Les auteurs tiennent à remercier le Dr Yangyang Yan dans le laboratoire du Dr Fred Sigworth à l&#39;Université de Yale pour le généreux don de cellules HEK293 exprimant de façon stable la protéine rat Slack-B. En outre, les auteurs tiennent à remercier le Dr Sigworth pour cryo-microscopie électronique modèle d&#39;homologie de Slack affiché dans la vidéo d&#39;introduction. Cette recherche a été financée par le NIH subventions DH067517 et NS073943 à LKK

Une. Culture cellulaire (Adapté de Fleming et Kaczmarek 18) <ol><li> cellules de la culture dans les médias appropriés pour plus de 2 mais moins de 10 passages avant de l&#39;utiliser dans cet essai. Non transfectées cellules HEK-293 et ​​des cellules HEK-293 exprimant de manière stable rat protéine Slack-B sont cultivés dans du milieu d&#39;une moitié de Dulbecco Modified Eagle et une moitié milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau foetal et des antibiotiques. 500 pg / ml de généticine (G418) est ajouté à des cellules HEK-293 exprimant de manière stable Slack-B pour sélectionner pour l&#39;expression du canal Slack. cellules Passage à 70-90% de confluence par dissociation des plats avec une solution de trypsine-EDTA 0,25%. </li></ol> 2. La matrice extracellulaire (ECM) Revêtement du TiO 2 384 puits biocapteur optique Plaque avec la fibronectine et l&#39;ovalbumine <ol><li> Préparation du mélange d&#39;ECM et la fibronectine solution de blocage de l&#39;ovalbumine <ol><li> Préparer une solution de travail de fibronectdans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 5 pg / ml de fibronectine dans 20,0 ml de PBS. De 1,0 mg / ml concentration de bouillon, ajouter 100 pi à 20,0 ml de PBS pour une dilution de 200 fois. La solution de travail de la fibronectine peut être aliquote et stocké à -20 ° C après la préparation. </li><li> Préparer une solution mère de 5% d&#39;ovalbumine inactivé par la chaleur de l&#39;eau stérile. Diluer l&#39;ovalbumine dans l&#39;eau de qualité pour culture tissulaire stérile pour une solution à 5% et à la chaleur pour inactiver les 30 min à 60 ° C. Refroidir la solution à la température ambiante et filtre stérile de la solution. Aliquoter la solution d&#39;ovalbumine à 5% et conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer une solution de travail de 2% d&#39;ovalbumine par dilution de la solution mère de 5% dans du PBS. Par exemple, ajouter 12,0 ml de solution d&#39;ovalbumine du stock de 5% à 18,0 ml de PBS pour un volume final de 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384 puits couche de plaque de biocapteur optique <ol><li> Hydrater la plaque TiO 2 avec 20,0 ul / puitsde l&#39;eau stérile de qualité pour culture de tissus pendant 15 min. Les étapes suivantes doivent être effectuées avec une pipette 16 canaux. </li><li> Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits. </li><li> Ajouter 20,0 ul de la solution de travail de la fibronectine à chaque puits et incuber pendant 2 heures à la température ambiante pour créer l&#39;ECM. </li><li> Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits. </li><li> Ajouter 40,0 ul de la solution de travail de l&#39;ovalbumine à chaque puits et incuber pendant une nuit à 4 ° C pour bloquer la plaque. </li><li> Laver la plaque 3x avec 50,0 ul de PBS par puits. des plaques revêtues d&#39;ECM peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 48 heures. </li></ol></li></ol> 3. Ensemencement des cellules sur la 384 et la plaque de biocapteur optique <ol><li> Retirer les milieux de croissance des cellules et ajouter de la trypsine pour détacher les cellules de la plaque. Recueillir les cellules et centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Retirez le support de la trypsine et remettre les cellules dans un milieu de croissance. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un hémocytomètre ou un système automatisécompteur de cellules, déterminer la concentration des cellules. </li><li> Afin de minimiser les effets de l&#39;évaporation au cours de l&#39;incubation, 50,0 ul de milieu de croissance par puits sera utilisé. Les cellules doivent être dilués pour obtenir le nombre désiré de cellules par puits dans un volume de 50,0 pi de milieu de croissance. Pour ces expériences, 1000 cellules / puits ont été étalés sur le biocapteur. </li><li> Laisser les cellules ensemencées à incuber pendant une nuit dans du milieu de croissance à 37 ° C sous air / 5% CO 2. </li></ol> 4. Préparation des biocapteurs et de composés Plaques pour le dosage GTR optique biocapteur <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et éliminer le milieu de croissance des cellules. Laver les cellules 1x avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Ajouter 25,0 ul de HBSS à chaque puits. </li><li> Placer la plaque de biocapteur du scanneur BIND et laisser les cellules s&#39;équilibrer à la température ambiante pendant 1-2 heures. </li><li> Préparer une plaque de composé séparé de ligands d&#39;intérêt qui seront annonceded à la plaque de biocapteur pendant le dosage. Pour ces dosages, 25,0 ul de solution contenant le composé a été ajouté à chaque puits sur la plaque de biocapteur pour un volume total de 50,0 ul. En tant que tels, les composés en solution ont été préparés dans le 2x concentration finale souhaitée. </li></ol> 5. Effectuez le test GTR optique biocapteur <ol><li> Prendre une mesure de référence avec le système de scanner pour les puits A1-P12 (la moitié de la plaque 384 puits SBS) avec une résolution maximale de 3,75 um / pixel pour la centrale de 1,5 mm de chaque puits en utilisant le logiciel BIND Scan. Cette analyse de base dure environ 30 min. </li><li> Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits pour les puits A1-P12. </li><li> Prendre une mesure de base de puits A13-P24. </li><li> Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits dans les puits A13-P24. </li><li> Prenez une mesure de l&#39;addition post composé de puits A1-P12, et répéter pour les puits A13-P24. </li></ol> 6. Analyse des données de dosage avec BIND Voir <ol><li> Ouvrez les données d&#39;analyse de BIND pour la mesure de référence dans Windows, et cliquez sur le bouton &quot;Grid Editor&quot; pour permettre la sélection de cellules. Le logiciel calcule les paramètres d&#39;intérêt définis par l&#39;utilisateur. </li><li> Ouvrez les &quot;plug-ins&quot;, qui comprennent le &quot;Finder portable&quot; et la fonction &quot;Baseliner&quot;. Définissez les paramètres dans &quot;Finder portable&quot; pour que les cellules se distinguent de l&#39;arrière-plan du biocapteur. </li><li> Exportez le fichier de la carte de la cellule qui contient les données &quot;portable Finder&quot; pour la mesure de référence. </li><li> Répétez les étapes 6.1 à 6.2 pour les données poste d&#39;addition de composé. </li><li> Ouvrez le &quot;Baseliner&quot; plug-in et importer la carte de la cellule à partir de la mesure de référence. Le logiciel calcule le décalage dans la VOP entre les données de base et post composés. </li><li> Sélectionnez &quot;Δ cellulaire moyen&quot; pour la sortie du décalage moyen dans la VOP pour les cellules. Les données peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse ultérieure. </li></ol>

<ol>
	<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ion Channels of Excitable Membranes. , (1992).</li><li>Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conducting+functions+of+voltage-gated+ion+channels.">Non-conducting functions of voltage-gated ion channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).</li><li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels.">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li><li>Shamah, S. M., Cunningham, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell-based+assays+using+photonic+crystal+optical+biosensors.">Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors.</a> Analyst. 136, 1090-1102 (2011).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. M. i. c. r. o. p. l. a. t. e. -. b. a. s. e. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=label-free+detection+of+biomolecular+interactions:+applications+in+proteomics.">label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics.</a> Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).</li><li>Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+waveguide+grating+biosensor+for+living+cell+sensing.">Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing.</a> Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).</li><li>Cunningham, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+assays+on+the+BIND+system.">Label-free assays on the BIND system.</a> J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).</li><li>Hessel, A. a. O., A, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Theory+of+Wood's+Anomalies+on+Optical+Gratings.">A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings.</a> Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).</li><li>Cunningham, B. T., Laing, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+application+of+label-free+detection+assays+in+drug+screening.">Advantages and application of label-free detection assays in drug screening.</a> Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).</li><li>Lee, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+optical+biosensor:+a+tool+for+G+protein-coupled+receptors+pharmacology+profiling+and+inverse+agonists+identification.">Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).</li><li>Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=For+K++channels,+Na++is+the+new+Ca2.">For K+ channels, Na+ is the new Ca2.</a> Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).</li><li>Santi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+regulation+of+Slick+and+Slack+K++channels+by+neuromodulators.">Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators.</a> J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).</li><li>Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slack+and+Slick+K(Na)+channels+regulate+the+accuracy+of+timing+of+auditory+neurons.">Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons.</a> J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah est un employé de X-CORPS Biosciences.

Le premier de Z (Z &#39;) de facteur est une méthode statistique commun pour quantifier la qualité d&#39;un dépistage dosage à haut débit 20, et parce que le dépistage des agonistes de RCPG dans cet essai a eu lieu dans un essai de 384 puits compatible SBS, fournit une excellente mesure de la robustesse et de la validité de ce test 21. AZ &quot;valeur 1 indique une analyse théoriquement idéale avec un nombre infini de points de données avec des écarts types inexistants. AZ &quot;valeur c...

D&#39;examen des cellules vivantes dans leur contexte physiologiquement pertinent est essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des cibles cellulaires. Cependant, des dosages examinant l&#39;interaction entre les canaux et les protéines cytoplasmiques de régulation, tels que des essais de co-immunoprécipitation, fournissent généralement peu d&#39;informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. La majorité des essais à base de cellules en cours de mesurer un événement cellulaire spécifique, tel que la translocation d&#39;une protéine d&#39;intérêt marqué de manière fluorescente. Ces tests nécessitent des modifications des protéines d&#39;intérêt, qui peuvent potentiellement altérer le comportement de la protéine et de diminuer la pertinence physiologique de la cible. Des dosages à base de cellules non invasive, qui ne nécessitent pas la manipulation du système, fournissent une mesure en continu de l&#39;activité cellulaire et permettant l&#39;étude des cellules dans leur état ​​le plus physiologiquement pertinent 4. Des biocapteurs optiques sont conçues pour produireun changement mesurable dans une caractéristique de la lumière qui est couplée à la surface du capteur. Biocapteurs optiques qui utilisent des ondes évanescentes, qui comprennent la résonance de plasmon de surface (SPR) et de la longueur d&#39;onde de résonance de réseau (GTR) techniques, ont été principalement utilisés pour détecter les affinités et la cinétique des molécules se liant à leurs récepteurs biologiques immobilisés sur la surface du capteur. Plus récemment, disponibles dans le commerce biocapteurs GTR ont été développés pour permettre la détection de la variation relative de masse à l&#39;intérieur de la partie de fond de cellules adhérentes à la surface du capteur à haute résolution spatiale (jusqu&#39;à 3,75 um / pixel) 5. Ces biocapteurs peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique de cellules vivantes qui résultent de la stimulation, telles que l&#39;adhérence cellulaire et d&#39;étalement, de la toxicité, de la prolifération et de voies de signalisation induites par une variété de récepteurs de surface cellulaire, y compris des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 6 . Biocapteurs GTR détecter le chan rapportge dans l&#39;indice de réfraction en fonction de la variation relative de masse à l&#39;intérieur de 150 nm du biocapteur 7. Lorsque les cellules sont étalées au biocapteur, cette variation de l&#39;indice de réfraction reflète la variation de la masse à proximité de la membrane plasmique de la cellule résultant d&#39;un changement dans l&#39;adhésion cellulaire au biocapteur. Ce protocole va discuter de la détection des interactions protéine-canal à l&#39;aide de biocapteurs GTR. GTR systèmes d&#39;acquisition de données sont constituées de plusieurs composants. Parce que le X-CORPS Biosciences BIND scanner a été utilisé pour ces expériences, nous désignerons les composants de ce système particulier, qui se compose d&#39;un lecteur de plaque, les biocapteurs associés, logiciel d&#39;acquisition BIND de numérisation, et le logiciel BIND Voir d&#39;analyse 8. Les biocapteurs à cristaux photoniques, appelées ci-après en tant que biocapteurs optiques, sont constitués d&#39;un agencement périodique d&#39;un matériau diélectrique et en deux ou trois dimensions qui empêchent la propagation de la lumière au spécifiquelongueurs d&#39;onde et les directions. Des structures à cristaux photoniques sont basés sur un phénomène appelé anomalie de Wood. D&#39;abord découvert par Wood en 1902, ces anomalies sont les effets observés dans le spectre de la lumière réfléchie par des réseaux de diffraction optiques où les variations rapides de l&#39;intensité de certains ordres de diffraction se produisent dans certaines bandes de fréquences étroites. En 1962, Hessel et Oliner présenté une nouvelle théorie des anomalies de bois dans laquelle période finie réseau génère une longueur d&#39;onde de résonance permanente 9. Dans les biocapteurs optiques décrits ici, les anomalies de bois sont utilisés pour produire un biocapteur GTR que lorsqu&#39;elles sont stimulées par la lumière blanche ne reflète que très étroite bande de longueurs d&#39;onde (typiquement entre 850 à 855 nm). Biocapteurs individuels se composent d&#39;une matière plastique à faible indice de réfraction avec une structure de surface périodique qui est revêtue d&#39;une mince couche de matériau diélectrique de dioxyde de titane de réfraction élevé (TiO 2). Lorsque les Biosensou est éclairée par une large source de lumière de longueur d&#39;onde, le réseau optique de cristaux photoniques reflète une gamme étroite de longueurs d&#39;onde de la lumière qui est mesurée par un spectrophotomètre dans le scanner de BIND. L&#39;intensité maximale des longueurs d&#39;onde réfléchies (Longueur d&#39;onde crête valeur, ou VOP) est alors calculée à partir du signal. Le VOP de déplacements lumineux lors d&#39;un changement de l&#39;indice de réfraction à la suite d&#39;une augmentation ou une diminution de la masse à l&#39;intérieur de la proximité (~ 150 nm) de la surface du biocapteur. Des biocapteurs optiques sont intégrés dans une société de la norme des sciences biomoléculaires (SBS) de 384 puits de microplaques pour les analyses utilisées dans ces expériences. biocapteurs RWV sont utilisés pour détecter des changements lors de l&#39;addition des signaux exogènes dans des cellules vivantes 10. Les cellules sont cultivées directement sur la surface d&#39;un biocapteur GTR et la variation de l&#39;indice de réfraction locale est surveillée lors du traitement avec des stimuli spécifiques. Le sens de variation de la masse au biocapteur peut êtredéterminé, car une augmentation de l&#39;indice local de réfraction à partir de résultats d&#39;une augmentation de la masse près du biocapteur et est mesurée par une augmentation de la VOP. Inversement, une diminution de la masse entraîne une diminution de la VOP. Le changement dans la VOP détecté peut résulter de nombreux événements cellulaires, y compris les changements dans l&#39;adhésion cellulaire, la protéine de recrutement / release, endocytose et exocytose, le recyclage, l&#39;apoptose, et du cytosquelette réarrangement. Par exemple, le dosage peut être détecter les changements dans les interactions protéine-canal entre les canaux potassiques et d&#39;autres composants cytoplasmiques ou du cytosquelette. L&#39;état de cause, cependant, doit avoir lieu dans la zone de détection ~ 150 nm proche du biocapteur, et dans le cas d&#39;une cellule attachée, à proximité de la membrane plasmique. Acquisition de réponses cellulaires est effectuée avec le logiciel d&#39;analyse BIND et une représentation d&#39;image de chacun des 384 puits de la plaque SBS est généré. Ce système a une résolution de jusqu&#39;à 3,75 um / pixel, ce qui permet la détection d&#39;événements dans des cellules individuelles, etpeut être utilisé soit avec des lignées cellulaires (par exemple, des cellules HEK293 ou CHO) ou avec plus physiologiquement pertinente des cellules primaires. analyse d&#39;image avec BIND Voir logiciel permet la détection des réponses cellulaires à la fois individuelle et des populations de cellules. Comme les biocapteurs sont incorporés dans la norme SBS 384 puits des microplaques, le système est facilement adaptable à un criblage à haut débit (HTS). -Longueur d&#39;onde de résonance des biocapteurs optiques de réseau ont déjà été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l&#39;activation du GPCR 11. Notre laboratoire a cloné deux canaux potassiques (K Na) activé sodium, Slack-B et Slick 12. L&#39;activité des deux canaux B et Slack-luisant a été montré pour être très fortement influencé par une activation directe de la protéine kinase C (PKC) 13. L&#39;activation de la protéine Ga de q récepteurs couplés, tels que le récepteur muscarinique M1 et la glutamate métabotropiques mGluR1 receptor, régule puissamment l&#39;activité des canaux grâce à l&#39;activation de la PKC. Ces canaux K Na contribuent à l&#39;adaptation neuronale pendant la stimulation soutenue et régulent la précision de la synchronisation des potentiels d&#39;action 14. Chaînes lâches sont connus pour interagir avec une variété de molécules de signalisation cytoplasmiques, y compris FMRP, la protéine Fragile X Mental Retardation 15,16. Des mutations dans le résultat Slack dans plusieurs crises partielles Migration de la petite enfance (MMPSI), une forme précoce de l&#39;épilepsie qui se traduit par un retard de développement sévère 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

Les canaux ioniques contrôler les propriétés électriques des neurones et d&#39;autres types de cellules pouvant être excitées sélectivement par des ions permettant de couler à travers la membrane plasmique 1. Pour réguler l&#39;excitabilité neuronale, les propriétés biophysiques des canaux ioniques sont modifiées par les protéines et molécules de signalisation, qui se lient souvent les chaînes elles-mêmes pour former un complexe hétéromère de canal 2,3. Des dosages traditionnels examinant l&#39;interaction entre les canaux et les protéines régulatrices exogènes exigent des étiquettes qui peuvent éventuellement modifier le comportement de la protéine et de diminuer l&#39;importance physiologique de la cible, tout en fournissant peu d&#39;informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. Des biocapteurs optiques, tels que le système X-CORPS Biosciences BIND Scanner, utilisent une technologie sans étiquette roman, résonance longueur d&#39;onde de réseau (GTR) de biocapteurs optiques pour détecter les changements dans la lumière réfléchie de résonance près du biocapteur. Cet essai permet la détection de l&#39;importance relativechanger dans la masse à l&#39;intérieur de la partie inférieure des cellules vivantes adhérentes à la surface du biocapteur résultant de ligands changements induits dans l&#39;adhérence cellulaire et d&#39;étalement, de la toxicité, de la prolifération, et les changements dans les interactions protéine-protéine à proximité de la membrane plasmique. Biocapteurs optiques GTR ont été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l&#39;activation de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), les tyrosine kinases de récepteur, et d&#39;autres récepteurs de la surface cellulaire. Les changements induits dans les interactions ligand-protéine canal ionique peuvent également être étudiés dans cet essai. Dans cet article, nous allons décrire la procédure expérimentale utilisée pour détecter la modulation de la Slack-B potassium activée au sodium (Na) K canaux par les RCPG.

Slack-B transfectées de façon stable cellules HEK-293 et ​​le contrôle non transfectées cellules HEK-293 ont été ensemencées à 1000 cellules / puits sur 384 et, ECM revêtu GTR plaques de biocapteurs. Images de la centrale de 1,5 mm 2 du biocapteur ont été enregistrées à une résolution de 3,75 um / pixel (Figure 1). gradient de densité de masse des cartes ont été générées avant et 30 minutes après l&#39;addition de composé avec le logiciel BIND Scan. La BIND Voir logi...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors at JoVE.com

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

L&#39;utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vues.  Yale School of Medicine.  Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche. 

Vidéo: Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Recherche

Bio-ingénierie

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sans contact, sans étiquette de surveillance des cellules et la matrice extracellulaire en utilisant la spectroscopie Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation de molécules d&#39;ARN simple par pinces optiques

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d&#39;analyse ADN hybridation Sans étiquette

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Une technique Label-free pour l&#39;imagerie spatio-temporelle de cellule unique sécrétions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Évaluation de collagène et élastine Microarchitectures dépendant de la pression dans les artères de résistance vivants, humains en microscopie par Fluorescence Label-free

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...