Nous reconnaissons le Dr Harold Dvorak pour des discussions utiles, y compris la suggestion d&#39;essayer fixation à 37 ° C PFA. Ce travail a été soutenu par NIH P01 CA92644 et par un contrat de la Fondation nationale pour la recherche sur le cancer.

Une. Culture cellulaire sur collagène verre enduit de disque <ol><li> Lieu disques de verre (12 mm de diamètre) dans un bocal de verre (4 onces) et autoclave pour stériliser les disques. </li><li> Placer 25 ml de 70% d&#39;éthanol dans un tube Falcon de 50 ml et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Cette solution peut être réutilisé de multiples fois jusqu&#39;à ce que le niveau de la solution tombe à 20 ml. </li><li> Placez tranchants pince avec un point extra fine dans de l&#39;éthanol à 70% pendant 5 minutes avant de l&#39;utiliser pour traiter le disque de verre. </li><li> Retirez délicatement la pince sur le tube et refermer le bouchon, puis placez délicatement la pince d&#39;éthanol traité sur le dessus du tube de sécher à l&#39;air pendant 2 min. Ne laissez pas la pointe de la pince de toucher quoi que ce soit dans la hotte. </li><li> Utilisez les pinces stériles d&#39;attraper un disque de verre stérile sur le pot de verre et le placer dans un puits de la plaque de culture cellulaire de 24 puits. Répétez jusqu&#39;à ce que le nombre souhaité de puits a été rempli avec des disques. </li><li> Mettre 500 ul de solution de collagène bovin (50 ng / ml) dans chaque puits qui contient un disque de verre et le placer dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur de culture cellulaire pendant au moins 30 min. Il n&#39;y a pas de mal à une incubation plus longue. </li><li> Récolte des cellules HUVEC (cellules endothéliales de veine ombilicale humaine) ou PC3 (cellules tumorales de la prostate), qui ont déjà été cultivées dans 150 mm de plaque de culture cellulaire à travers trypsinisation et bloquent l&#39;activité de la trypsine en utilisant le milieu de culture complet. Prélever des cellules dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Compter le nombre de cellules et de s&#39;assurer de la viabilité est supérieure à 90%. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. </li><li> Utilisation du milieu de culture pour diluer les cellules à 10 5 cellules / ml. Placez les cellules sur la glace. </li><li> Aspirer le collagène dans la hotte de culture cellulaire et placez doucement 500 pl de suspension cellulaire dans chaque puits, dans lequel les disques de verre ont été pré-revêtues avec du collagène. 5 x 10 4 cellules / puits dans la plaque à 24 puits donnera 60% confluency pour les cellules HUVEC et 30% de confluence de cellules PC3. Remarque: ajouter plus de suspension cellulaire de la densité cellulaire plus élevée. </li><li> Culture des cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, ou 24 h pour suivre les activités de nanopodia et passage de cellule. Habituellement, les cellules se fixeront sur le disque de verre dans les 30 premières minutes, puis commencent à polariser et migrer dans la première heure, et effectuer des interactions intercellulaires et la division cellulaire dans les heures suivantes. </li></ol> 2. Fixation cellule <ol><li> Chaque puits devra 500 pi 4% PFA (paraformaldéhyde) pour fixer les cellules. Soit fabriqué commercialement ou fraîchement préparé PFA 4% peut être utilisée. Calculez le montant de PFA nécessaire sur la base du nombre de puits préparés, et placer PFA dans un tube Falcon de 15 ml. ATTENTION: paraformaldéhyde est soupçonné d&#39;être cancérigène. </li><li> Mettez le tube Falcon dans un stand de styromousse qui était déjà en place dans un incubateur à 37 °. Laisser le tube dans l&#39;incubateur pendant 30 min à la guerresuis la PFA à 37 ° C. </li><li> Placez un coussin chauffant dans la hotte de culture et allumez-le. </li><li> Sortez la plaque de culture cellulaire de 24 puits et la préchauffé PFA de l&#39;incubateur et placez-le sur le dessus du coussin chauffant. </li><li> Utilisez une main pour aspirer le moyen d&#39;un puits, et immédiatement après utiliser l&#39;autre main pour glisser doucement 500 pi PFA dans le puits à travers le bord bien. Pour faciliter l&#39;aspiration, incliner la plaque de culture à environ 45 °, appuyé contre le support en polystyrène de sorte qu&#39;il est stable à cet angle. Cela facilitera l&#39;aspiration et l&#39;ajout de solution PFA au bien sans déranger les cellules en culture. Cette étape est la plus cruciale pour préserver la structure cellulaire initiale des activités cellulaires. </li><li> Répétez le processus jusqu&#39;à ce que tous les puits avec un disque de verre ont reçu PFA. Note: toutes les mesures qui doivent changer solution pré-existante du puits s&#39;appliqueront mêmes procédures d&#39;aspiration. </li><li> Placer la plaque dans 37 ° C pendant 5 min. </li&gt; <li> Prenez la plaque arrière de la hotte de culture et incliner contre styromousse comme décrit dans l&#39;étape 2.5. Utilisez une main pour transférer doucement la PFA du puits dans un tube de collecte; utiliser l&#39;autre main pour placer immédiatement après au moins 500 pi salle de PBS température dans le puits. Après tous les puits ont été lavés, retourner et répéter le lavage PBS une fois de plus dans chaque puits. Vider la PFA recueillies dans un conteneur de déchets dangereux. </li><li> Préparer tampon de blocage de la CPI en ajoutant 2% de sérum bovin fœtal à PBS. Azoture de sodium 0,04% (dilution de 20% solution mère) est ajouté comme agent de conservation. ATTENTION: L&#39;azoture de sodium est un composé toxique. Le tampon peut être stocké dans 4 ° C pendant une longue période de temps sans risque de contamination bactérienne. </li><li> Avec la plaque de culture encore inclinée contre un support, une fois de plus parcourir chaque aspiration bien pour enlever PBS et immédiatement après addition de 500 pi de tampon de blocage de la CPI. Les cellules sont maintenant prêts pour immunofluorescence. Si nécessaire, l&#39;cellules fixées peuvent être stockés dans un réfrigérateur à 4 C ° pendant une semaine sans perte significative de la protéine TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 immunofluorescence de Nanopodia <ol><li> Dans chaque puits, remplacer le tampon de blocage de 500 pi de la CPI avec un nouveau tampon de blocage contenant 0,01% de Triton X-100 et laisser reposer à température ambiante pendant 1 heure. Ne pas utiliser plus élevée que 0,03% de Triton X-100 comme il va supprimer TM4SF1 à partir des membranes cellulaires. PBS lavé les cellules de l&#39;étape 2.10 peuvent être directement déplacés vers le tampon de blocage contenant du Triton si la coloration est prêt à démarrer tout de suite. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire anti-TM4SF1 (ou anti-CD9) à 0,5 pg / ml dans du tampon de blocage CPI. </li><li> Dans chaque puits, enlever le tampon Triton ICC/0.01%, et le remplacer par 300 pi de la solution anti-TM4SF1-anticorps. Incuber 2 h à la température ambiante ou à laisser une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver chaque puits avec pas moins de 500 pi de PBS. Répétez 3x; chaque fois donner à least 5 min de temps d&#39;incubation. </li><li> Préparer une solution d&#39;anticorps et phalloïdine secondaire dans CPI du tampon de blocage, à l&#39;aide d&#39;un mille fois la dilution de l&#39;Alexa 488 d&#39;anticorps secondaire d&#39;âne anti-souris marquée (2 ug / ml de concentration finale) et 1000 x dilution de la phalloïdine (50 ng / ml de concentration finale). </li><li> Retirer du PBS et ajouter 300 ul de l&#39;anticorps secondaire et solution de phalloidin à chaque puits et incuber pendant 2 heures ou laisser toute la nuit à 4 ° C. </li><li> Répétez PBS étapes de lavage avec au moins une incubation de 5 min par lavage. Dans le dernier lavage, laisser chaque puits dans du PBS pendant 1 h. </li><li> Tomber une seule goutte (~ 10 pi) de montage anti-fade médias sur une lame de verre. </li><li> Pliez la pointe d&#39;un 19 G 1 ½ à aiguille de la seringue de 90 ° en appuyant doucement sur une surface dure. Utilisez une main pour tenir l&#39;aiguille pliée et soulevez délicatement un disque de verre du bien, et utiliser l&#39;autre main pour saisir le disque à l&#39;aide des pinces acérées. </li><li> Tournez le disque de verre &amp;# 160; face vers le bas en laissant le contact côté de la cellule du milieu de montage sur la lame de verre. Placez délicatement le disque de verre et laissez-le sécher pendant la nuit dans un endroit sombre à température ambiante. </li><li> Passez à l&#39;image de la immunofluorescence teinté nanopodia, ou de stocker les lames dans une boîte à lames à -20 ° C. Les diapositives seront rester visibles pendant quelques mois en -20 ° C. </li></ol>

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nanopodia sont des canaux membranaires cellulaires minces qui se fixent solidement à la matrice par TMED et peuvent s&#39;étendre à plus de 100 um d&#39;une cellule polarisée mobile pour détecter l&#39;environnement et la médiation des interactions intercellulaires 2,3. Nanopodia adhérer à la matrice si bien que les résidus sont laissés comme les cellules s&#39;éloigne (figures 1 et 2). Nanopodia permet donc d&#39;étudier comment les cellules sentent leur environn...

Au cours de la polarisation pour le mouvement, des cellules animales s&#39;étendent une série de saillies membranes dynamiques, à partir de leurs surfaces, y compris des filopodes, lamellipodes, les fibres de rétraction, et une volants. Récemment ajoutés à cette liste étaient nanopodia, un nouveau type reconnu de fin (100-300 m de diamètre), de forme allongée (jusqu&#39;à 50-100 m de long) projection de la membrane qui fournissent des canaux membranaires pour l&#39;extension des structures F-actine tels que filopodia et les fibres de rétraction, et que la tache positive avec TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) en endothéliales et tumorales des cellules cultivées 2,3. TM4SF1 est une protéine ayant une topologie de tétraspanines analogue qui a été initialement connu comme un antigène de cellule tumorale 4 avant la découverte du fait que la molécule est un marqueur biologique des cellules endothéliales qui joue un rôle essentiel dans la prolifération des cellules endotheliales et de la migration 2,3. Immunofluorescence a révélé que TM4SF1 est localisée à perinucLear et des vésicules à la membrane plasmique, et est enrichie en TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED ancre nanopodia à la matrice et présente dans un motif à bandes régulièrement espacées de 1-3 longueur TMED / um de nanopodia. Nanopodia s&#39;étendent généralement de leader avant d&#39;une cellule et arrière arrière pendant la polarisation de la cellule pour se déplacer. En raison de la nature solide adhérente de TMED, nanopodia sont incapables de se rétracter de nouveau dans la cellule comme il se déplace à une distance; résidus de nanopodia abandonnés oligo donc sur la trajectoire du mouvement cellulaire. Nanopodia fournir des canaux membranaires pour l&#39;extension F-actine et de rétraction, et sont des sites d&#39;interactions et de communications intercellulaires 2,3. Ces caractéristiques font que nanopodia offrent une occasion unique d&#39;étudier les mécanismes sous-jacents ensemble F-actine pendant la polarisation cellulaire, détection cellulaire de l&#39;environnement, de la détermination de la trajectoire et la direction du mouvement de la cellule, et les interactions intercellulaires unend communications. En raison de la nature hautement hydrophobe de TMED et la nature membraneuse mince et fragile de nanopodia, un soin particulier doit être pris afin de préserver TMED et nanopodia. La destruction de nanopodia et l&#39;élimination des TMED par des méthodes courantes de laboratoire est une raison possible pour laquelle seulement soixante-trois publications ont paru sur TM4SF1 depuis sa première découverte en 1986 et 1 pour l&#39;absence totale de connaissance de l&#39;enrichissement TM4SF1 à 100-300 um microdomaines sur la surface de la cellule jusqu&#39;à ce que le rapport de TM4SF1 dans les cellules endothéliales en 2009 2. Méthodes d&#39;immunomarquage classiques utilisent souvent des solvants organiques tels que l&#39;éthanol, le méthanol, l&#39;acétone ou de fixer les cellules et utiliser une concentration plus élevée de Triton X-100 0,1% ou à perméabiliser les cellules 5. Études décrites ici mis en œuvre trois changements majeurs à la méthode conventionnelle de révéler TMED et nanopodia: (i) utilisent 37 ° C 4% PFA et fixer les cellules dans un 3776; incubateur, (ii) appliquer la température ambiante douce PBS lavage, et (iii) utiliser moins de 0,03% de Triton X-100 que brièvement pour perméabiliser les cellules avant l&#39;addition de l&#39;anticorps primaire, comme le Triton X-100 supérieure à 0,03% extraira TM4SF1. Tous les tétraspanines forment des microdomaines de la membrane de la cellule 6 et à une certaine colocalisent TMED endothéliales dans les cellules tumorales et 2,3. Comme tétraspanines comme CD9, CD81, CD151 et sont exprimés de façon ubiquitaire, le protocole de coloration décrit ici peut être étendue à de nombreux types différents de cellules qui manquent TM4SF1 pour les études de la fonction nanopodia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass discs&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-545-82&#160;</td>
			<td style="width:983px;">12-mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-310</td>
			<td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-544-1</td>
			<td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50-ml falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:133px;">352070</td>
			<td>50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">15-ml falcon tube with Styrofoam rack</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:133px;">430790</td>
			<td>Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">13-812-42</td>
			<td>Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353047</td>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">150-mm cell culture plate&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353025</td>
			<td>150-mm cell culture plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">19G 1 &#189; syringe needle&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">309635</td>
			<td>19G 1 &#189;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td>Decon&#39;s Pure Ethanol 200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">collagen solution&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">354249</td>
			<td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:160px;">Cellgro</td>
			<td style="width:133px;">25-053-CI</td>
			<td><a name="RANGE!D15">0.25% Trypsin-EDTA 1X</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">75889 5 LT</td>
			<td style="width:983px;">PBS, 10X Solution, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">19943 1 LT</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td><a name="RANGE!D19">Fetal Bovine Serum</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EGM2-MV</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T8787</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S2002-25G</td>
			<td>solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human TM4SF1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">MAB3127</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human CD9 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">555370</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">A-21202</td>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Chemicon</td>
			<td style="width:133px;">90324</td>
			<td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">anti-fade mounting media&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">P-36931</td>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Buffers and solutions</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">70% ethanol&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>17.5 ml of ethanol (200 proof) 
			7.5 ml of double deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS (make 200 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20 ml of 10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">180 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20% Triton X-100 (make 20 ml)&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">4 ml</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">16 ml double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4% NaN3 (make 25 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">1 g of NaN3</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Make stock soln. of 50 &#956;g/ml (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">830 &#956;l of Collage I (3 mg)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml PBS&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ICC Blocking Buffer (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">49 ml PBS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2% FBS (add 1 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">0.04% NaN3 (add 100 &#956;l of 4% NaN3)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml of ICC Blocking Buffer&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 &#956;l of 20% Triton X-100</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Cell</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HUVEC&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Lonza&#160;</td>
			<td>C2517A</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PC3</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-1435</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">cell culture hood</td>
			<td style="width:160px;">NuAIRE</td>
			<td style="width:133px;">Nu-425-600</td>
			<td>NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">37 &#176;C, 5% CO2 cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:160px;">CellStar</td>
			<td style="width:133px;">QWJ300DABA&#160;</td>
			<td>Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">heating pad&#160;</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td style="width:133px;">1020</td>
			<td style="width:983px;">K&#38;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">centrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:133px;">T6000B&#160;</td>
			<td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

Les cellules adhérentes en culture maintenir un état de polarisation pour soutenir le mouvement et les interactions intercellulaires. Nanopodia sont minces, de forme allongée, en grande partie F-actine négatif projections membranaires dans les cellules endothéliales et les cancers qui peuvent être visualisées par TM4SF1 (transmembranaire-4-L-six-famille-1) immunofluorescence. Grappes TM4SF1 à 100-300 diamètre um TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) contenant de 3 à moins de 14 individuels TM4SF1 molécules. TMED sont agencées de manière intermittente le long de nanopodia à un espacement régulier de 1 à 3 TMED par μ m et à ancrer fermement nanopodia matrice. Cela permet de prolonger nanopodia plus de 100 μ m du front avant ou arrière à l&#39;arrière des cellules endothéliales tumorales ou polarisées, et provoque des résidus de membranes d&#39;être laissé sur matrix lorsque la cellule s&#39;éloigne. TMED et nanopodia ont été négligés en raison de leur extrême fragilité et sensibilité à la température. Lavage régulier et la fixation perturbent la structure. Nanopodia sont conservés par fixation directe dans paraformaldéhyde (PFA) à 37 ° C, suivie d&#39;une brève exposition à 0,01% de Triton X-100 avant la coloration. Nanopodia ouvrir de nouvelles perspectives en biologie cellulaire: ils promettent de remodeler notre compréhension de la façon dont les cellules détectent leur environnement, de détecter et d&#39;identifier d&#39;autres cellules à distance, initier des interactions intercellulaires au contact étroit, et des mécanismes de signalisation impliquées dans le mouvement, la prolifération et la cellule -cellulaires communications. Les méthodes développées pour étudier nanopodia TM4SF1 dérivés peuvent être utiles pour les études de nanopodia qui se forment dans d&#39;autres types cellulaires par l&#39;intermédiaire de tétraspanines classiques, notamment le CD9 exprimée de manière ubiquitaire, CD81, CD151 et.

Pour l&#39;étape 1: Si les cellules (comme les cellules HUVEC et PC3 utilisée dans cette étude) sont capables de se développer normalement, les cellules se fixent sur le disque revêtu de collagène dans les 30 minutes après ils sont ensemencées, polarisent et deviennent mobiles peu après, et s&#39;étendent nanopodia avance sur leur chemin de mouvement. figures 1A et 1B montrent respectivement un polarisée et la prolifération des cellules HUVEC. <stro...

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Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia sont des canaux membranaires minces mais fragiles qui s&#39;étendent jusqu&#39;à 100 um de leader avant ou arrière de l&#39;arrière de la cellule et le sens de l&#39;environnement cellulaire. Fixation directe à 37 ° C, un lavage doux, et d&#39;éviter les solvants organiques tels que l&#39;éthanol, le méthanol, ou l&#39;acétone et de l&#39;augmentation de Triton X-100 concentrations sont tenus de respecter ces structures cellulaires.

Nanopodia - minces, les projections fragile membrane avec des rôles dans le mouvement cellulaire et intercellulaires Interactions

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K vues.  Harvard Medical School.  Nanopodia sont des canaux membranaires minces mais fragiles qui s'étendent jusqu'à 100 um de leader avant ou arrière de l'arrière de la cellule et le sens de l'environnement cellulaire. Fixation directe à 37 ° C, un lavage doux, et d'éviter les solvants organiques tels que l'éthanol, le méthanol, ou l'acétone et de l'augmentation de Triton X-100 concentrations sont tenus de respecter ces structures cellulaires. 

Vidéo: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Recherche

Biologie

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open Source Analyse unique pour particules super-résolution Microscopie avec VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flash et Gel: Une nouvelle technique pour capturer la membrane dynamique avec la microscopie électronique

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral budding, among other vital cellular processes. For efficient biological activity, cell membranes should be rigid enough to maintain the integrity of the cell and its compartments yet fluid enough to allow membrane components, such as proteins and functional domains, to diffuse and interact. This delicate balance of elastic and fluid membrane properties, and their impact on biological function, necessitate a better understanding of collective membrane dynamics over mesoscopic length and time scales of key biological processes, e.g., membrane deformations and protein binding events. Among the techniques that can effectively probe this dynamic range is neutron spin echo (NSE) spectroscopy. Combined with deuterium labeling, NSE can be used to directly access bending and thickness fluctuations as well as mesoscopic dynamics of select membrane features. This paper provides a brief description of the NSE technique and outlines the procedures for performing NSE experiments on liposomal membranes, including details of sample preparation and deuteration schemes, along with instructions for data collection and reduction. The paper also introduces data analysis methods used to extract key membrane parameters, such as the bending rigidity modulus, area compressibility modulus, and in-plane viscosity. To illustrate the biological importance of NSE studies, select examples of membrane phenomena probed by NSE are discussed, namely, the effect of additives on membrane bending rigidity, the impact of domain formation on membrane fluctuations, and the dynamic signature of membrane-protein interactions.

This paper describes the protocols for sample preparation, data reduction, and data analysis in neutron spin echo (NSE) studies of lipid membranes. Judicious deuterium labeling of lipids enables access to different membrane dynamics on mesoscopic length and time scales, over which vital biological processes occur.

Spectroscopie d’écho de spin neutronique en tant que sonde unique pour la dynamique de la membrane lipidique et les interactions membrane-protéine

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...