Cette verticale présente des étapes importantes dans l’assemblage de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire avec des récepteurs transmembranaires fonctionnels. Ces colonnes peuvent être utilisées pour l’identification de petites molécules présentes dans des extraits complexes et interagissant avec des récepteurs transmembranaires immobilisés. Les colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire accélèrent l’identification des composés biologiquement actifs présents dans les mélanges complexes.
L’utilisation de colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire peut être particulièrement intéressante pour ceux qui s’intéressent à l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans des matrices naturelles complexes, telles que des extraits végétaux, fongiques ou bactériens. Pour commencer, préparez une solution mère de benzamidine de 200 millimolaires en dissolvant 120 de benzamidine dans cinq millilitres d’eau désionisée ultrapure. Préparer une solution mère de PMSF de 10 millimolaires en dissolvant 0,017 gramme de PMSF dans 10 millilitres d’éthanol dans une hotte aspirante.
Préparez le cocktail d’inhibiteurs de protéases 100X en dissolvant le mélange d’inhibiteurs de protéase disponible dans le commerce dans un millilitre d’eau désionisée ultrapure. Bien mélanger et aliquoter 200 à 300 microlitres du cocktail. Préparer une solution mère d’ATP de 100 millimolaires en dissolvant 55,114 milligrammes d’hydrate de sel disodique d’ATP dans un millilitre de l’eau ultrapure ionisée.
Bien mélanger et aliquoter 100 microlitres du mélange. Préparer le tampon en dissolvant 3,03 grammes de Tris-HCL, 2,9 grammes de chlorure de sodium, 0,22 gramme de chlorure de calcium anhydre, 0,2 gramme de chlorure de magnésium hexahydraté et 0,19 gramme de chlorure de potassium dans 500 millilitres d’eau désionisée ultrapure. Préparer le tampon d’homogénéisation en mélangeant 17,3 millilitres du tampon Tris avec 0,3 millilitre de solution mère de benzamidine, 0,2 millilitre de solution mère PMSF, 0,2 millilitres de cocktail inhibiteur de protéases, 20 microlitres de solution mère d’ATP, deux millilitres de glycérol et 0,029 gramme d’EDTA.
Ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique. Faites tourner les cellules récoltées à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes à 400 x g et retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire restante avec 10 millilitres de PBS glacé 1X pH 7,4. Jeter le surnageant et ajouter 20 millilitres de tampon d’homogénéisation.
Placez le tube conique sur de la glace. Transférez la suspension cellulaire dans un broyeur de tissu homogénéisateur Dounce de 40 millilitres, homogénéisez la suspension manuellement sur de la glace à l’aide de 40 coups de pilon de haut en bas. Transférer la suspension cellulaire homogénéisée dans un tube conique de 50 millilitres, jeter la pastille et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique.
Conservez la pastille de membrane cellulaire et jetez le surnageant. Préparer le tampon de solubilisation en mélangeant 8,7 millilitres de la solution tampon avec 0,1 millilitre de solution mère pmSF, 0,15 millilitre de solution mère de benzamidine, 0,1 millilitre de cocktail inhibiteur des protéases, 10 microlitres de solution mère ATP, un millilitre de glycérol et 0,2 gramme de cholate de sodium. Transférer le tampon de solubilisation dans le tube conique avec des fragments de membrane cellulaire.
Et remettez en suspension la pastille. Faites pivoter le mélange résultant à 150 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 18 heures. Après 18 heures, centrifuger le mélange de solubilisation à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 47 900 x g.
Ajouter 100 milligrammes d’IAM. PC. Particules de DD2 vers le surnageant et faire pivoter le mélange de suspension résultant à 150 tr / min à quatre degrés Celsius pendant une heure. Préparez un tampon de dialyse dans quatre litres d’eau désionisée ultrapure en ajoutant 24 grammes de Tris-HCl, 23,4 grammes de chlorure de sodium, 0,06 gramme de chlorure de calcium, 5,85 grammes d’EDTA et 0,07 gramme de PMSF.
Dissoudre d’abord le PMSF dans un petit volume d’éthanol, puis ajouter lentement dans le bécher avec le tampon. Coupez 10 centimètres de tube de dialyse à membrane de cellulose pour préparer le tube de dialyse et transférez la suspension contenant de l’IAM. PC. Particules DD2 et fragments de membrane cellulaire dans le tube de dialyse.
Fermez les deux extrémités du tube de dialyse avec des clips de tube de dialyse. Placez le tube de dialyse dans le tampon de dialyse. Après 24 heures, placez le tube de dialyse dans le tampon de dialyse fraîchement préparé et poursuivez la dialyse pendant encore 24 heures.
Préparer un tampon d’acétate d’ammonium de 10 millimolaires pH 7,4 qui sera utilisé pour laver l’IAM. PC. Particules de DD2 et dans des expériences de caractérisation en colonne en dissolvant 0,778 gramme d’acétate d’ammonium dans un litre d’eau désionisée ultrapure. Après 48 heures de dialyse, retirez le tube de dialyse du tampon de dialyse et transférez le contenu du tube de dialyse dans un tube conique de 15 millilitres.
Jeter le surnageant et laver la pastille restante trois fois avec 10 millilitres de tampon d’acétate d’ammonium. Après le troisième lavage, remettre en suspension la pastille restante dans un millilitre de tampon d’acétate d’ammonium. Mélangez-le soigneusement et utilisez la boue obtenue pour emballer la colonne de verre 5 x 20 afin de donner la colonne de chromatographie CMAC.
Pour emballer la colonne, placez un filtre inférieur préalablement imbibé d’un tampon d’acétate d’ammonium dans le porte-filtre. Placez le porte-filtre dans la colonne de verre et vissez le capuchon de la colonne pour sécuriser la position du support. Placez la colonne verticalement dans une pince à doigts et fixez-la dans le support de laboratoire.
Placez un bécher sous la colonne, transférez lentement un petit volume de boue dans la colonne de verre avec une pipetter à canal unique tenant la pointe de la pipette contre la paroi de la colonne de verre. Pour accélérer le processus d’emballage, retirez le tampon au-dessus du lit fixe avec une micropipette entre chaque étape. Placez un filtre supérieur et vissez l’adaptateur de sorte qu’il ne reste plus de tampon au-dessus de la phase stationnaire.
Fixez la position de l’adaptateur à l’aide du verrou de l’adaptateur. Connectez la colonne à une pompe de chromatographie liquide à haute performance et, pour laver la colonne pendant la nuit avec un tampon d’acétate d’ammonium, réglez le débit à 0,2 millilitre par minute. Pour un stockage plus long, faites fonctionner la colonne avec une solution d’azoture de sodium à 0,05% dans un tampon d’acétate d’ammonium, en portant une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants lorsque vous travaillez avec de l’azoture de sodium et conservez à quatre degrés Celsius.IAM.
PC. Les particules de DD2 avec des fragments de membrane cellulaire TrkB de neuroblastome immobilisés et en présence de BDNF ont donné des particules fluorescentes. Aucune fluorescence n’a été observée dans les particules IAM encapsulées par membrane cellulaire nulle TrkB ou lorsqu’aucun BDNF n’a été utilisé comme dans les particules IAM encapsulées par membrane cellulaire TrkB. Un chromatogramme d’affinité frontale typique des colonnes CMAC fonctionnelles augmentant les concentrations de 7, 8-DHF d’un millimolaire, 750 nanomolaire, 500 nanomolaire et 300 nanomolaires aux récepteurs TrkB immobilisés est montré, ce qui a montré un changement dépendant de la concentration dans le temps de rétention.
Une colonne CMAC non fonctionnelle a montré l’absence de changements dépendants de la concentration dans la rétention du ligand marqueur. Une colonne témoin négative CMAC a été préparée en immobilisant des fragments de membrane cellulaire, et non en exprimant la protéine ciblée pour exclure des interactions non spécifiques. L’ajout d’extrait aqueux de Gotu kola à 0,2 % a entraîné une réduction significative de la rétention de 7, 8-DHF, indiquant la présence de ligands concurrents pour le site de liaison agoniste.
L’absence de réduction de la rétention de 7, 8-DHF sur la colonne nulle TrkB négative du CMAC a confirmé l’absence de récepteurs TrkB fonctionnels sur cette colonne. L’approche manquante de la chromatographie de pointe a permis d’identifier un composé fortement retenu sur la colonne TrkB, tout en éluant tôt la colonne nulle TrkB, indiquant une interaction spécifique. Il est crucial de connaître votre source de récepteurs pour la colonne de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire rapide.
Assurez-vous de vérifier la littérature pour bien concevoir les tampons d’homogénéisation et de solubilisation. La colonne de chromatographie d’affinité de la membrane cellulaire préparée dans ce protocole a été utilisée pour identifier de nouveaux succès potentiels de médicaments et pour caractériser la nature de l’interaction entre le récepteur immobilisé et ses ligands naturels.
