Les auteurs tiennent à remercier Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., et Meagan O&#39;Brien, MD pour leur soutien et vos commentaires. Cette recherche a été financée par l&#39;Institut national des allergies et des maladies infectieuses et a terminé avec un financement du NIH accorde Ruth L. Kirschstein Distinctions pour services de recherche nationaux pour les bourses Predoctoral individuels (F31) pour la promotion de la diversité dans la recherche liés à la santé (AI089030) et RO1 (AI081848 ).

Déclaration d&#39;éthique: les échantillons de recherche sont obtenus et stockés pour la recherche avec le consentement des donateurs. Tous les échantillons doivent être codées ou rendues anonymes avant de les utiliser. Ce protocole suit les lignes directrices de notre comité d&#39;examen institutionnel. 1. Différenciation des droits de périphériques monocytes sanguins dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes. Remarque: couches leucocytaires humaines servent comme source de cellules du sang périphérique (CMSP) humaines et ont été obtenues à partir du Centre de New York Blood (New York, NY). Les donneurs de sang sont des volontaires sains. La procédure de 5 jours commence par le dépôt de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sur des fioles de culture tissulaire 35,36. Différences notables des protocoles publiés sont les suivants: <ol><li> Utiliser 225 cm 2 non pyrogènes des flacons de culture tissulaire en polystyrène avec un couvercle de filtre à adhérer un total de 2x10 8 PBMC par flacon de 10 cm au lieu de polystyrène plaque de culture tissulaires (58 cm 2) (étape 1). </li><li> Préparer des milieux avec 5% de sérum humain mis en commun (PHS, 30 ml) dans 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamine, 5 ml de tampon HEPES 1 M, et 1,4 ml de 50 mg / ml de gentamicine (5% PHS médias) suivie d&#39;une filtration à travers un filtre de 20 uM. Ajouter un total de 50 ml 5% PHS médias par 225 cm 2 flacon de culture tissulaire. </li><li> Laver les cellules adhèrent à trois reprises avec 25 ml frais RPMI-1640. Agiter vigoureusement pendant 5 secondes lors de chaque lavage et aspirer les cellules non adhérentes (étape 4). </li><li> Ajouter 190 ul de 400 UI / pl d&#39;IL-4 et de 380 ul de 100 UI / pl de GM-CSF par flacon (étape 3) au jour 0, 2, et 4. Jour 0 est défini comme les PBMC de jour sont d&#39;abord déposées dans l&#39;étape 1 (étape 8). </li><li> jour de récolte 5 moDCs à une concentration de 1x10 6 cellules / ml (étape 15). </li><li> Utilisez moDCs immédiatement dans leur état de repos. Étapes 17-22 sont jamais réalisées. Note: Les échantillons doivent être traités dès que possible après la collecte pour de meilleurs résultats. </li><li> moDCs aliquotes à une concentrationtion de 2x10 5 cellules / puits (200 pl / puits de la 1x10 6 cellules / ml) dans une plaque à 96 puits à fond rond (western blot, ELISA, FACS) ou sur un chamberslide poly-L-lysine traitée (microscopie) pour l&#39;expérimentation . Remarque: Il ya au moins quatre conditions: Complètement non stimulées (contrôle négatif), d&#39;apprêt, activation uniquement, et l&#39;amorçage suivie de l&#39;activation. Les conditions peuvent être élargis pour inclure des contrôles de diluant pour R848 et nigéricine si désiré. Si le dosage en aval est ICS, les doublons sont nécessaires pour contrôles isotypiques. </li></ol> . 2 Amorçage de la Inflammasome - Signal 1 <ol><li> Reconstituer R848 lyophilisé dans du DMSO, selon les instructions du fabricant. Diluer le stock de travail à température ambiante avec du RPMI-1640. </li><li> Ajouter R848 à une concentration finale de 10 uM dans les puits pour 18 h. Placer les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3 Activation du NLRP3 Inflammasome -. Signal2 <ol><li> Reconstituer nigéricine lyophilisé dans de l&#39;éthanol, conformément aux instructions du fabricant. Diluer le stock de travail à température ambiante avec du RPMI-1640 avant d&#39;ajouter des conditions appropriées. </li><li> Ajouter la nigéricine à la concentration finale de 20 uM et revenir à l&#39;étuve à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 6 heures. Aucune des étapes de lavage ont lieu entre l&#39;amorçage et lors de l&#39;activation. Remarque: La sécrétion d&#39;IL-1β est augmentée par la présence des ionophores calciques, la bréfeldine A, la monensine, le dinitrophénol ou le cyanure de carbonyle chlorophenylhydrazone 37, 38. Par conséquent, l&#39;addition de ces inhibiteurs de sécrétion ne sont pas recommandés lors de l&#39;analyse d&#39;amorçage ou d&#39;une activité inflammasome car il va modifier la sécrétion de l&#39;IL-1β. </li></ol> 4. L&#39;IL-1ß prélèvement des échantillons <ol><li> Centrifuger la plaque avec des cellules et des surnageants à 974 g pendant 3 min. </li><li> Sans perturber le culot cellulaire, aspirer le surnageant et transférer souseparate fond rond plaque afin de mesurer la sécrétion de cytokines à partir des surnageants. Remarque: Les surnageants peuvent être stockés temporairement à -20 ° C ou -80 ° C pour stockage à long terme. </li><li> Laver les culots cellulaires à trois reprises avec 200 ul de 1 x PBS à 974 x g pendant 3 min pour enlever toute l&#39;IL-1β extracellulaire à partir des échantillons cellulaires. Remarque: Lors du lavage des culots cellulaires à partir d&#39;une plaque de 96 puits, enlever le lavage par inversion rapide plaque dans un bac de collecte afin de ne pas perturber l&#39;échantillon. </li></ol> 5. Mesure IL-1ß De cellulaires et de surnageant échantillons <ol><li> Intracellulaire de cytokines coloration (ICS): Le protocole ICS est décrit ci-dessous 39, 40. Remarque: ne pas suspendre les cellules si le dosage en aval est la microscopie. Tous les lavages et les aspirations doivent être effectués sans perturber la couche de cellules / granulés (en fonction du dosage en aval). <ol><li> Ajouter 100 pi de 5% PHS médias dans les puits appropriés. Ajoutervolume approprié (environ 1 μl/2x10 5 de cellules, ou une pl / puits) de marquage fluorescent α-CD11c et α-CD14 (marqueurs phénotypiques; clone B-LY6 et MφP9, respectivement) ou de contrôle d&#39;isotype à des cellules pendant 10 min à RT dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver trois fois avec PBS 1x à 974 g pendant 3 min. </li><li> Fixer les cellules par addition de 100 pl de 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Pause Point: Laver avec 100 pi de PBS 1x à 974 g pendant 3 min et conserver à 4 ° CO / N en 1x PBS. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation de cellules pendant 30 min. Note: Le tampon de perméabilisation est composé de 1 x PBS avec 0,3% de Triton X-100, et de 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) pour la perméabilisation. Ne pas déranger les cellules adhérentes lorsqu&#39;un dosage en aval est la microscopie. </li><li> Ajouter le volume approprié (environ 62 ng antibody/2x10 5 cellules, environ 2,5 ou pl / puits) de α-IL-1β-FITC (clone 8516) ou isotype contrôle pour2 h dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois avec 200 ul de tampon de perméabilisation à 974 x g pendant 3 min dans le noir. </li><li> Facultatif: Teinture au DAPI, ajoutez milieu de montage, et placer délicatement la lamelle sur une lame de verre. Autoriser milieu de montage pour guérir O / N avant de capturer des images de microscopie. </li><li> Acquérir les données par FACS ou microscopie. Remarque: Comparer l&#39;isotype pour chaque condition de la coloration appropriée lors de l&#39;analyse par FACS ou microscopie. <ol><li> CAA: Acquérir un échantillon à la fois. Réglez le / porte SSC FSC sur les cellules vivantes, suivies par le fenêtrage CD11c + CD14 - cellules avant l&#39;analyse de la population MODC pro-IL-1β coloration. </li><li> Microscopie: Réglez le temps d&#39;exposition en utilisant l&#39;échantillon de coloration positive - R848 traité. Utilisez DAPI + pro-IL-1β et + DAPI + pro-IL-1β - pour déterminer le pourcentage de pro-IL-1β + moDCs exprimant. </li></ol></li></ol></li><li> Dakota du SudS-Page: Immunoblotting est effectué pour détecter pro-IL-1β. Remarque: La technique décrite ci-dessous combine technique standard d&#39;immuno-empreinte, le gel de polyacrylamide à gradient de 4-20%, et la détection de fluorescence ou de chimioluminescence 41, 42. <ol><li> Lyse des cellules directement dans 10 ul de tampon de lyse dénaturant (5 pi β-mercaptoethanol/950 de tampon d&#39;échantillon de Laemmli ul On dilue à 1:1 avec du tampon de lyse cellulaire). Transférer le lysat à 1,5 ml des tubes Eppendorf. </li><li> lysat de chaleur sur une plaque sèche pendant 10 min à 100 ° C. </li><li> Spin lysat à 20 800 xg sur une minicentrifuge pendant 1 min à concentrer le volume de liquide. Pause points: les échantillons peuvent être congelés à -20 ° C pour le stockage à court terme. </li><li> Charger le volume total sur le gel de polyacrylamide. Run 140 V à travers la zone de gel pendant environ 1 heure, ou jusqu&#39;à ce que le front de colorant de glisser sur le fond du gel. </li><li> Transférer la protéine dans le gel de polyacrylamide sur un membr PVDF Immobilon-FLane pendant 90 min à 100 V. Bloquer la membrane avec 5% de BSA dans de la solution saline tamponnée au Tris / 0,1% Tween-20 (TBS-T) pendant 1 heure. Remarque: PVDF Immobilon-FL est meilleur pour une utilisation avec détection par fluorescence. Une membrane avec une composition différente est recommandée pour les autres techniques de détection pour augmenter le rapport signal sur fond. </li><li> Diluer les anticorps primaires et secondaires dans 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Effectuer les incubations d&#39;anticorps primaires à 4 ° CO / N tout en agitant et anticorps secondaire à la température ambiante pendant 1 heure en agitant. </li><li> Laver la membrane trois fois avec du TBS-T pendant 5 min, tout en agitant entre les incubations d&#39;anticorps primaires et secondaires et de nouveau entre les incubations secondaires et d&#39;imagerie. Note: Les bandes peuvent être détectés en utilisant fluorescent ou la détection de chimioluminescence. Suivez les instructions du fabricant pour la détection. </li></ol></li><li> ELISA: Les échantillons sont congelés pour le stockage doivent s&#39;équilibrer à la température ambiante avant l&#39;analyse. Isoler des échantillons dans une centrifugeuse pour consolider condenseur surnageantation. Suivez les instructions du fabricant pour la mesure de l&#39;IL-1β. Remarque: Dans ce protocole d&#39;IL-1β est spécifiquement mesurée; Toutefois, la mesure simultanée de TNFa, IL-6, et l&#39;immunomodulateur cytokine IL-10 assurer des conditions appropriées ont été amorcées. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Cytokines inflammatoires font partie intégrante de pilotage de la réponse immunitaire innée et adaptative pour combattre l&#39;infection virale. IL-1β sécrétée a été démontré que l&#39;augmentation lors de l&#39;infection d&#39;influenza 3, 43, 44. Les mécanismes précis par lequel ces cytokines sont traitées en réponse à la reconnaissance du virus dans les cellules dendritiques humaines sont pas entièrement comprises. Kits d&#39;isolement DC myéloïdes sont coûteux et fastidieux. kits d&#39...

Activation du système immunitaire inné est nécessaire pour orienter les réponses immunitaires adaptatives cours de l&#39;infection, la maladie et la vaccination 7. Les cellules dendritiques sont le plus puissant antigène présentant des cellules du système immunitaire inné; ils sont spécialisés pour l&#39;absorption des antigènes, la migration vers les ganglions lymphatiques, et l&#39;activation des naïfs CD4 + et CD8 + cytolytiques des cellules T 8-10. Pour activer la détection rapide des agents pathogènes du système immunitaire inné utilise de nombreuses lignées germinales codé reconnaissance de formes récepteurs (PRR) qui reconnaissent pathogènes conservé motifs dérivés ou des marqueurs d&#39;accueil dérivé de stress cellulaire et les dommages. Toll récepteurs (TLR) sont liés à la membrane reconnaissance de formes récepteurs qui reconnaissent certains pathogène phagocyté extracellulaire des motifs associés moléculaires (PAMP) et danger motifs moléculaires associés (atténue). En revanche clin d&#39;œil comme récepteurs (NLR) sont cytosolique et de répondre à un large éventail de PAMP et Damps. Nod comme récepteurs représenter une deuxième ligne de défense contre les agents pathogènes qui échappent surface de la cellule et PRR d&#39;endocytose. L&#39;interaction de l&#39;agent pathogène dérivé, ou «danger» associée, facteurs avec TLR et NLR ligands conduit à un état ​​de maturation des DC entraînant une augmentation de l&#39;interaction DC avec d&#39;autres cellules immunitaires et la promotion des cellules T et l&#39;activation naturelle des cellules tueuses 11. L&#39;interleukine-1β est un élément essentiel de la défense de l&#39;hôte contre l&#39;infection. Dès la reconnaissance d&#39;un micro-organisme, la cytokine hautement pro-inflammatoire, l&#39;IL-1β, est sécrétée et fonctionne comme un appât de chimio et activateur des cellules immunitaires innées et adaptatives. In vivo d&#39;IL-1β est en grande partie responsable de la réponse de phase aiguë, y compris la fièvre et de cytokines inflammatoires synthèse 12. La plupart des NLR contiennent un domaine de répétition riche en C terminal de la leucine qui est pensé à fonctionner dans le ligand de détection, un domaine de liaison de nucleotide central (NACHT) qui est important pour NLRP3 oligomérisation, et un domaine effecteur borne N (PYD dans NLRP3) qui médie la transduction du signal de cibles en aval à travers des interactions de protéines de protéines. La protéine NLRP3 définit complexe inflammasome le plus intensément étudié. Cette protéine est un membre de la famille NLR et a la capacité de former un complexe moléculaire de la protéine composée de plusieurs NLRP3, PYCARD la protéine adaptatrice (également connu sous le nom ASC) et ICE. Lors de l&#39;activation inflammasome PYCARD lie à NLRP3 domaines N terminaux et recrute ICE via l&#39;activation des caspases et le domaine de recrutement (carte) domaines. L&#39;interleukine-1 &#39;enzyme de conversion est d&#39;abord généré en tant que zymogène contenant un motif CARD à son extrémité N-terminale. Les résultats de la formation inflammasome dans la mise deux molécules ICE suffisamment proche pour induire leur activation autocatalytique. Le complexe de l&#39;inflammasome est nécessaire pour activer ICE lui permettant ainsi de convertir la pro-IL-1β cytoplasmique de mûrir cytokine. Le succès de la sécrétion d&#39;IL-1β dans les PED nécessite la détection de deux signaux de danger différentes et indépendantes. Tout d&#39;abord, la détection de TLR PAMP, amortit, ou la signalisation des cytokines (TNFa ou l&#39;IL-1β) provoque une régulation positive de l&#39;expression de protéines pro-IL-1β cytoplasmique. Un second souvent différente, signal, est nécessaire pour la formation du complexe inflammasome amont de la CIE maturation. Un peu inflammasome stimulant signaux comprennent des toxines bactériennes des pores de la membrane formant (comme nigéricine), lysosomales perturber cristaux (tels que des cristaux d&#39;urate monosodique, MSU), et l&#39;ATP extracellulaire. Le mécanisme en amont menant à NLRP3 activation inflammasome par ces divers activateurs n&#39;est pas claire. Les études portant sur ​​la signalisation en amont de la formation inflammasome propose que les événements intracellulaires, comme l&#39;induction d&#39;une hypokaliémie ou d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) activent indirectement l&#39;inflammasome 13-28. Parmi les différents activateurs viraux de l&#39;inflammasome NLRP3 est la grippe, qui fournit des bOTH le signal primaire et secondaire nécessaire pour la sécrétion d&#39;IL-1β 3, 29-33. En utilisant des modèles NLRP3 huitièmes de finale de la souris, il a été constaté que l&#39;IL-1β la sécrétion dans les PED est NLRP3 dépendante 32. En outre, les souris knock-out NLRP3 attiré moins de leucocytes vers le site de l&#39;infection et ont connu une mortalité plus élevée 2, 5. Deux articles récents suggèrent un mécanisme pour l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 cours de l&#39;infection par le virus de la grippe; en premier lieu, par la reconnaissance d&#39;amorce d&#39;ARN viral par TLR7 ou TLR8 (en fonction de l&#39;expression de TLR de la cellule de répondre) ou par détection de bactéries commensales par d&#39;autres TLR pour induire l&#39;expression pro-IL-1β cytoplasmique, suivi d&#39;un second signal, l&#39;activation de NLRP3 formation inflammasome par la protéine virale de canal ionique M2 sur le réseau trans de Golgi 33, 34. Dans la dernière étape, le déclenchement de l&#39;inflammasome NLRP3 est accompli par les perturbations de l&#39;ionique intracellulaire &lt;em&gt; milieu conduisant à la production de ROS, qui est, tout simplement, détectée par NLPR3 comme un signal pour former l&#39;inflammasome. Cependant, le mécanisme précis de l&#39;inflammasome amont de l&#39;activation de l&#39;activité ICE lors de l&#39;infection grippale demeure encore incertain. Ce travail décrit une technique précieuse pour l&#39;étude de l&#39;inflammasome NLRP3 dans moDCs humaines qui peut être utilisé comme une base pour une enquête plus approfondie de la voie sous-jacent DC sur la base d&#39;IL-1β sécrétion en réponse à TLR8 ligature avec R848 suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome par un puits activateur connu de NLRP3, nigéricine. Des variantes de ce procédé peuvent être utilisés avec d&#39;autres types de cellules, y compris, mais sans s&#39;y limiter: les monocytes, les macrophages, les autres sous-ensembles à courant continu, et les cellules épithéliales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Les processus inflammatoires résultant de la sécrétion de l&#39;interleukine (IL) -1 cytokines de la famille par les cellules immunitaires conduisent à l&#39;inflammation locale ou systémique, le remodelage et la réparation tissulaire, et le contrôle virologique 1, 2. L&#39;interleukine-1β est un élément essentiel de la réponse immunitaire innée et contribue à éliminer les pathogènes envahisseurs, tout en empêchant l&#39;établissement d&#39;une infection persistante 5.1. Inflammasomes sont la plate-forme de signalisation clé pour l&#39;activation de l&#39;enzyme de conversion de l&#39;interleukine 1 (ICE ou la caspase-1). L&#39;inflammasome NLRP3 nécessite au moins deux signaux dans les PED pour provoquer l&#39;IL-1β sécrétion 6. Pro-IL-1β expression de la protéine est limitée dans les cellules au repos; par conséquent, un signal d&#39;amorçage est nécessaire pour l&#39;IL-1β transcription et l&#39;expression de la protéine. Un second signal détecté par les résultats NLRP3 dans la formation de la protéine multi-NLRP3 inflammasome. La capacité des cellules dendritiques à responsabilitéd pour les signaux nécessaires pour l&#39;IL-1β sécrétion peut être testée en utilisant une purine synthétique, R848, qui est détecté par TLR8 dans monocyte humain dérivé des cellules dendritiques (moDCs) aux cellules de premier, suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 avec la toxine bactérienne et ionophore de potassium, la nigéricine. Monocytes PED dérivés sont facilement produites dans la culture et fournissent beaucoup plus de cellules que des DC myéloïdes humaines purifiées. La méthode présentée ici se distingue d&#39;autres dosages de inflammasome en ce qu &#39;il utilise en humaine in vitro, à la place de la souris dérivée, DCs permettant ainsi l&#39;étude de l&#39;inflammasome dans la maladie humaine et l&#39;infection.

Ces techniques mesurent TLR8 amorçage avec R848. Coloration des cytokines intracellulaires pour la pro-IL-1β permet de microscopie et AAAF lectures du CD14 - CD11c + moDCs. Les deux techniques peuvent être quantifiés par rapport à une non apprêté, ou de repos, de contrôle de cellules ainsi que d&#39;un contrôle isotypique (figures 1 et 2). Pour cent des cellules pro-IL-1β + coloration est multiplié par la moyenne géométrique de cette population de fournir l&...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l&#39;IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l&#39;activation de l&#39;inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l&#39;IL-1β peut être utilisé pour mesurer l&#39;activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l&#39;activation par l&#39;IL-1β expression.

Activation et évaluation de NLRP3 Inflammasome activité de l&#39;IL-1β Utilisation dans des cellules dendritiques humaines dérivées de monocytes

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K vues.  New York University School of Medicine.  Les cellules dendritiques (DCs) sécrètent de l'IL-1β en réponse à la reconnaissance de la purine TLR8 synthétique, R848, suivie de l'activation de l'inflammasome NLRP3 avec nigéricine, par conséquent, l'IL-1β peut être utilisé pour mesurer l'activité de inflammasome NLRP3. Coloration des cytokines intracellulaires, immuno, et ELISA sont utilisés pour mesurer avec précision NLRP3 inflammasome amorçage et l'activation par l'IL-1β...

Vidéo: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

La mesure de l&#39;activité du facteur V dans le plasma humain en utilisant un test de coagulation microplaques

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Recherche

Immunologie et infection

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantification de l'activité chimiotactique monocyte in Vivo et caractérisation des macrophages dérivés du monocyte sanguin

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells SiRNA Electroporation to Modulate Autophagie in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisation de la proximité induite par les caspases inflammatoires dans les macrophages dérivés des monocytes humains

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...