1X et séparé par centrifugation dépend de la densité à 3600 g pendant 15 min à température ambiante. Transférer délicatement le disque supérieur (la myéline et le parenchyme cérébral) et le surnageant dans un 50 ml tube Falcon propre et répéter la centrifugation. Gardez le culot obtenu contenant les microvaisseaux du cerveau à 4 ° C. </li><li> Prenez soin de le disque supérieur et le surnageant. Reprendre les culots résultants contenant les microvaisseaux du cerveau avec 1 ml de HBSS 1X froid et transférer dans un 50 ml tube Falcon propre. </li><li> Laver les microvaisseaux par addition de 20 ml de HBSS 1X froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. </li><li> Digérer en outre les microvaisseaux du cortex une avec 1 ml de la même solution enzymatique telle que décrite dans l&#39;étape 2.9 pendant 1 heure à 37 ° C dans un shAker. </li><li> Ensuite, mélanger les microvaisseaux digérés à partir de chacun des trois cortex dans un tube et en outre séparer en deux 50 ml tubes Falcon pour obtenir des microvaisseaux extraites à partir de l&#39;équivalent d&#39;une fois et demie (1,5) cortex par tube. Ajouter 30 ml de tampon de dissection froid et centrifuger à 1000 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot de microvaisseaux dans 10 ml de DMEM/F12 supplémenté avec 20% de plaquettes bovine plasma pauvre en sérum dérivé, fibroblastes facteur de croissance basique (bFGF, 2 ng / ml), de l&#39;héparine (100 ug / ml), de la gentamicine (50 pg / ml) et HEPES (2,5 mM), du nom de support de cellules endotheliales (ECM) supplémenté avec de la puromycine à 4 pg / ml. </li><li> Prendre les deux flacons T75 revêtues de l&#39;incubateur, aspirer l&#39;excès de revêtement et de la plaque les microvaisseaux de chaque tube dans un flacon T75 (des microvaisseaux extraits de cortex 1,5 par flacon T75). </li></ol> 3. Purification et la prolifération des RBEC Primocultures <ol><li> Purification: du mercredi au vendredi, ajouter puromycin à 4 pg / ml de milieu de culture. Changer le support le jeudi. Le vendredi, laver les cellules et ajouter puromycine à 2 pg / ml jusqu&#39;à lundi. </li><li> Prolifération: le lundi de la deuxième semaine, laver les cellules et ajouter de l&#39;insuline, de la transferrine et le supplément de sélénite de sodium pour les milieux de culture jusqu&#39;à ce que les cultures atteignent 90% de confluence le mercredi de la deuxième semaine. </li></ol> . 4 Différenciation: Mise en place du modèle in vitro du Bureau <ol><li> Lundi de la deuxième semaine, préparer filtres (polyéthylène, 12 puits, la taille des pores 1,0 um) par enrobage avec un mélange de collagène de type IV et de la fibronectine à la fois à 0.5μg/cm 2 dans l&#39;eau de culture stérile (500 pi de mélange dans le compartiment supérieur et 1,5 ml d&#39;eau stérile de culture dans le compartiment inférieur). Laisser adhérer à 37 ° C jusqu&#39;à ce que RBEC semis. </li><li> Lundi de la deuxième semaine, cinq jours avant la création de la co-culture, dégeler les astrocytes de cryotubes à 37 ° C et le transfertdans 15 ml Falcon avec 10 ml GCM. Centrifuger la suspension à 120 g pendant 8 min à température ambiante. </li><li> Reprendre le culot dans des astrocytes et GCM plaque à une densité de 30 x 10 3 cellules par cm 2 dans des plaques à 12 puits. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, juste avant la dissociation de RBEC avec de la trypsine, laver deux fois le filtre de pré-enduit avec du milieu DMEM/F12. Pré-remplir les chambres avec ECM: 1,5 ml dans le compartiment inférieur et 0,5 ml dans le compartiment supérieur. </li><li> Mercredi de la deuxième semaine, laver deux fois avec du DPBS RBEC sans calcium et magnésium. Ajouter 4 ml de trypsine 0,05% chaud - EDTA solution de 0,02% à 37 ° C par flacon T75 pendant 30 secondes exactement. Ensuite, retirer 3,5 ml de solution de trypsine et observer au microscope. Lorsque la couche de cellules commence à se détacher de la matrice, les aider à en tapotant doucement le bord du flacon T75 jusqu&#39;à ce que toutes les cellules sont flottantes. </li><li> Ajouter 9 ml d&#39;ECM par flacon T75 et transférer dans un tube Falcon de 15 ml. Très dissocier doucement la cellulesuspension par pipetage de haut en bas quatre fois avec une pipette de 10 ml, muni d&#39;un embout jaune (éviter la production de bulles dans la solution). Compter les cellules dans la suspension (environ 3 x 10 6 cells/T75) et de la plaque immédiatement sur ​​des filtres de pré-revêtues et pré-remplis à haute densité (160 x 10 3 cellules / filtre donc environ 18 filters/T75) (Figure 8 ). Le lendemain (jeudi), changer deux fois la moyenne du compartiment supérieur pour éliminer les débris cellulaires. </li><li> Jeudi de la deuxième semaine, la veille de la création de la co-culture, remplacer le milieu de culture des astrocytes par 1,5 ml de milieu de différenciation (ECM avec hydrocortisone à 500 nM) qui peuvent être complétés par des tiers milieu conditionné du compartiment basal d&#39;une précédente co-culture (3 jours de contact entre les cellules endothéliales et les astrocytes). </li><li> Vendredi de la deuxième semaine est défini comme le jour 0 de différenciation; remplacer le milieu de culture à partir de la conta filtresining la RBEC avec les médias de différenciation. Transférer les filtres de RBEC dans les puits contenant les astrocytes. Dans ces conditions, des modèles in vitro se différencient et expriment des protéines liées à jonction-dans les 3 jours. </li><li> Les modèles gardent leur différenciation optimale pendant 3 jours, entre le lundi et le mercredi de la troisième semaine. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

De nombreux médicaments développés pour traiter le système nerveux central (SNC) ne parviennent pas à le parenchyme cérébral à des concentrations thérapeutiques pertinentes. La BHE protège les tissus nerveux du cerveau à partir de la fluctuation de la composition du plasma, à partir d&#39;agents pathogènes, et maintient l&#39;homéostasie du parenchyme cérébral, en limitant le flux non spécifique des ions, des peptides, des protéines et même des cellules dans et hors du cerveau 1. Caractéristiques BBB sont induite et maintenue par la proximité intime et la diaphonie entre les classes spécialisées des cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux et des éléments voisins de l&#39;unité neuro-glie-vasculaire (NGVU) comme les neurones, les cellules gliales (plus précisément astrocytes fin-pieds), et péricytes ensheathed dans la membrane basale, qui se compose essentiellement de collagène de type IV, la fibronectine, la laminine et les protéoglycanes 2,3. Péricytes couvrent environ 22 - 32% de l&#39;endothélium au niveau des capillaires et jouent un rôle importantrôle dans la régulation de l&#39;endothélium prolifération, l&#39;angiogenèse et des processus inflammatoires. Les cellules endotheliales forment une nappe continue couvrant la surface interne des capillaires. Ils sont reliés entre eux par JT, qui forment une structure en forme de bande à la région apicale et qui contribuent à la cellule de polarisation. Les astrocytes régulent les propriétés et BBB sont des sources de facteurs de régulation importants tels que le TGF-β, du GDNF, du bFGF et de l&#39;IL-6. Astrocytes déficientes en GFAP avec des fonctionnalités incomplètes ne sont pas en mesure de réglementer BBB propriétés 4. Les neurones ne sont pas directement impliqués dans la formation de structure de la BHE, mais également des aspects importants de réguler l&#39;expression des protéines et les fonctions BBB 5. Afin d&#39;étudier davantage la structure, la physiologie et la pathologie du Bureau, des modèles in vitro du Bureau ont été développées comme outils de recherche. les cellules endothéliales de cerveau ont été extraits de diverses espèces de mettre en oeuvre dans les modèles in vitro basé BBBde faibles cultures primaires de passage de bovin 6,7, 8,9 porcine, rat 10,11,12, 13 souris et aussi humain 14,15. Ces modèles sont connus pour imiter le Bureau vivo dans, en particulier lorsqu&#39;ils sont co-cultivées avec des cellules gliales de rat ou de souris et / ou de péricytes, 16,12 et / ou des astrocytes dérivées de cellules progénitrices neurales 17 et / ou 18 neurones. Les modèles &quot;de laboratoire&quot; en sont souvent fabriqués à partir de rongeurs car ils permettent à des expériences in vitro et des comparaisons et / ou l&#39;étude des cellules endothéliales de cerveau produites à partir de modèles transgéniques / 19 in vivo. Nouvellement développé des modèles in vitro BBB ont également été conçus pour aider à prévoir cerveau absorption de médicaments potentiels SNC candidats avant le test in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Modèles in vitro BBB sont généralement utilisés pour comparer le transport de la drogue avec: i) la pénétration connu dans le SNC ou avec low perméabilité à travers la barrière hématoencéphalique et aucun des effets centraux, et ii) la Pe apparente des mêmes médicaments mesurées dans des modèles animaux de la même espèce. Les médicaments qui passent facilement la BBB sont principalement lipophiles et traversent les membranes des cellules endothéliales du cerveau par diffusion libre médiée par un lipide (caféine, la carbamazépine, etc.) Les médicaments transportés négativement tels que la digoxine, le vérapamil ou la cyclosporine A sont activement extrudées par endothéliales cérébrales transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp. Cependant, la plupart des molécules thérapeutiques nouvellement développés sont produits biopharmaceutiques, tels que les protéines recombinantes, siRNA ou des anticorps monoclonaux. La plupart d&#39;entre eux ne traversent pas la BBB en raison de: i) l&#39;absence de transporteurs spécifiques, et ii) la couche serrées des cellules endotheliales, qui empêchent les molécules de poids moléculaire élevé de subir passage paracellulaire. Avec ces limites, les stratégies &quot;Troie de cheval&quot; ont été mis en œuvre en utilisant des vecteurs (anticorps, peptides) contre les récepteurs connus au Bureau, impliqués in médiée par le récepteur du transport ou de transcytose (RMT), tels que la transferrine (Tf) récepteur (TfR), le récepteur de l&#39;insuline (IR), ou des membres du récepteur des LDL (LDLR), liés à la famille du récepteur (LDLR, LRP1). Ces récepteurs ont été trouvés sur isolés capillaires du cerveau et dans le Bureau in vivo 24,25. Les profils de transcription pour ces récepteurs, en particulier ceux de la famille LDLR, ont été analysés et comparés entre les cellules endothéliales cérébrales et cellules endothéliales cérébrales co-cultivées avec des astrocytes ou des capillaires du cerveau directement après leur extraction à partir de cerveau 26. Pardridge 24 a ouvert le champ avec l&#39;anticorps OX-26 contre le récepteur de la transferrine (TfR), suivis par des anticorps dirigés contre le récepteur de l&#39;insuline et le récepteur du facteur de croissance de type insuline 27,28. Avec ces vecteurs de base d&#39;anticorps, ArmaGen Technologies a développé un cheval de Troie moléculaire technologie de plate-forme de cheval du Bureau pour fournir des médicaments, y compris les protéines, à travers le Bureau 29. Lalittérature est riche en données montrant l&#39;expression de LRP1 dans des cellules endothéliales de cerveau et de son rôle en tant que récepteur d&#39;endocytose / scavenger puissant. L&#39;analyse Western blot a suggéré que LRP1 est exprimée en fractions enrichies dans des capillaires du cerveau et dans le cerveau de rat cellules endothéliales capillaires 30. Des sociétés telles que AngioChem cible LRP1 avec des vecteurs peptidiques dérivées de l&#39;aprotinine qui favorisent efficace afflux de drogues à travers le Bureau 31. Cependant, LRP1 est également impliquée dans le transport actif de Aß et son efflux / jeu de parenchyme cérébral à sang 32. Ces données impliquent LRP1 dans un transport bidirectionnel à travers le Bureau en fonction de ses ligands. biOasis développe la technologie de Transcend utilisant un mélanotransferrine de protéine pour le transport de produits biologiques tels que des enzymes lysosomales et des anticorps à travers la BHE 33 tandis que VECT-HORUS développe des vecteurs peptidiques qui ciblent le LDLR 34. Il données suggère que le PRL et LDLR peuvent être utilisés pour le transport de diffmolécules érents tels que les enzymes lysosomales 35,36 ou complexes de nanoparticules à travers la BHE 37. Notre champ d&#39;intérêt est l&#39;administration de médicaments pour le système nerveux central en utilisant des molécules de vecteur et de candidats-médicaments vectorisés pour le traitement des maladies du système nerveux central. En particulier, l&#39;administration de médicaments à travers la BHE doit être considérée dans le contexte de la neuro-inflammation, un processus qui peut varier dans son étendue, mais qui est probablement commun à toutes les lésions et les maladies du système nerveux central, y compris l&#39;encéphalite, la sclérose en plaques, la maladie d&#39;Alzheimer, etc Neuroinflammation est associée à l&#39;inflammation du Bureau et potentiellement à des changements dans la physiologie du Bureau et de la perméabilité paracellulaire et considérant que le transport transcellulaire peuvent être amplifiés dans des conditions pathologiques 38,39,40,41,42,43. Par exemple, le TNF-α, tordre, et d&#39;autres cytokines modulent l&#39;inflammation, et des expériences avec des modèles in vitro à BBB ont montré qu&#39;ils peuvent modifier les propriétés de paracellulaires ee monocouche de cellules endothéliales 38,39,40 et que le TNF-α conduit également à une augmentation du transport transcellulaire de LDL 41, holotransférrine 42 et 43 de la lactoferrine. Notre objectif était de développer et caractériser un optimisée et syngénique de rat hautement reproductible modèle du Bureau en utilisant des co-cultures de cellules primaires endothéliales cérébrales et les astrocytes. Nous avons utilisé cinq semaines vieux et néonatale rats Wistar pour la production de cellules endothéliale du cerveau et de la production des astrocytes respectivement. Un défi a été d&#39;établir un protocole permettant la production de modèles BBB &quot;hebdomadaire reproductibles». Pour atteindre cet objectif, chaque étape du protocole de production a été réalisée à des jours fixes de la semaine, à partir de la production cerveau des microvaisseaux le mercredi de la première semaine. Les dissections ont été réalisées presque chaque semaine au cours des 3 dernières années. Pour améliorer encore la reproductibilité des cultures, un système d&#39;assurance de la qualité a été créé. Tous Reagents et les produits chimiques ont été référencés dans une base de données (date d&#39;entrée, stock, la date d&#39;expiration, etc.) Le modèle a été caractérisée après un certain nombre de critères, tels que l&#39;organisation des cellules endothéliales et la pureté, TEER, LY perméabilité, la réponse aux agents pro-inflammatoires, l&#39;expression qualitative et quantitative des protéines TJ, la fonctionnalité des transporteurs d&#39;efflux telles que la P-gp, et les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endotheliales tels que le TfR ou le LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

La barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​régule spécifiquement flux moléculaire et cellulaire entre le sang et le tissu nerveux. Notre objectif était de développer et de caractériser un syngénique de rat hautement reproductible modèle in vitro de la BHE en utilisant des co-cultures de cellules endothéliales de cerveau de rat primaires (RBEC) et les astrocytes pour étudier les récepteurs impliqués dans la transcytose à travers la monocouche de cellules endothéliales. Les astrocytes ont été isolés par dissection mécanique après digestion de la trypsine et ont été gelés pour la co-culture plus tard. RBEC ont été isolés à partir de 5 semaines d&#39;âge cortex de rat. Les cerveaux ont été nettoyés des méninges et de la substance blanche, et dissociées mécaniquement après digestion enzymatique. Ensuite, l&#39;homogénat a été centrifugé dans les tissus de l&#39;albumine de sérum bovin pour séparer les fragments de vaisseaux à partir de tissu nerveux. Les fragments de navires ont subi une deuxième digestion enzymatique des cellules endothéliales libres de leur matrice extracellulaire. Les cellules contaminantes restantes telles que les pericytes ont été Futres éliminé par l&#39;étalement des fragments de microvaisseaux dans un milieu contenant la puromycine. Elles ont ensuite été soumises à des passages sur des filtres pour la co-culture avec des astrocytes cultivés sur le fond des puits. RBEC exprimé des niveaux élevés de jonctions serrées (TJ) des protéines telles que occludine, claudine-5 et ZO-1 avec une localisation typique aux frontières cellulaires. La résistance électrique transendothéliale (TEER) de cerveau monocouches endothéliales, indiquant l&#39;étanchéité du JT atteint 300 ohms · cm 2 en moyenne. Les coefficients de perméabilité endothéliale (Pe) pour le jaune lucifer (LY) était très reproductible avec une moyenne de 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. les cellules endothéliales de cerveau organisés en monocouches ont exprimé le transporteur d&#39;efflux P-glycoprotéine (P-gp), ont montré un transport polarisé de la rhodamine 123, un ligand de P-gp, et ont montré transport spécifique de la transferrine-Cy3 et DiILDL à travers la monocouche de cellules endothéliales. En conclusion, nous proposons un protocole pour la mise en place in vitroModèle du Bureau qui est hautement reproductible en raison des méthodes d&#39;assurance de la qualité, et qui est approprié pour la recherche sur les transporteurs et les récepteurs BBB.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d&#39;un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L&#39;expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l&#39;inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de Rat barrière hémato-encéphalique (BHE): un regard sur le Bureau imperméabilité et de transport médié par le récepteur

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K vues.  VECT-HORUS SAS.  Le but de la présente étude était de valider la reproductibilité d'un modèle in vitro du Bureau impliquant un rat syngénique de co-culture de cellules endotheliales et les astrocytes. La monocouche de cellules endothéliales présenté TEER haute et basse perméabilité LY. L'expression de protéines spécifiques TJ, les réponses fonctionnelles de l'inflammation et de la fonctionnalité des transporteurs et récepteurs ont été évalués. 

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Guidée par IRM rupture de la barrière hémato-encéphalique en utilisant transcrânienne d&#39;ultrasons focalisés dans un modèle de rat

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

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Médecine

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modèle Rat de rupture de la barrière hémato-encéphalique pour permettre ciblée Therapeutics neurovasculaire

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Étirer dans le cerveau cellules endothéliales microvasculaires (CEND) comme<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatisme modèle du cerveau de la barrière hémato-encéphalique

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Oxygène-glucose privation et réoxygénation comme un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischémie-reperfusion modèle pour étudier la dysfonction barrière hémato-encéphalique

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

A Rat carotidienne Balloon Modèle de lésion pour tester Therapeutics Rénovation Anti-vasculaires

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Essais in vitro pour évaluer la formation et la perturbation du vaisseau en forme de barrière de sang-cerveau

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Procédé amélioré pour la création d’un In Vitro barrière hémato - encéphalique modèle basé sur les cellules endothéliales du cerveau porcin

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...