Nous reconnaissons Amy Thomasson pour son aide à la préparation de ce manuscrit, et Fredrik Skarstedt et Ryan Christy pour leurs efforts dans la préparation de chiffres.

Avec l&#39;approbation de l&#39;Institutional Review Board, une recherche de la base de données de laboratoire électronique a été effectuée pour identifier fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) blocs représentant cas de cytomégalovirus (CMV) en gastro-intestinal (GI) biopsies diagnostiqués par histopathologie (hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) et / ou immuno-histochimie (IHC)). 1. Traitement des tissus de biopsie tissulaire FFPE GI <ol><li> Recueillir FFPE GI des blocs de tissus de biopsie pour le cytomégalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitative (qPCR). Ces blocs sont stockés à température ambiante. </li><li> Tubes pré-étiquette 1,7 ml microfuges avec numéro d&#39;identification unique du bloc. </li><li> Bloquer le volant de microtome. </li><li> Asseoir le bloc de tissu dans la pince de la cassette. </li><li> En utilisant une lame utilisé frais, aligner le bloc à l&#39;angle de couteau sur le microtome. </li><li> Réglez le microtome de couper 10 sections um d&#39;épaisseur. </li><li> Débloquez ee volant et avance le bloc vers la lame. </li><li> Couper 5 sections du bloc à 10 um d&#39;épaisseur intervalles, permettant à chaque coupe à rouler dans un rouleau de tissu. Assurez-vous que chaque rouleau contient une représentation adéquate des tissus de biopsie souhaités. </li><li> Bloquer le volant de microtome. </li><li> Avec des pinces, placer tous les 5 rouleaux de tissu dans le tube de centrifugeuse pré-étiqueté, en faisant attention à ne manipuler le défilement par la paraffine afin de réduire les risques de contamination croisée. Enclenchez le bouchon sur le tube et le replacer sur la grille. </li><li> Retirer le bloc de tissu à partir de la microtome. </li><li> Retirer et jeter la lame. </li><li> Décontaminer les surfaces ou les instruments qui ont pu entrer en contact avec le tissu précédent. </li><li> Placez une lame utilisé frais dans le porte-couteau. </li><li> Répéter les étapes 1.4 à 1.14 pour chaque bloc supplémentaire doit être traitée. Les tubes à centrifuger contenant les rouleaux de tissus peuvent être conservés à température ambiante jusqu&#39;à ce que le time de l&#39;extraction d&#39;ADN. </li></ol> 2. Extraction d&#39;ADN à partir de manuscrits de la FFPE GI biopsie tissulaire NOTE: Ce protocole est adapté de la notice du kit FFPE des tissus de l&#39;ADN d&#39;extraction (ATTENTION: se référer à la fiche de données de sécurité (FDS)). <ol><li> Ajouter 1 ml de xylène (ATTENTION: Reportez-vous à la fiche signalétique) à chaque tube de centrifugeuse de l&#39;échantillon. Fermer le couvercle et vortex vigoureusement pendant 10 secondes. </li><li> Procéder à l&#39;extraction de l&#39;ADN selon la procédure décrite dans le produit la notice du fabricant avec les modifications suivantes. </li><li> Tout d&#39;abord ajouter 6 ul du contrôle interne (IC) à chaque tube de centrifugeuse. <ol><li> Suite à l&#39;ATL / protéinase K lyse incubation à 56 ° C pendant 1 h, incuber à 99 ° C pendant 30 minutes, au lieu de 90 ° C pendant 1 heure. </li><li> Au cours de la dernière étape d&#39;élution de l&#39;ADN, ouvrir soigneusement le couvercle de la colonne de purification d&#39;ADN et d&#39;appliquer 50 ul / eau RNase-free DNAse distillée au centre de la membrane, plutôt que buffer ATE. REMARQUE: Reportez-vous à la notice pour le stockage et la préparation des réactifs appropriés. ADN doit être extrait à partir de tous les 5 rouleaux de FFPE. Effectuez toutes les étapes de centrifugation à température ambiante (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR pour le CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) Procédure <ol><li> Générer une feuille de calcul Excel pour l&#39;analyse PCR CMV terme. Cette feuille de calcul Excel calcule le montant total de chaque réactif nécessaire pour faire le mixage de maître avec Mg. Il multiplie la quantité de chaque réactif nécessaire par échantillon (voir la liste ci-dessous) fois le nombre d&#39;échantillons et des contrôles plus un (pour compenser la perte due à la pipette). <ol><li> Inclure les réactifs suivants dans chaque réaction de PCR dans le montant indiqué: Réactif0; Montant par échantillon CMV LC Master Mix flacon 12,5 pi Solution jaune mg flacon 2,5 pi Le volume total de 15,0 pi </li></ol></li><li> Inclure dans chaque test, exécuter une eau ou pas de contrôle de cible (NTC), témoin négatif, un contrôle positif faible, un contrôle positif élevé, et soit QS3 ou QS4, et tous les échantillons de patients. Les capillaires doivent être mis en place dans cet ordre. </li><li> Obtenir le refroidissement du bloc spécifique à l&#39;instrument PCR en temps réel qui est stocké à 4 ° C. Placer les tubes capillaires appropriés dans le bloc de refroidissement. Ne touchez pas la surface des tubes capillaires. Toujours porter des gants lors de la manipulation des capillaires. </li><li> Mettre en place toutes les réactions en chaîne de la polymérase dans une hotte propre pas contaminés par l&#39;amplification de productionts. <ol><li> Retirer le bon nombre de flacons de maître du kit PCR pour tester tous les échantillons de patients, plus 5 contrôles. Laissez les flacons de maître, solution de Mg, et PCR qualité dégel de l&#39;eau dans le bloc de refroidissement. Chaque flacon de maître contient les réactifs suffisants pour 12 tests. </li><li> Vortex doucement les flacons de maîtres et rapide les faire tourner dans la centrifugeuse à la vitesse maximale. </li><li> Mélanger le contenu de chaque flacon maître dans un flacon, et vortex doucement à nouveau. </li><li> Combiner le mélange maître et solution de Mg dans les montants indiqués sur la feuille de PCR dans un seul tube à centrifuger stérile. </li><li> Mélanger doucement et aliquote de 15 ul de mélange maître avec Mg dans chaque tube capillaire, le capillaire sauf en position 5, qui est pour l&#39;étalon de quantification (QS). </li></ol></li><li> Déplacer le bloc de refroidissement contenant les tubes capillaires et de mélange maître avec le Mg à partir de la hotte propre à une hotte de traitement. </li><li> Ajouter 2 ul de contrôle interne (IC) à 30 pi restants de maîtremélanger avec Mg. Mélanger délicatement et aliquote de 15 ul dans le capillaire en position 5 (position pour le QS). </li><li> Introduire à la pipette 10 ul d&#39;eau, le contrôle de l&#39;ADN, ou l&#39;ADN de l&#39;échantillon dans le tube capillaire appropriée. Boucher les tubes capillaires à l&#39;aide de l&#39;outil de coiffage. </li><li> Prenez refroidissement bloc / échantillons de l&#39;instrument PCR en temps réel. </li></ol></li><li> Instrument programmer la PCR en temps réel (voir le tableau 1) </li><li> Amplification et détection effectuées sur l&#39;instrument PCR en temps réel <ol><li> Connectez-vous sur l&#39;ordinateur </li><li> Double-cliquez sur l&#39;icône de l&#39;appareil et connectez-vous au logiciel. </li><li> Mettez l&#39;instrument PCR en temps réel </li><li> Cliquez sur &quot;CMV / EBV&quot; de l&#39;écran avant. </li><li> Suivez les instructions de l&#39;assistant macro. </li><li> Cochez la case pour lancer un auto-test lorsque vous êtes invité par le logiciel. Un auto-test doit être effectué une fois par jour l&#39;instrument est en cours d&#39;utilisation. </li><li> Nommez le terme. </li><li> Réglez le nombre d&#39;échantillons situé dans le lef supérieuret coin de la page à la somme des contrôles et des patients inclus dans le terme et entrer le numéro d&#39;identification de chaque échantillon de patient. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Sous la rubrique «Type d&#39;échantillon&quot;, affecter le type approprié de l&#39;échantillon pour la norme. </li><li> Tapez les concentrations attendues pour la norme de quantification (QS). </li><li> Retirer les tubes capillaires à partir du bloc refroidisseur et les placer dans la position correspondante dans le carrousel (bloc de refroidissement échantillon N ° 1 doit être placé en position n ° 1 sur le carrousel, etc.) </li><li> Placez le carrousel en centrifugeuse et presse le début de l&#39;instrument. </li><li> Ouvrez la centrifugeuse et enlever le carrousel. </li><li> Placer le carrousel dans l&#39;instrument PCR en temps réel. Fermez le couvercle. </li><li> Appuyez sur &quot;Start Run&quot;. </li><li> L&#39;instrument PCR en temps réel vérifie chaque position pour un échantillon. Ne pas s&#39;éloigner de l&#39;instrument jusqu&#39;à ce que ce contrôle a été achevée, surtoutparticulier si l&#39;un des capillaires n&#39;est pas dans le carrousel. L&#39;instrument noter cela et se demander si le terme doit être poursuivi. Répondez oui avant de partir. </li><li> Une fois la course terminée, fermez le rapport qui a été généré. </li><li> Cliquez sur &quot;Absolute Quantification&quot;. </li><li> Cliquez sur la flèche à côté de Couleur de rémunération. </li><li> Cliquez sur &quot;Choisir rémunération Couleur» dans le menu déroulant. </li><li> Choisir le fichier de compensation de couleur le plus courant à appliquer à la course. </li><li> Cliquez sur OK lorsque la boîte s&#39;ouvre. </li><li> Cliquez sur la flèche de la courbe standard. </li><li> Sélectionnez «usage externe» dans le menu déroulant. </li><li> Sélectionnez le fichier le plus récent de la courbe de niveau externe, puis cliquez sur OK. </li><li> Regardez chaque courbe dans le menu Absolute Quantification de veiller à ce que les courbes sont présents et pas la ligne plate, si une concentration est affectée. L&#39;Absolu quantification pour la 705/Back 530 est automatiquement analysé. </li></ol></li><li> Qucontrôle alité <ol><li> Générer une nouvelle courbe standard chaque fois un nouveau numéro de lot de réactifs est reçu, ou tous les six mois, selon la plus fréquente. </li><li> Ajouter 10 ul de chaque norme pour le mélange de maître avec Mg. Considérez les normes fournies avec le kit que l&#39;ADN extrait précédemment. </li><li> Ajouter 1 pl de contrôle interne pour chaque norme au mélange de maître avec Mg utilisée pour générer la courbe standard afin d&#39;assurer une quantification précise. Ne pas ajouter IC au mélange de maître avec Mg pour le contrôle sans matrice (NTC). </li><li> Préparer un NTC et trois répétitions de quantification normes QS 4, 3, 2, 1, et une dilution 1:10 de QS4 pour la course à générer la courbe standard, pour un total de 16 points de données. </li><li> Sélectionnez &quot;répétition de&quot; dans le menu déroulant des normes répétées </li><li> Choisissez canal 530/back aucun et tourner sur la rémunération des couleurs lors de l&#39;analyse de la course, </li><li> Sous &quot;Courbe standard (En Run)&quot;, sélectionnez &quot;enregistrer sous exinterne &quot;et le nom de la courbe. Entrez le commentaire &quot;appliquée comme courbe standard&quot; lors de l&#39;enregistrement. </li><li> Graphiquement les résultats. Le coefficient de linéarité qui en résulte doit être ≥ 0,81. </li><li> Pour les courses quotidiennes, inclure une copie de QS3 ou QS4 comme un contrôle dans la course. La courbe de courant standard externe peut être importé dans la course au cours de la phase d&#39;analyse. </li><li> Exécuter les contrôles: aucun contrôle de l&#39;ADN, le contrôle négatif, faible, et les contrôles positifs élevés. Charge virale prévue est déterminée et ajustée pour chaque fournisseur et le numéro de lot. </li><li> Ajouter un IC à chaque échantillon et à contrôler au cours de l&#39;extraction de l&#39;ADN. </li><li> Si l&#39;un des contrôles tombent hors de portée, enregistrer les résultats inacceptables et reporter le test pour le dépannage. </li></ol></li><li> Fréquence des contrôles <ol><li> Inclure dans chaque course: un NTC, faible contrôle négatif, positif, positif élevé, et standard. </li></ol></li></ol> REMARQUE: Les limites acceptables pour les contrôles. Aucun pic devraient être observentd pour le pas de modèle (CNT) et les contrôles négatifs. Pics doivent être présents dans le canal 530 et une charge virale attendus sont déterminés et ajustés pour chaque fournisseur et le numéro de lot pour les contrôles positifs basse et haute.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

De nombreux procédés de laboratoire sont disponibles pour le diagnostic de cytomégalovirus (CMV), y compris la sérologie, la culture virale, les dosages de virémie moléculaires, l&#39;histologie de matériel de biopsie, et, comme démontré récemment, des dosages moléculaires fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) biopsie 5,6 tissulaire. Sérologie, une fois l&#39;un des piliers de diagnostic, identifie seulement de manière fiable l&#39;exposition et ne correspond pas bien avec l&#39;infe...

Interprétation du cytomégalovirus (CMV) dans les échantillons cliniques est très important. Le CMV est un membre de la sous-famille des herpesvirus Betaherpesvirinae. Semblable à d&#39;autres virus de l&#39;herpès, le CMV a la capacité d&#39;établir une infection persistante ou latente caractérisé par un manque de réplication virale active 1. Réactivation du virus peut se produire pendant les périodes de stress ou autre immunosuppression, conduisant à une réplication virale active caractérisée par virion de presse, qui peut être accompagné par des manifestations de la maladie 2-4. Gastro-intestinal (GI) symptômes de la maladie à CMV comprennent souvent des douleurs abdominales et / ou des selles sanglantes 1. Le diagnostic de la gastro-entérite à CMV par histologie utilise de l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine (H &amp; E) pour identifier CMV inclusions virales. Dans les cas où la suspicion clinique est forte pour l&#39;instant aucun inclusions évidentes sont observées, l&#39;immunohistochimie (IHC) est fréquemment utilisé comme une méthode de test complémentaire. Cependant, IHCpeut également être entravée par apparaissant motifs de coloration cellulaire non-classiques rares (équivoques), ce qui rend l&#39;interprétation difficile (figure 2) 5. Il a cherché à utiliser l&#39;ADN extrait d&#39;fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu GI de biopsie et quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) pour détecter le CMV dans des biopsies de GI. Cette technique s&#39;est révélée être utile dans la détection de CMV dans des biopsies de GI, et est particulièrement utile dans les cas ambigus de coloration IHC 5,6. En outre, qPCR a également été montré une bonne corrélation avec les données de test de CMV clinique supplémentaire quand il est disponible 6. L&#39;utilisation de qPCR dans la détection de CMV peut conduire à un diagnostic plus précoce et le traitement dans les cas où la suspicion clinique pour le CMV est élevé, mais H &amp; E et le CMV IHC sont négatifs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

Il est essentiel d&#39;identifier le cytomégalovirus (CMV) dans le tractus gastro-intestinal (GI) chez les patients immunodéprimés, compte tenu de leur plus grand risque de développer une infection grave. Beaucoup de méthodes de laboratoire pour la détection de l&#39;infection à CMV ont été développés, notamment la sérologie, culture virale, et des méthodes moléculaires. Souvent, ces méthodes reflètent une atteinte systémique par le CMV et ne permettent pas d&#39;identifier précisément l&#39;implication du tissu local. Par conséquent, la détection de l&#39;infection par le CMV dans le tractus gastro-intestinal est souvent fait en histologie classique de tissu de biopsie. Hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration en conjonction avec l&#39;immunohistochimie (IHC) sont restés les piliers de l&#39;examen de ces biopsies. H &amp; E et IHC entraînent parfois des atypiques (équivoques) motifs de coloration, ce qui rend l&#39;interprétation difficile. Il a été montré que la polymerase chain reaction quantitative (qPCR) pour le CMV peut être exécutée avec succès sur, les tissus de biopsie inclus dans la paraffine (FFPE) fixés au formol pour les trèshaute sensibilité et spécificité. L&#39;objectif de ce protocole est de démontrer comment effectuer les essais qPCR pour la détection du CMV dans FFPE tissu de biopsie dans un laboratoire clinique. Cette méthode est susceptible d&#39;être d&#39;une grande utilité pour les patients en cas de coloration équivoque pour le CMV dans des biopsies de GI.

Un total de 228 blocs de tissus ont été testés par quantitative en chaîne par polymérase (qPCR), qui était composé de 91 cytomégalovirus (CMV) de cas positifs en fonction de l&#39;histologie et immunohistochimie positive (IHC), 18 avec équivoque CMV IHC, et 79 contrôles négatifs. Comme illustré sur la figure 2, les cas positifs seraient CMV CMV ont démontré inclusions virales typiques (A) et / ou la coloration IHC positif (B). Cas équivoques auraient dém...

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR est une méthode sensible et rapide pour la détection de l&#39;ADN cytomégalovirus dans la formaline fixe, inclus dans la paraffine des tissus de biopsie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K vues.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Vidéo: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

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Biologie

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation pour les tissus rénaux fixés au formol

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolement rapide et la purification des mitochondries pour la transplantation par la dissociation des tissus et différencié Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...