Notre protocole utilise une seule analyse de vérification des particules pour surveiller la dynamique de l’emplacement et de l’orientation et caractérise la diffusion de nanorods dorés sur les membranes cellulaires. En utilisant cette méthode, la dynamique translationnelle et la dynamique de rotation des nanorods dorés peuvent être obtenues et la dynamique peut être analysée de manière exhaustive et présentée. Ce protocole a le potentiel d’être utilisé pour l’étude d’autres types de systèmes biologiques complexes.
Commencez par brûler un couvercle en verre trempé à l’éthanol sur la flamme et placez le coverslip dans un plat de culture cellulaire de 35 x 10 millimètres contenant deux millilitres de milieu de culture cellulaire sans rouge phénol. Ajouter 50 microlitres de la suspension cellulaire d’intérêt sur le coverslip et secouer doucement le plat d’avant en arrière et à gauche et à droite pour répartir uniformément les cellules. Placer le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant environ 12 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 20 à 40% de confluence avant d’ajouter 20 microlitres de nanorods d’or enduits CTAB au plat.
Après avoir secoué doucement pour disperser les nanorods uniformément à travers le plat, placez le plat dans une atmosphère humidifiée pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, transférer lentement 100 microlitres de surnatant du plat dans la rainure d’une glissière de verre et placer soigneusement le côté de la cellule coverslip vers le bas sur la rainure de diapositives, puis sceller le bord de la couverture avec du vernis à ongles et laisser sécher le vernis à ongles avant de placer la diapositive sur le stade du microscope darkfield. Pour le suivi d’une seule particule par microscopie darkfield, placez une goutte d’huile sur l’huile immerger condenseur darkfield et tourner le bouton jusqu’à ce que le condenseur entre en contact avec la glissière de verre.
Placer une goutte d’huile sur le dessus du verre de couverture et tourner le bouton de mise au point jusqu’à ce que l’objectif d’immersion d’huile 60X touche l’huile. Allumez la source lumineuse et tournez légèrement le bouton de mise au point pour concentrer le plan d’imagerie. Cliquez ensuite sur l’icône de l’appareil photo dans le logiciel microscope pour enregistrer un échantillon dispersant des séries de temps d’image lumineuse à l’aide de la caméra CMOS couleur et enregistrer l’image dans un format TIFF.
Pour extraire une seule trajectoire à long terme, ouvrez l’image en ImageJ et cliquez sur l’image, tapez et 8 bits pour convertir l’image du mode RVB en mode 8 bits. Pour ajuster le contraste, cliquez sur l’image, ajustez, contrastez la luminosité et définissez les paramètres. Sélectionnez une particule cible et utilisez le contrôle X pour couper l’arrière-plan de la série de temps.
Cliquez sur plugins, tracker de particules classique, et tracker de particules pour ouvrir la détection des particules et la fenêtre de liaison des particules et définir le rayon à six, la coupure à zéro, et le percentile à 0,01%Réglez la plage de lien à 10 et le déplacement à 10 et cliquez sur OK pour ouvrir la fenêtre de résultats tracker particules pour voir les résultats. Cliquez sur visualiser toutes les trajectoires pour inspecter les trajectoires générées. Si la trajectoire générée par le logiciel et la trajectoire mobile des nanorods d’or sont appariées, cliquez sur enregistrer le rapport complet pour enregistrer les résultats.
Si la trajectoire générée par le logiciel ne correspond pas à la trajectoire mobile des nanorods d’or, cliquez sur reconnecter les particules pour reconnecter les particules détectées avec différentes plages de liaison et paramètres percentiles. Pour trouver la coordonnée du pixel central de la nanorod d’or dans chaque image selon la coordonnée XY, utilisez la xycoordination. fonction m.
Pour délimiter une matrice de trois par trois pixels, extraire les neuf valeurs d’intensité de diffusion des canaux rouges ou verts et calculer une valeur moyenne, utiliser la rgextraction. fonction m. Ensuite, utilisez le polarangle.
m pour calculer les angles polaires à l’aide de la méthode différentielle à double canal. Pour calculer les paramètres dynamiques à l’aide des formules de la table, exécutez les deux scripts d’analyse. Pour l’analyse visuelle de la trajectoire, définissez la coordonnée X comme X, la coordonnée Y comme Y, et l’heure comme Y, puis cliquez sur l’intrigue, la dispersion et la carte des couleurs, définissez les paramètres graphiques et ajoutez la barre de couleur.
Pour générer des figures d’intervalle de temps de déplacement carré moyen, définissez l’intervalle de temps comme X et le déplacement carré moyen sous forme de diagramme Y.Click, dispersez, analysez, adaptez, raccordez, raccordez la courbe non linéaire et ouvrez le dialogue et définissez les paramètres graphiques. Pour l’analyse statistique multiparticule, définissez les paramètres dynamiques d’intérêt comme Y et cliquez sur l’intrigue et l’histogramme. Double-cliquez sur l’histogramme pour définir la taille de la division ou le nombre de divisions et cliquez sur appliquer.
Ajoutez ensuite une colonne et définissez les paramètres graphiques. Pour une analyse de série de temps, définissez l’heure comme X et les paramètres de la série de temps comme y.click plot, multi-pane, et stack. Dans la fenêtre popup, sélectionnez la ligne et OK. Définissez ensuite les paramètres du graphique.
Le maximum plasmonique longitudinal de 40 par 85 nanomètres de nanorods d’or enduits de CTAB est d’environ 650 nanomètres et la résonance transversale est de 520 nanomètres. L’intensité de diffusion des nanorods d’or enduits CTAB sur les membranes cellulaires U87 démontre une distribution gaussienne typique avec une largeur étroite compatible avec celle des nanorods d’or enduits CTAB sur verre indiquant que les nanorods d’or enduits CTAB suivis dans cette expérience sont bien monodispersés. Comme il est illustré, plus de 500 trajectoires nanorod en or enduites de CTAB peuvent être suivies par microscopie darkfield et peuvent être divisées en trajectoires de diffusion à longue portée et trajectoires de diffusion confinées.
Le rayon de gyration des 500 trajectoires de cette analyse représentative a montré une petite distribution de valeur avec un rayon moyen de gyration de 0,5 micromètre et le déplacement maximum était plus réparti à de petites valeurs. Comme l’a démontré cette analyse moyenne du déplacement carré moyen du temps d’ensemble, les nanorods d’or enduits de CTAB se diffusent normalement avec un alpha d’environ un. La répartition de la densité du coefficient de diffusion et de l’alpha obtenu à partir de toutes les trajectoires, cependant, révèle que la dynamique des nanorods d’or présente une distribution hétérogène avec des mouvements de superdiffusion, brownien et subdiffusion.
En outre, l’analyse statistique des particules individuelles et l’analyse des paramètres des séries de temps peuvent être utilisées pour caractériser deux trajectoires confinées et mobiles représentatives à long terme. Il est nécessaire de résumer et d’extraire une interprétation unique et nouvelle des données de la lecture de l’analyse de suivi des particules unique, car il y a généralement des compromis difficiles à faire.
