Nous avons présenté le premier modèle de culture cellulaire pour l’infection par le polyomavirus cellulaire Merkel. Le protocole comprend l’isolement des fibroblastes cutanés, la préparation de l’infection par le virus MCPyV, la coloration immunofluorescente et l’hybridation in situ fluorescente. Ce protocole permet d’étudier le cycle infectieux mcpyv et les interactions avec les cellules hôtes tout en évitant les artefacts associés à la sur-expression des gènes viraux.
Pour commencer, utilisez une paire de ciseaux pour couper la graisse et le tissu sous-cutané du contrepuce néonatal humain. Couper l’échantillon de peau en deux ou en quartiers. Placez le tissu en 5 millilitres de 10 milligrammes par millilitre dis-based II NPBS, complété par antibiotique-antimycotique.
Incuber à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez des forceps de microdissection pour séparer soigneusement l’épiderme des couches cutanées dans un plat de 10 centimètres. Transférez le tissu cutané résultant à un tube conique de 15 millilitres contenant 5 millilitres de 2 milligrammes par collagène millilitre de type IV dans le milieu FBS-libre complété avec antibiotique-anitmycotique.
Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % avec des secousses périodiques pendant quatre à six heures, jusqu’à ce qu’il ne reste que quelques agrégats de tissus macroscopiques. Après cela, utilisez une pipette de 10 millilitres pour pipette la solution de l’échantillon de haut en bas vigoureusement 10 fois, libérant des cellules simples du derme. Centrifugeuse à 180 g pendant cinq minutes et jeter le supernatant.
Plaquez les cellules dissociées dans le milieu complété de DMEM. En fin d’après-midi ou en soirée, graines 6 millions de cellules 293TT28 dans un plat de 10 centimètres contenant un milieu DMEM complété. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain matin, assurez-vous que les cellules sont environ 50% confluent, puis transfect les cellules avec 66 microlitres de réagent transfection, 12 microgrammes de MCPyV re-ligated isoler L17B ADN, 8,4 microgrammes de ST expression plasmide pMtB, et 9,6 microgrammes d’expression LT plasmide pADL. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lorsque les cellules transfectées sont presque confluentes, trypsiniser les cellules et les transférer dans un plat de 15 centimètres pour une expansion continue.
Lorsque ce plat devient presque confluent, transférer les cellules dans trois nouveaux plats de 15 centimètres. Lorsque ces nouveaux plats deviennent presque confluents, récoltez les cellules telles qu’elles sont décrites dans le protocole textuel. Centrifugeuse à 180 g à température ambiante pendant cinq minutes.
Retirez ensuite le supernatant et ajoutez un volume cellulaire de magnésium DPBS. Ajouter 25 sulfate d’ammonium micromolaire, suivi de 0,5 % triton X-100, 0,1 % benzonase et 0,1 % d’un DNAse dépendant de l’ATP. Bien mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, refroidir le mélange sur la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 0,17 volume de chlorure de sodium. Mélanger et incuber sur la glace pendant encore 15 minutes.
Centrifugeuse à 12 mille g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Si le surnatant n’est pas clair, inversez doucement le tube et répétez la centrifugation. Après cela, transférer le supernatant dans un nouveau tube.
Resuspendez la pastille dans 1 volume de DPBS complété par 0,8 grains de beauté de chlorure de sodium. Centrifugeuse à 12 mille g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Si le surnatant n’est pas clair, inversez doucement le tube et répétez la centrifugation.
Mélanger à nouveau les deux supernatants et la centrifugeuse à 12 000 g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, utilisez une pipette pour déposer des gradients d’iodixanol dans des tubes polyallomères à paroi mince de cinq millilitres comme indiqué dans le protocole de texte. Chargez 3 millilitres du supernatant contenant du virus clarifié au-dessus du gradient iodixanol préparé.
Centrifugeuse avec un rotor SW 55 Ti à 234 mille g et à 16 degrés Celsius pendant 3,5 heures, en s’assurant de régler l’accélération et la décélération à ralentir. Une fois l’ultracentrifugation terminée, recueillir 12 fractions dans des tubes siliconés. Après le maintien et le détachement des cellules, à 10 millilitres de DMEM complété et F12 moyen au plat.
Transférer la solution cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Centrifugeuse à 180 g pendant deux minutes. Jetez le supernatant et suspendez les cellules dans le milieu complété de DMEM et de F12 à une densité cellulaire entre 20 mille et 40 mille cellules par millilitre.
Ensuite, graines 200 ou 400 microlitres de la suspension cellulaire complétée par 1 milligramme par millilitre de collagène de type IV dans chaque puits d’une plaque de puits 24 ou 96, respectivement. Retirer le bouillon de viron MCPyV du congélateur de moins 80 degrés Celsius et le placer sur la glace pour décongeler. Ajouter 1 milliard d’équivalents génome viral de virions MCPyV par microlitre d’iodixanol pour chaque 2500 à 5000 cellules infectées.
Appuyez doucement sur le côté de la plaque et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Tout d’abord, fixer les cellules sur des feuillets de couverture avec 4%PFA dans PBS pendant 10 minutes, puis laver les feuillets de couverture deux fois avec PBS et les traiter avec 70% d’éthanol à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour perméabiliser les cellules. Le lendemain, remplacez l’éthanol par un tampon d’hydratation de sonde et incubez à température ambiante pendant 60 minutes pour pré-hybrider les échantillons.
30 minutes avant la fin de l’incubation de la pré-hybridation, diluer les sondes dans la solution d’hybridation de la sonde à une dilution de 1:500 et incuber à 45 degrés Celsius. Lorsque les incubations sont terminées, pipette environ 10 microlitres du mélange de sonde diluée sur une lame de microscope pour chaque glissement de couverture. Placez chaque côté cellule de glissement de couverture vers le bas sur sa gouttelette respective de mélange d’hybridation.
À l’aide d’une quantité généreuse de ciment en caoutchouc, sceller les bords et l’arrière de chaque couvercle glisser sur sa glissière. Réglez la glissade sur le côté plat d’un bloc thermique et chauffez-les à 94 degrés Celsius pendant trois minutes. Après cela, transférez la glissière dans une chambre humidifiée et incubez-les à 45 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, utilisez des forceps pour peler soigneusement le ciment en caoutchouc. Placez le couvercle glisse côté cellule vers le haut dans les puits d’une plaque de 24 puits et lavez-les avec un tampon de lavage de sonde trois fois à température ambiante. Ajouter 200 microlitres de tampon d’amplification à chaque puits contenant un glissement de couvercle et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 minutes.
Pendant ce temps, anneal chacun des deux épingles à cheveux oligonucléotide étiquetés reconnaissant les sondes dans des tubes PCR séparés en les chauffant à 94 degrés Celsius pendant 90 secondes, puis en les refroidissant à température ambiante pendant 30 minutes. Mélanger les épingles à cheveux ensemble dans un tampon d’amplification à une dilution de 1:50. Ensuite, étirer le film de paraffine sur la face ouverte d’un couvercle de 12 plaques de puits pour faire une surface pour la réaction d’amplification.
Pipette 50-100 gouttelettes microlitres du mélange d’épingle à cheveux sur le film de paraffine pour chaque glissement de couverture. À l’aide de forceps, retirez soigneusement chaque glissement de couvercle de la solution de pré-amplification et touchez le bord à un lingette jetable poreuse pour sécher. Déposer chaque côté cellule de glissement de couverture séchée vers le bas sur une gouttelette d’amplification.
Transférer le couvercle de la plaque dans une chambre humidifiée et incuber toute la nuit à température ambiante et dans l’obscurité. Le lendemain, retournez les feuillets de couverture dans les puits de la plaque de puits 24. Ajouter 5X SSCT contenant du DAPI à une concentration de 0,5 microgramme par millilitre à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure.
Après cela, laver les échantillons deux fois avec 5X SSCT à température ambiante. Montez le couvercle lavé glisse sur des glissières de microscope, et utilisez un microscope inversé de fluorescence pour analyser les cellules et l’image des échantillons. Dans cette étude, une population presque homogène de fibroblastes dermiques humains est isolée.
La coloration immunofluorescente révèle que presque 100% des cellules cutanées humaines isolées sont positivement souillées pour les marqueurs de fibroblaste dermique, la vimentine, et le collagène, mais négatives pour le marqueur humain de kératinocyte de prépuce K14. Les virions MCPyV sont ensuite générées et après avoir visualisé la bande de virions MCPyV concentrées au cœur du gradient, 500 fractions de microlitres sont collectées et MCPyV qPCR est effectuée pour identifier les fractions de pointe. Des images tachées immunofluorescentes de HDFs infectés par MCPyV sont montrées ici, où les cellules qui sont LT positives, VP1 positives, ou lt et VP1 positives sont considérées positives pour l’infection de MCPyV.
Plus de 30% des cellules sont positives au LT, et plus de 10% sont VP1 positives. Les génomes mcpyv répliqués dans les cellules infectées sont détectés à l’aide du FISH HCR-ADN et d’Immunofluorescent-HCR-DNA FISH. Alors que le FISH HCR-ADN révèle la localisation de l’ADN MCPyV présent dans l’usine de réplication, les méthodes immunofluorescent-HCR-DNA FISH permettent la détection simultanée de l’ADN MCPyV et de la co-localisation des protéines LT dans les centres de réplication.
Pour atteindre la meilleure efficacité d’infection virale, il est très important que MCPyV soit concentré à au moins 2 x 10 à 8ème génome de virus par microlitre puisque l’iodoxanol est toxique pour les cellules. Après l’infection de MCPyV des fibroblastes dermiques, beaucoup d’analyses biologiques moléculaires peuvent être exécutées, y compris l’immunofluorescence, l’immunoblocage, l’immunopositivication, et l’essai qPCR-basé. Le système d’infection que nous avons décrit permet aux chercheurs d’étudier les stades de l’infection par le MCPyV comme le trafic nucléaire et l’emballage viral.
McPyV est un virus BSL-2, mais on sait peu de choses sur son potentiel de pathologie dans les quantités obtenues en laboratoire. Par conséquent, les chercheurs devraient prendre des précautions pour éviter l’exposition au virus.
