Ce travail a été financé par l&#39;Institut national de recherche dentaire et craniofaciale (NIDCR) F32 subvention (DE021929) à JLF et une subvention DE016402 NIDCR R01 à RAS

1. Préparer tungstène Aiguilles <ol><li> Couper une tige de tungstène en deux à l&#39;aide des coupe-fils de telle sorte que la tige ne se déforme pas. </li><li> Enfiler la tige à travers l&#39;extrémité effilée de 5 3/4 en verre borosilicate pipette Pasteur. </li><li> Laissant environ 3/4 dans du collage de la tige hors de la vitre, d&#39;adhérer à la tige de l&#39;embout de pipette avec un petit cordon de &quot;adhésif thermofusible&quot; (HMA), qui est le bâton de colle utilisée pour un pistolet à colle. Le HMA devrait être rapidement fondu dans une flamme d&#39;alcool, en prenant soin de ne pas brûler la colle et générer de la fumée noire. </li><li> En utilisant une paire de forceps, plier l&#39;extrémité de la tige de tungstène (environ 1/4 à partir de l&#39;extrémité du haut) jusqu&#39;à un angle de 45 ° est atteinte. </li><li> En tenant la pipette Pasteur, déposer environ 1/8 dans la pointe de la tige de tungstène dans la flamme d&#39;un chalumeau au propane. Maintenez la pointe stable et exactement perpendiculaire à la flamme. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la flamme du moment où un minuscule point orange de tungsdix mouches hors de l&#39;aiguille. </li></ol> 2. Préparer Spemann Pipettes <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un bec Bunsen, chauffer le bout étroit d&#39;une pipette Pasteur que le verre peu au-delà du cône commence à fondre. Retirer du feu et tirez jusqu&#39;à ce que la pointe de la pipette devient étanche. Assurez-vous qu&#39;il reste une partie de la partie conique qui a un diamètre extérieur d&#39;environ 0,7-1,0 mm. Briser la fin bouclé environ 4 cm du cône. </li><li> Attacher environ 2 pieds (60 cm) du tube en caoutchouc à l&#39;échelle (ouverte) extrémité de la pipette. Souffler sur l&#39;autre extrémité du tube en caoutchouc de sorte que l&#39;air ne puisse passer à travers la partie effilée de la pipette Pasteur. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cylindre de propane avec un chalumeau à flamme crayon attaché, chauffer une zone ovale d&#39;un côté de la pipette juste en dessous du début de la conicité. Souffler de l&#39;air très doucement et constamment à travers le tube en caoutchouc avec une petite quantité de pression (environ la quantité de pression nécessaire pour dire le début de la letter &quot;P&quot; au niveau de la conversation). Lorsque le verre devient doux d&#39;un côté et commence à se déformer vers l&#39;extérieur, enlever rapidement la pipette de la flamme et souffler fort et stable à travers le tube de caoutchouc. Cela entraînera la partie chauffée du verre pour former une bulle en forme de saucisse qui peuvent apparaître, ce qui est bien. Si la bulle est trop petite, essayez de fusion et soufflage de nouveau le verre. La fenêtre ouverte finale dans le verre doit être d&#39;environ 0,25 po (6,35 mm) de large par 0,5 in (12,7 mm) de long. </li><li> L&#39;extrémité conique pointant vers le haut, gratter la bulle dans un conteneur de déchets de verre tout en soufflant doucement à travers le tube pour empêcher des fragments de verre de pénétrer dans la pipette. </li><li> Utilisation de la flamme de propane, brûler les bords restants de la bulle et le feu-ongles les côtés de la fenêtre ouverte. Prenez soin de ne pas faire fondre l&#39;arbre de la pipette. </li><li> En utilisant un crayon de pointe de diamant, marquer l&#39;extrémité effilée de la pipette d&#39;environ 1,25 à (30 mm) à partir de la fenêtre et rompre la pointeavec une pince de sorte que l&#39;ouverture de la pipette est coupé proprement (pipettes de rejet avec pointes cassées ou irrégulières). </li><li> En utilisant des pinces et le bord d&#39;une flamme d&#39;un brûleur à alcool, plier la partie étroite de la pipette 0,375 in (9,5 mm) de la pointe à un angle d&#39;environ 60 ° de sorte que la partie pliée est dans un plan vertical lors de l&#39;ouverture de fenêtre est à la position 01h00 pour un usage droitier et 11h00 pour l&#39;utilisation de la main gauche. Cette étape est mieux réalisée dans un projet sans boîtier. </li><li> Fire-poli la pointe en utilisant la flamme de l&#39;alcool sous un microscope à dissection. Soyez sûr de ne pas fermer la pointe mais plutôt garder la manche d&#39;ouverture et lisse sans constriction. </li><li> Couper une à une (25 mm) de morceau de tube en caoutchouc, pulvériser le morceau de tube avec 70% d&#39;éthanol, et de faire glisser le tube sur la tige de la pipette jusqu&#39;à ce que l&#39;ouverture de fenêtre est complètement recouverte. Ceci fonctionne comme le &quot;diaphragme&quot; de la pipette Spemann. </li><li> Placez une ampoule ml latex de caoutchouc 2au-dessus de la partie inférieure ouverte de la pipette. L&#39;ampoule maintient la pression négative dans la pipette Spemann. </li><li> Pour pratiquer l&#39;aide d&#39;une pipette Spemann, transférer perles de chromatographie d&#39;environ 100-200 m de diamètre à partir d&#39;un endroit marqué dans un boîte de Pétri à un endroit marqué dans un autre sous un microscope. </li><li> Pour nettoyer la pipette Spemann, retirez la poire en caoutchouc et le lieu pipette, la pointe vers le bas, dans un bécher de haut bordée de coton ou de la gaze sur le fond et rempli avec de l&#39;eau distillée et verrerie détergent. </li></ol> 3. Stériliser et incuber des oeufs <ol><li> Essuyer les œufs avec 70% d&#39;éthanol et de placer les œufs sur des plateaux d&#39;œufs en plastique. </li><li> Réglez les oeufs dans un incubateur chauffé à 37,5 ° C et 85-87%. </li><li> Incuber les oeufs jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent HH9.5, environ 26 h pour les cailles et 48 h pour le canard. </li></ol> 4. Fenêtre oeufs <ol><li> Suppression d&#39;un petit morceau de la coque extérieure de la partie supérieure de l&#39;œuf avec une pince, en prenant soin de ne pas percer la coque intérieure membrane. </li><li> En utilisant une seringue avec une aiguille 18 G par 1 pouce, percez un trou à l&#39;extrémité la plus étroite de l&#39;œuf et de retirer environ 1-2 ml d&#39;albumine. </li><li> Placez du ruban adhésif transparent sur le trou et ponction marque dans la coque. </li><li> Couper une «fenêtre» le long de la surface supérieure de l&#39;œuf (par la bande transparente) avec des ciseaux courbes. </li></ol> 5. Visualisez embryons et préparer à la chirurgie <ol><li> Avec une tige de verre, brosser doucement une petite quantité de rouge neutre (0,02 g / ml dans BSS de Hank) sur l&#39;embryon. </li><li> Couper la membrane vitelline et le tirer sur l&#39;embryon en utilisant une aiguille de tungstène flamme aiguisé. </li><li> Re-sceller l&#39;œuf en plaçant du ruban adhésif transparent sur la fenêtre. </li></ol> 6. Séparer le tissu du donneur de l&#39;embryon des bailleurs de fonds <ol><li> Retirer le ruban de la fenêtre sur l&#39;œuf de l&#39;embryon donneur. </li><li> Pour couper le pli neural de l&#39;ectoderme adjacent de l&#39;embryon donneur, faire des fentes sur les deux sides du tube neural, à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène flamme aiguisé (fabriqué comme décrit ci-dessus). </li><li> Ensuite, couper à travers le tube neural au antérieure et postérieure de la greffe niveaux souhaités et séparer le greffage du reste du tube neural. </li><li> Retirer le pli neural à partir de l&#39;embryon de donneur en utilisant soit une pipette Spemann ou tout autre type de micro-pipette. </li><li> Ensuite, retirez la bande de la fenêtre sur l&#39;œuf hôte et utiliser la pipette Spemann de placer le donneur de neurones fois aux côtés de l&#39;embryon hôte adjacente à la région du tube neural qui recevra la greffe. </li></ol> 7. Séparer le tissu de l&#39;hôte et de la transplantation du tissu du donneur <ol><li> Séparer le pli neural du tube neural de l&#39;embryon hôte, comme cela se fait avec le donateur. Prendre soin d&#39;enlever un greffon de taille égale que le tissu du donneur. </li><li> Poussez doucement ce tissu hôte loin de l&#39;embryon. </li><li> Puis, avec une aiguille de tungstène contondant ou le bout arrondi d&#39;un kmcropipette, se déplacer légèrement le pli neural donneur dans le tube neural d&#39;accueil, le maintien des orientations antéro-postérieur et dorso-ventral appropriés. Assurez-vous que la greffe est niché dans le long des côtés, mais veillez à ne pas pousser ou d&#39;endommager les tissus sous-jacents. Pour aider à garder une trace de la note d&#39;orientation de l&#39;original tout asymétrie dans le tissu du donneur ou coloration différentielle du rouge neutre. Nous avons également photo-document, l&#39;embryon de donneur avec le tissu excisé accompagnant, ainsi que la chimère immédiatement après la chirurgie. </li><li> Une solution saline stérile doit être ajouté à l&#39;oeuf, si l&#39;embryon hôte montre des signes d&#39;assèchement. </li><li> Maintenant, soigneusement re-joint et étiqueter l&#39;œuf, et doucement revenir à un incubateur d&#39;humidité élevé (70-80%) où l&#39;embryon chimérique peut se développer jusqu&#39;au stade désiré pour l&#39;analyse. </li></ol> 8. Collection de chimères <ol><li> Soyez sûr de recueillir des embryons chimériques dans fraîchement fixateur de froid Serra et les placer immédiatement sur un rocker à 4 ° C pour une fixation O / N. Cela permettra une détection plus sensible des cellules de caille avec l&#39;anticorps anti-caille. </li><li> Pour les analyses d&#39;expression génique par RT-qPCR, congeler les embryons directement dans l&#39;azote liquide avant l&#39;extraction de l&#39;ARN. </li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

La crête neurale est une population de cellules embryonnaires transitoires qui migre intensivement dans tout l&#39;embryon et se différencie en divers types de cellules, y compris les chondrocytes et les ostéoblastes, qui contribuent au squelette cranio-facial. Transplantation crête neurale dans le système chimère caille-canard a grandement contribué à notre compréhension des interactions de tissus et les voies de signalisation qui régulent le développement du squelette cranio-facial. Toutefois, étant donné le vaste potentiel de la crête neurale également générer des cellules musculaires lisses, les adipocytes, les mélanocytes, les cellules de Schwann et les neurones, le système de chimère caille-canard a un énorme potentiel pour de futures applications, en particulier en liaison avec l&#39;évolution rapide de la biologie des cellules souches et la médecine régénérative. Depuis la caille et le canard sont deux espèces élevées dans le commerce, un approvisionnement d&#39;œufs fécondés relativement peu coûteux est disponible à partir d&#39;une variété de fermes. Ainsi, cette technique doit être accessible à rechercsienne opérant dans un large éventail de budgets et de l&#39;espace de l&#39;installation. Bien que cette technique est très puissant, il reste plusieurs limitations. Comme d&#39;autres techniques chirurgicales, la qualité et la viabilité des chimères caille-canard s&#39;appuient sur les compétences chirurgicales du chercheur, et par conséquent, il n&#39;y aura plus de variation inter-et intra-individuelle entre les expériences que par rapport à d&#39;autres modèles, comme ceux utilisant la souris génétique. En outre, il existe également des variations dans les taux de développement des embryons et les étapes de individuelles qui contribue à la reproductibilité et de la réussite de chaque greffe. Embryons d&#39;oiseaux sont également très sensibles à la déshydratation et donc des étapes cruciales pendant la chirurgie incluent maintenant les niveaux de lumière faible, le temps sous le microscope à un minimum, les œufs scellées avec du ruban adhésif, autant que possible, et une forte humidité dans l&#39;incubateur post-opératoire à éviter la dessiccation. En termes de viabilité des chimères, usually entre 50-75% survivent, même si ces pourcentages peuvent diminuer plus l&#39;étape de la collecte. Dans une session typique 4-6 heures de chirurgie, un chirurgien expérimenté peut générer 10-15 chimères. Le succès des greffes dépend aussi fortement de la qualité des outils. De bons outils conduisent à plus des résultats cohérents et reproductibles. L&#39;utilisation d&#39;un chalumeau au propane pour faire des aiguilles de tungstène permet aiguilles très pointues à faire. Le type de torche utilisée fait une grande différence, car il contrôle la taille de la flamme. Affûtage électrolytique peut également être utilisé, mais cette approche ne vient même pas proche de la production d&#39;aiguilles pointu. Utiliser des tiges de tungstène au lieu de fil bobiné de telle sorte que les aiguilles peuvent être faites directement. La micropipette Spemann, tandis que beaucoup de temps et difficile à faire, est un instrument idéal pour le transfert de tissu. La pipette peut être personnalisé avec des ouvertures de différentes tailles, et peut être utilisé à plusieurs reprises. Un facteur critique pour usinga Spemann micropipette est d&#39;avoir un peu de liquide dans la pipette avant de toucher la pointe à la surface de l&#39;embryon. Une partie du fluide aura toujours s&#39;écouler lorsque le contact est établi avec la surface du bain au-dessus de l&#39;embryon. Appuyant sur la membrane permet au tissu fluide et greffe à être éjecté très précisément, alors que peu de laisser sur le diaphragme aspire doucement le greffon tissu du donneur dans la pipette. Le maintien d&#39;un peu de pression positive sur le diaphragme maintient le tissu de greffon du donneur à la pointe de la pipette pendant le transfert, et un peu de pression supplémentaire sur la membrane permet le tissu de greffon du donneur à être délibérément placé dans l&#39;hôte. Pour la protection de la pipette Spemann pendant le stockage et la stérilisation, retirer l&#39;ampoule de l&#39;extrémité large et soigneusement insérer la pointe conique dans le bulbe. Placez la pipette Spemann dans un tube à essai en verre, couvrir le dessus d&#39;une feuille d&#39;aluminium, et l&#39;autoclave avant la chirurgie. Après plusieurs pipettes sont ready à stériliser à nouveau pour la chirurgie, inverser les pipettes, les chauffer près à ébullition dans la même solution d&#39;eau distillée et verrerie détergent, puis rincer abondamment à l&#39;eau distillée. Pipettes autoclave dans leurs tubes individuels. Le tube en caoutchouc qui forme le diaphragme et la poire en caoutchouc doit être remplacé après plusieurs stérilisations ou quand ils deviennent obscurcie et rigide. La plupart des composants de ce protocole concernent l&#39;équipement dangereux. Par exemple, la procédure pour faire une Spemann Micropipette implique trois types de flammes ainsi que le chauffage, tirage, soufflage, de pliage, de coupe, de polissage et de verre. Par conséquent, de porter un équipement de protection individuelle (EPI) qui augmente la sécurité tels que des lunettes et une blouse de laboratoire est essentiel. En outre, parce que beaucoup de gens souffrent, ou ont le potentiel de se développer, allergiques aux œufs, utilisez toujours des gants lors de la manipulation des œufs. Avec ces précautions à l&#39;esprit, le système chimère caille-canard isa méthode sûre, efficace et relativement accessible qui a de nombreuses applications futures.

Le squelette facial développe à partir de la croissance et de la fusion de plusieurs processus du visage qui sont composés de la crête neurale et mésodermique mésenchyme entouré par ectodermique et endodermique couches épithéliales 1-11. Événements morphogénétiques au sein de chaque processus sont régis par des interactions de signalisation distinctes entre le mésenchyme et l&#39;épithélium entourant 12-16. Les modifications de ces interactions de signalisation et / ou de leurs effecteurs en aval contribuent à phénotypes de la maladie et peuvent aussi être utiles à l&#39;évolution du squelette cranio-facial 17, 18. Par conséquent, élucider le calendrier et la nature des interactions entre les tissus a un grand potentiel pour améliorer notre compréhension de la biologie du développement et de l&#39;évolution du squelette facial. L&#39;utilisation d&#39;embryons chimères pour étudier les interactions du tissu a une longue histoire dans la biologie du développement. Cette approche a été lancée par Hans Spemann et son laboratoirequi a découvert embryonnaires «organisateurs» par la transplantation de tissus entre les embryons de différentes espèces d&#39;amphibiens. Spemann était un maître des techniques micro-chirurgicales dont la main-compétences ont été complétées par son point d&#39;outils spécialisés, notamment la pipette Spemann. Viktor Hamburger était un étudiant de troisième cycle dans le laboratoire de Hans Spemann à Fribourg durant les années 1920, ce qui est quand les expériences de transplantation originaux qui ont conduit à un prix Nobel de Spemann ont été réalisées. Lorsque Hamburger passé à l&#39;Université de Washington à St. Louis en 1935, il a détaillé le processus de fabrication d&#39;une micropipette Spemann dans son Manuel de l&#39;embryologie expérimentale 19. Drew Noden était un étudiant de troisième cycle dans le laboratoire de Hamburger à l&#39;Université de Washington jusqu&#39;en 1972. Après avoir déménagé à l&#39;Université du Massachusetts, Amherst, puis à l&#39;Université de Cornell, Noden continué la fabrication et l&#39;utilisation de micropipettes Spemann pour ses greffes chirurgicales impliquant des chimères caille-poulet. &amp;# 160;. Même si un étudiant de troisième cycle, l&#39;un des auteurs (Rich Schneider) formés avec Drew Noden à l&#39;Université Cornell de 1995 à 1998 le protocole suivant pour prendre une micropipette Spemann est basé sur des descriptions écrites par Hamburger et Noden, et comprend les modifications ultérieures apportées par Schneider. L&#39;utilisation des chimères caille-poulet pour l&#39;étude du développement cranio-facial et surtout pour comprendre les contributions des cellules de la crête neurale a été lancée par Noden et par Le Douarin au début des années 1970, a examiné dans Le Douarin et al 20. Cette approche a été largement adopté dans de nombreuses études et de nombreux autres chercheurs 1, 4, 5, 21-38. Les taux équivalents de la croissance et de la morphologie de la caille et le poussin font des greffes en leur sein idéal pour l&#39;étude du destin cellulaire et de la lignée de traçage. Toutefois, en raison des similitudes entre les cailles et poussin, changements morphologiques induced par les cellules du donneur sont difficiles à déchiffrer. En revanche, d&#39;autres systèmes chimères aviaires ont inclus canard domestique comme un moyen d&#39;étudier les mécanismes qui font embryons anatomiquement distincts 39-50. Plus précisément, le système chimère caille-canard offre de multiples avantages pour discerner les effets du donneur sur l&#39;hôte, et vice versa. Tout d&#39;abord, caille et canard embryons sont distinctes en taille et la forme du corps, qui fournit un moyen direct pour explorer-ou donateurs mécanismes de formation de motifs spécifiques de l&#39;hôte par le dosage pour les domaines de différentiels de l&#39;expression des gènes (figures 1 A et B). Deuxièmement, caille et canard embryons ont considérablement différents taux de maturation, avec des cailles d&#39;incubation en 17 jours et le canard à couver en 28 jours. Crête neurale transplanté maintient sa vitesse de maturation intrinsèque à l&#39;intérieur de l&#39;environnement de l&#39;hôte et, par conséquent, l&#39;identification de changements temporels dans l&#39;expression des gènes, des interactions tissulaires, histogénèse et morphogenèse est possible51-57. Enfin, l&#39;anticorps anti-nucléaire caille (Q ¢ PN) permet contributions cellulaires donneur et receveur soient distingués de façon permanente les uns des autres par la reconnaissance d&#39;une protéine qui est exprimée de manière ubiquitaire dans les cellules de caille mais absente des cellules de canard.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

La génération d&#39;embryons chimères est une approche généralisée et puissant pour étudier le destin des cellules, des tissus, des interactions et des espèces spécifiques contributions au histologique et le développement morphologique des embryons de vertébrés. En particulier, l&#39;utilisation d&#39;embryons chimériques a établi l&#39;importance de la crête neurale dans la direction de la morphologie spécifique de l&#39;espèce du complexe cranio-facial. La méthode décrite ici utilise deux espèces aviaires, le canard et la caille, remarquablement différente morphologie craniofaciale. Cette méthode facilite grandement l&#39;enquête de la régulation moléculaire et cellulaire de modèle spécifique de l&#39;espèce dans le complexe cranio-facial. Expériences dans caille et canard embryons chimériques ont déjà révélé les interactions de tissus de la crête neurale médiation et les comportements de cellules autonomes qui régulent modèle spécifique de l&#39;espèce dans le squelette cranio-faciale, la musculature, et tégument. La grande diversité des produits dérivés de la crête neurale suggère un potentiel importantpour les applications futures du système chimère caille-canard pour comprendre le développement des vertébrés, la maladie, et de l&#39;évolution.

Préalablement à une analyse plus poussée, l&#39;efficacité de la greffe doit être dosé. Pour histologique, l&#39;expression morphologique ou génétique des analyses sur des échantillons de tissu, des cellules de caille doivent être détectés par immunohistochimie en utilisant un anticorps Q ¢ PN tel que décrit 36. Pour les analyses d&#39;ARN, spécifiques à l&#39;espèce contributions aux tissus d&#39;intérêt peuvent être calculées en utilisant une stratégie basée sur la PCR 58. Après l&#39;efficacité de la transplantation a été validée, d&#39;autres mesures de résultats morphologiques et moléculaires peuvent être évalués dans des chimères. Les interactions entre les donateurs cellules de la crête neurale et les tissus environnants dérivées de l&#39;hôte qui sous-tendent histogenèse et la morphogenèse du complexe cranio-facial approprié ont déjà été étudiés. En particulier, la crête neurale mésenchyme dirige morphologie spécifique de l&#39;espèce de la face 7, 13, 51, 59, modèle de plume 52, modèle de muscle 56 </s<html> jusqu&#39;à&gt;, et le cartilage 53, 57 à la régulation de l&#39;expression de gènes de l&#39;hôte. Par exemple, la crête neurale mésenchyme dicte quand formes d&#39;os dans la mandibule en régulant le temps Bmp4 expression 55. Récemment, des enquêtes ont porté sur les interactions tissulaires survenant très tôt dans le développement cranio-facial. À cet égard, des expériences utilisant des chimères caille-canard ont montré embryons hôtes influencer la migration de la crête neurale par la détermination de limites morphologiques. C&#39;est, dans les embryons chimériques Quck, les cellules de la crête neurale donneur de caille migrent dans l&#39;hôte canard mandibulaire arc dans un modèle de canard comme (figure 1D). Malgré cette contribution hôte à la taille de la population de la crête neurale, le donateur de la crête neurale continue à générer un squelette mandibulaire qui est caille-comme la taille et la forme (figure 1E). e 1 &quot;fo: contenu width =&quot; 6 po &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Quail-Canard système chimérique. (A) Quail et (B) des crânes de canard présentent des différences considérables dans la taille et la forme, et donc, sont idéales pour l&#39;utilisation d&#39;un système chimérique pour étudier le développement cranio-facial (modifié par Tokia et al. 56). (C) conception expérimentale pour générer unilatérales embryons chimériques Quck de HH9.5 caille stade appariés et d&#39;embryons de canard. Le pli neural est retiré d&#39;un côté d&#39;embryons de caille et transplantées dans des embryons de canard après une pièce équivalente du pli neural a été supprimé. (D) des cellules de caille donateurs (vert) peut être suivie dans des chimères en utilisant un anticorps anti-caille (Q ¢ PN) comme le montre la vue ventrale de HH12 embryon chimérique. (F) En mandibules Quck à HH38, la caille donateurs dérivé Meckel7, s cartilage est plus courte et plus droite que celle observée pour le dérivé de canard hôte controlatéral cartilage de Meckel, qui est plus grande et incurvée. Reproduit Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) avec la permission de Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Cet article décrit une méthode pour générer des embryons chimériques qui sont conçus pour tester les contributions spécifiques à l&#39;espèce de crête neurale et / ou d&#39;autres tissus de développement cranio-facial.

Évaluation des contributions spécifiques aux espèces Vers développement cranio-facial Utilisation chimères caille-canard

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K vues.  University of California at San Francisco.  Cet article décrit une méthode pour générer des embryons chimériques qui sont conçus pour tester les contributions spécifiques à l'espèce de crête neurale et / ou d'autres tissus de développement cranio-facial. 

Vidéo: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Développement de nouvelles applications thérapeutiques utilisant la microfluidique

Recherche

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagerie des tumeurs mammaires qui utilisent des fréquences IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Fermé protocole Culture Cell System utilisant des navires HyperStack avec la technologie des matériaux perméables au gaz

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Évaluation des propriétés de signalisation ectodermique épithéliums au cours du développement cranio-facial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation de Mesenchyme craniofaciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Une approche semi-quantitative pour évaluer la formation de biofilms utilisant le développement des colonies ridée

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversion d&#39;un test ELISA de capture à un test Luminex xMAP utilisant une méthode de dépistage d&#39;anticorps Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Évaluer murin Fonction Artère résistance à l&#39;aide myographie de pression

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...