Supported by NIH Grants NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 to Dr. Michael E. Selzer; Shriners Research Grant SHC-85220 to Dr. Michael E Selzer; and Shriners Research Grant SHC-85310 to Dr. Michael I. Shifman. Dr. Ant&#243;n Barreiro-Iglesias was supported by the Fundaci&#243;n Barri&#233; (Spain) and the Xunta de Galicia (Galicia, Spain).

Voir le tableau 1 pour tous les matériaux utilisés dans ce protocole. Des expériences ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;Université Temple. 1. Animaux <ol><li> Obtenir type sauvage larves de lamproie de mer (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de longueur (4 - 7 ans) des cours d&#39;eau qui alimentent le lac Michigan, des affluents de la rivière Delaware (Pennsylvanie) ou les cours d&#39;eau, dans le Maine. </li><li> Dans le laboratoire, maintenir les larves dans des groupes de 50 - 100 animaux dans les réservoirs d&#39;eau de 50 gallons à 16 ° C. Ligne des réservoirs avec un pouce de gravier pour les larves de terrier, et l&#39;eau est filtrée et conditionnée charbon de bois avec des pierres de l&#39;air pendant au moins 48 heures pour éliminer le chlore et d&#39;autres impuretés avant de placer les lamproies en eux. Il n&#39;est pas nécessaire de nourrir les animaux, qui recyclent leur propre détritus, jusqu&#39;à la journée d&#39;utilisation. </li></ol> 2. complète épinièreCordon Transection <ol><li> Avant la chirurgie de la moelle épinière préparer une solution de Ringer lamproie avec la composition suivante: NaCl 110 mM, KCl 2,1 mM, 2,6 mM de CaCl2, 1,8 mM MgCl 2 et du tampon Tris 10 mM; pH 7,4. </li><li> Pour effectuer la transection de la moelle épinière, les larves placer dans un petit récipient à anesthésiés avec 1% de méthanesulfonate de tricaïne dans une solution de Ringer à froid de glace. </li><li> Une fois lieu anesthésié les animaux dans une boîte de Pétri à moitié rempli d&#39;Sylgard (silicone) et utilisent 4 broches d&#39;insectes (0,15 mm de diamètre) pour maintenir les animaux en position pour la chirurgie (on est placé au museau de l&#39;animal, l&#39;un à la queue et deux au niveau de la 5 ème branchies). Remplissez la boîte de Pétri près au sommet avec une solution de Ringer. Mettez le plat avec la larve sur la glace pendant la chirurgie sous la loupe binoculaire. </li><li> Pour effectuer la transection de la moelle épinière dorsale, la ligne médiane, une incision longitudinale avec un scalpel (n ° 11) au niveau de la 5 èmebranchies de visualiser la moelle épinière. Initialement, la peau est ouverte par l&#39;insertion de la pointe de la lame de scalpel et ensuite vers le haut le tissu musculaire est coupé très doucement jusqu&#39;à ce que la moelle épinière peut être vu d&#39;en haut. Mode deux crochets des broches insectes et les utiliser pour maintenir les parois de la caisse ouverte tout en effectuant le sectionnement de la moelle épinière. </li><li> Complètement transect de la moelle épinière au niveau de la 5 ème branchies en utilisant une paire de ciseaux (Castroviejo n ° 8), insérer les ciseaux perpendiculairement à la moelle épinière. La moelle épinière doit être complètement sectionnée par une coupe franche. Visualisez les extrémités de la moelle épinière de coupe sous la loupe binoculaire pour confirmer que la moelle épinière a été complètement sectionné. Ensuite, aligner les extrémités de la moelle épinière après la coupe de sectionnement à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces (5). </li><li> Après avoir effectué la transection de la moelle épinière fermer la plaie dans la paroi dorsale du corps avec une paire de pinces fines et met les larves sur de la glace pendant 1 heure pour permettre à la plaie de to sécher. Placer un morceau de papier-filtre entre la glace et les larves et les faire tremper avec une solution de Ringer lamproie. La basse température permet de maintenir les animaux vivants, en même temps qu&#39;il permet à la plaie de l&#39;air sec et donc aider à prévenir les infections. </li><li> Transférez ensuite les larves de petits réservoirs (1 larve par réservoir) avec de l&#39;eau glacée pendant 24 heures. </li><li> Examinez la lésion larves 1 jour après le sectionnement de la moelle pour confirmer comportemental qu&#39;il n&#39;y a pas de mouvement caudal au site de la lésion. Un sectionnement de la moelle épinière est considérée comme complète si la larve peut se déplacer que son rostre de la tête à l&#39;endroit de la blessure (au niveau de la 5 ème branchies). Si c&#39;est le cas, les larves peut maintenant être transféré dans des réservoirs (1 larve par réservoir) avec l&#39;eau douce à température ambiante (23 ° C) pour leur permettre de récupérer des points de temps choisis. </li><li> Au cours de la période de récupération de changer l&#39;eau tous les 2 à 3 jours. </li></ol> 3. dissection du cerveau et la préparation dele cerveau pour l&#39;hybridation in situ <ol><li> Aux points de temps souhaités après la blessure ré-anesthésier les lamproies larvaires et le lieu et les épingler dans la boîte de Pétri avec une solution de Ringer pour effectuer la dissection du cerveau comme ci-dessus. </li><li> Pour disséquer le cerveau, tout d&#39;abord faire une incision transversale avec le scalpel entre la narine et la glande pinéale. De là, commencer à couper le tissu entourant le cerveau en utilisant une paire de ciseaux Castroviejo en la tenant avec une paire de forceps. </li><li> Une fois que le cerveau est exposé, retirez le plexus choroïde en utilisant une paire de pinces et d&#39;utiliser les crochets pour répandre la tête de l&#39;animal et d&#39;exposer les nerfs crâniens. Ensuite, coupez la transversale de la moelle épinière avec des ciseaux de Castroviejo. Maintenir la moelle épinière avec une paire de pinces tout en utilisant une autre paire de pinces pour couper les nerfs crâniens pour disséquer le cerveau destination. </li><li> Après dissection, mettre le cerveau sur un petit morceau de silicone et le maintenir en position en insérant deux insect broches dans le bulbe olfactif et le 1 dans la moelle épinière. Ensuite, coupez la partie postérieure et commissures cerebrotectal du cerveau le long de la ligne médiane dorsale avec les ciseaux et dévier les plaques alaires latéralement et épinglez-les à plat sur ​​le silicone avec 4 broches d&#39;insectes (figure 2). </li><li> Transférer la pièce de silicone avec le cerveau dans un tube contenant 4% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate salin (pH 7,4) d&#39;être fixé à la chambre temparature pendant 3 heures sur un agitateur. </li><li> Après fixation utiliser le cerveau pour wholemount hybridation in situ comme décrit précédemment (Swain et al., 1994). Brains des animaux de contrôle ou subi une opération fictive doivent être exécutés toujours en parallèle avec les cerveaux des animaux blessés. Le cerveau larvaire wholemounted peut être étudiée par hybridation in situ en raison de sa forme plate et mince et également en raison de l&#39;absence de 10 la myéline, ce qui rend le cerveau plutôt translucide. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury.">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li><li>Davis, G. R., McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey.">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li><li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons.">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li><li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection.">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li><li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning,+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development.">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Yumu, l. R. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey.">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li><li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury.">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li><li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys.">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li><li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults.">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li><li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+myelin+sheaths:+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin.">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li><li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys.">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour effectuer un sectionnement de la moelle épinière complète et postérieure dissection du cerveau en larves de lamproie de mer. Cette procédure permet d&#39;analyser les différences dans l&#39;expression génique entre les neurones de la moelle épinière en saillie identifiables après une lésion de la moelle épinière par l&#39;intermédiaire d&#39;un cerveau entier de montage en hybridation in situ. L&#39;étape critique dans la procédure est la performance corr...

Chez les mammifères lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une perte permanente de la fonction ci-dessous le site de la lésion, car axones lésés ne se régénèrent pas dans la zone de traumatisme et se reconnecter à leurs cibles. Contrairement aux mammifères, les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. 1 Fait intéressant, les lamproies ont un ensemble de 36 moelle épinière projection neurones qui sont identifiables individuellement dans l&#39;ensemble du montage des préparations du cerveau en raison de leur grande taille 2,3 (Figure 1) . Tous ces neurones spinaux sont en saillie par un axotomisés complète transection de la moelle épinière de haut niveau. Des études antérieures de notre groupe et d&#39;autres ont montré que, même en présence de la récupération fonctionnelle après un traumatisme médullaire certains de ces neurones présentent une très faible capacité de régénération (ils sont considérés comme «mauvais régénérateurs»), tandis que d&#39;autres se régénèrent généralement leur axone à travers le site de la lésion (ils sont considérés comme «grégénérateurs ood »). 2,3 Cette caractéristique rend les lamproies un modèle vertébré intéressant d&#39;étudier les différences d&#39;expression génique entre le bien et le mal régénérateur neurones spinaux saillie qui à son tour conduire à des différences dans la capacité de régénération intrinsèque des neurones qui tentent de régénérer leurs axones dans le même environnement extrinsèque. 1 En utilisant ce modèle, nous avons précédemment montré que les neurones de projection de la colonne vertébrale avec une faible capacité de régénération axonale de montrer l&#39;expression des récepteurs de molécules de guidage comme UNC5 néogénine 4,5 et 6, qui assurent la médiation de l&#39;action inhibitrice de la nétrine et RGM respectivement. En outre, en utilisant cette méthode notre groupe a également montré que seules les bonnes régénérateurs montrent une récupération de l&#39;expression des neurofilaments après la lésion et au cours du processus de régénération. Récemment, Busch et Morgan 7 ont montré par immunofluorescence que les mauvaises régénérateurs montrent un increasexpression ée de synucléine après une blessure, qui a été rapporté par les auteurs sur le fait que les &quot;mauvais&quot; régénérateur neurones spinaux saillie meurent lentement après un sectionnement de la moelle épinière 5,7,8 complète. Ainsi, le modèle de la lamproie d&#39;une lésion complète de la moelle épinière a émergé comme un modèle très utile pour comprendre ce qui rend un cordon en saillie neurone spinal une «mauvaise régénérateur&quot; après axotomie. Pour mener nos études, nous effectuons un sectionnement de la moelle épinière protocole de chirurgie complète et une dissection postérieure du cerveau au niveau des points de temps souhaités après une blessure à effectuer wholemount hybridation in situ. Dans l&#39;article méthodologique actuelle, nous présentons un protocole détaillé pour la bonne exécution d&#39;une opération complète de lésions de la moelle épinière chez les lamproies larvaires, l&#39;entretien ultérieur des animaux et la dissection du cerveau finale et la préparation du cerveau pour une wholemount hybridation in situ. Un protocole détaillé de perform la wholemount hybridation in situ dans le cerveau des lamproies larvaires a été indiqué précédemment. 9 En outre, ce protocole en cas de blessure de la moelle épinière et le cerveau dissection peut être également utilisé pour traiter ensuite les cerveaux pour l&#39;immunohistochimie ou d&#39;autres méthodes histologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="280">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:71px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:64px;">Tricaine methane sulfonate</td>
			<td style="width:83px;">Spectrum</td>
			<td style="width:64px;">TR108</td>
			<td style="width:71px;">Benzocaine saturated solution in PBS for sacrifice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Scalpel #3</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:64px;">10003-12</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Blades for scalpel: #11</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">10011-00</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Castroviejo scissors #8</td>
			<td style="width:83px;">Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:64px;">15002-08</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="190">
			<td height="190" style="height:190px;width:64px;">Forceps #4 &#38; #5</td>
			<td style="width:83px;">Dumont, Switzerland</td>
			<td style="width:64px;">Roboz RS4955</td>
			<td style="width:71px;">#4 for dissection of Spinal cord; #5 for stripping menninges</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:64px;">Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:83px;">Olympus</td>
			<td style="width:64px;">SZ51</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:64px;">Sylgard</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Dow Corning Co.</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">184</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="189" rowspan="2" style="height:189px;width:64px;">Insect pins 0.15, 0.20 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:83px;">Austerlitz</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">No catalogue #</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">0.15 mm for pinning brain and spinal cord; 0.20 mm for the body</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">7 ml HDPE Scintillation Tubes with Caps</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">03-337-1</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:64px;">Paraformaldehyde 16%</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Science (EMS)</td>
			<td style="width:64px;">19210</td>
			<td style="width:71px;">Dilute to 4% in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complete spinal cord injury and brain dissection protocol for subsequent wholemount in situ hybridization in larval sea lamprey

Après une lésion complète de la moelle épinière, la lamproie marine dans un premier temps sont paralysés en dessous du niveau de sectionnement. Cependant, ils récupèrent locomotion après plusieurs semaines, ce qui est accompagné par régénération à courte distance (quelques mm) des axones et des axones spinaux propriospinaux saillie du tronc cérébral. Parmi les 36 grands neurones spinaux saillie identifiables, certains sont bons régénérateurs et d&#39;autres sont mauvaises régénérateurs. Ces neurones peuvent le plus facilement être identifiés dans les préparations wholemount SNC. Afin de comprendre les mécanismes neuronaux intrinsèques qui favorisent ou inhibent la régénération axonale après une lésion du système nerveux central chez les vertébrés, nous déterminons les différences d&#39;expression génique entre les bons et les mauvais régénérateurs, et comment l&#39;expression est influencée par la moelle sectionnement de la moelle. Cet article illustre les techniques pour le logement des larves et des adultes lamproies récemment transformées en réservoirs d&#39;eau, la production de sections transversales de la moelle épinière complets sous vision microscopique, et la préparation de brain échantillons entiers et de la moelle épinière pour l&#39;hybridation in situ. En bref, les animaux sont maintenus à 16 &#160; ° C et anesthésiés dans 1% de benzocaïne dans lamproie Ringer. La moelle épinière est sectionnée avec iridectomie ciseaux par une approche dorsale et l&#39;animal est autorisé à récupérer dans les réservoirs d&#39;eau douce à 23 ° C. Par hybridation in situ, les animaux sont reanesthetized et le cerveau et la moelle éliminés par un abord dorsal.

Comme un exemple des résultats qui peuvent être obtenus en utilisant cette méthode, des images représentatives de cerveaux wholemounted montrant l&#39;expression des transcrits néogénine dans les neurones identifiables de la moelle épinière saillie de contrôle et 2 semaines après la lésion larves de lamproie de mer sont présentés dans la figure 2. Les lecteurs sont invités à une étude précédente 6 rapports de la relation entre l&#39;expression de la néogénine après un sec...

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Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d&#39;autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l&#39;hybridation in situ.

Spinal Cord Injury complète et cerveau Protocole Dissection pour Wholemount suite<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans des larves de la lamproie marine

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

9.8K vues.  University of Edinburgh.  Les lamproies récupérer locomotion après une lésion complète de la moelle épinière. Cependant, certains neurones spinaux en saillie sont de bons régénérateurs et d'autres non. Cet article illustre les techniques de larves logements de la lamproie marine (et les adultes récemment transformées), la production complètes transections de la moelle épinière et le cerveau wholemount préparation et la moelle épinière pour l'hybridation in situ....

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

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Neurosciences

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Double fluorescence In situ</emHybridation> dans des coupes de cerveau frais

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord Transection dans le poisson zèbre larvaire

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Une<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induite par laser Spinal Cord Injury modèle pour évaluer les mécanismes de la dégénérescence axonale dans en temps réel

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

poisson zèbre<em&gt; In Situ</em&gt; Préparation à la moelle épinière électrophysiologiques Les enregistrements de la colonne vertébrale et sensorielle motoneurones

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Livraison intra-artérielle de cellules souches neuronales au cerveau du rat et de la souris : application à l’ischémie cérébrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induction d’une lésion complète de la moelle épinière de type transection chez la souris

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...