Riconosciamo Amy Thomasson per la sua assistenza con la preparazione di questo manoscritto, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy per i loro sforzi nella preparazione di figure.

Con l&#39;approvazione del Institutional Review Board, una ricerca della banca dati laboratorio elettronico è stata effettuata per identificare fissato in formalina, paraffina (FFPE) blocchi che rappresentano casi di citomegalovirus (CMV) in gastrointestinali (GI) biopsie diagnosticati dal istopatologia (ematossilina eosina (H &amp; E) e / o immunoistochimica (IHC)). 1. Tissue Processing da FFPE GI biopsia <ol><li> Raccogliere FFPE GI blocchi di tessuto per la biopsia citomegalovirus (CMV) polymerase chain reaction quantitativa (qPCR). Questi blocchi sono conservati a temperatura ambiente. </li><li> Tubi Pre-label 1,7 ml microcentrifuga con il numero di identificazione univoco del blocco. </li><li> Bloccare il volantino microtomo. </li><li> Ospitare il blocco di tessuto nel morsetto. </li><li> Utilizzando una lama inutilizzato fresco, allineare il blocco all&#39;angolo coltello sul microtomo. </li><li> Regolare il microtomo per tagliare 10 sezioni micron di spessore. </li><li> Sblocca the volantino e avanzare il blocco verso la lama. </li><li> Tagliare 5 sezioni del blocco a 10 micron intervalli di spessore, permettendo ogni taglio di rotolare in un rotolo di tessuto. Assicurarsi che ogni rotolo contiene una rappresentazione adeguata dei tessuti bioptici desiderati. </li><li> Bloccare il volantino microtomo. </li><li> Con una pinza, posizionare tutti e 5 i rotoli di tessuto in provetta da centrifuga pre-etichettati, facendo attenzione a solo manipolare il rotolo dalla paraffina, al fine di ridurre il potenziale di contaminazione incrociata. Far scattare il tappo sul tubo e rimetterlo sul rack. </li><li> Rimuovere il blocco di tessuto dal microtomo. </li><li> Rimuovere e gettare la lama. </li><li> Decontaminare le superfici o strumenti che possano essere venuti a contatto con il tessuto precedente. </li><li> Inserire una lama inutilizzato fresche nella porta coltello. </li><li> Ripetere i passaggi 1,4-1,14 per ogni blocco aggiuntivo da elaborare. I tubi microcentrifuga contenenti i rotoli di tessuto possono essere conservati a temperatura ambiente fino a quando la time di estrazione del DNA. </li></ol> 2. Estrazione DNA da Rotoli di FFPE GI biopsia NOTA: Questo protocollo è tratto dal foglietto illustrativo del tessuto kit FFPE DNA di estrazione (ATTENZIONE: fare riferimento alla Scheda Dati di Sicurezza (SDS)). <ol><li> Aggiungere 1 ml di xilene (ATTENZIONE: fare riferimento alla scheda di sicurezza) ad ogni provetta per microcentrifuga campione. Chiudere il coperchio e mescolare vigorosamente nel vortex per 10 secondi. </li><li> Procedere con l&#39;estrazione del DNA come specificamente indicato nel foglio illustrativo del produttore con le seguenti modifiche. </li><li> Primo aggiungere 6 ml di controllo interno (IC) ad ogni provetta per microcentrifuga. <ol><li> A seguito della ATL / proteinasi K lisi incubazione a 56 ° C per 1 ora, incubare a 99 ° C per 30 min, anziché 90 ° C per 1 ora. </li><li> Durante l&#39;ultima fase di eluizione del DNA, aprire con cautela il coperchio della colonna di purificazione del DNA e applicare 50 microlitri di acqua DNasi / RNasi-free distillata al centro della membrana, anziché buffer ATE. NOTA: Consultare il foglietto illustrativo per la conservazione e preparazione dei reagenti appropriati. DNA deve essere estratto da tutti e 5 i rotoli FFPE. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR per CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento <ol><li> Generare un foglio di lavoro di Excel PCR per la sessione d&#39;analisi CMV. Questo foglio di lavoro Excel calcola la quantità totale di ogni reagente necessario per rendere il master mix con Mg. Si moltiplica la quantità di ogni reagente necessario per campione (elencati di seguito) volte il numero di campioni e controlli più uno (per compensare la perdita a causa di pipettaggio). <ol><li> Comprendono i seguenti reagenti in ciascuna reazione PCR nella quantità indicata: Reagente0; Importo per campione CMV LC master mix fiala 12,5 ml Mg soluzione giallo fiala 2,5 ml Volume totale 15.0 ml </li></ol></li><li> Includere in ogni test, eseguire un acqua o nessun controllo di destinazione (NTC), controllo negativo, un controllo basso positivo, un alto controllo positivo, e sia QS3 o QS4, e tutti i campioni dei pazienti. I capillari devono essere impostati in questo ordine. </li><li> Ottenere il blocco di raffreddamento specifico per lo strumento PCR in tempo reale che viene conservata a 4 ° C. Posizionare i tubi capillari appropriate nel blocco di raffreddamento. Non toccare la superficie dei capillari. Utilizzare sempre guanti quando si maneggiano i capillari. </li><li> Impostare tutte le reazioni a catena della polimerasi in una cappa pulita, non inquinata con l&#39;amplificazione produzionets. <ol><li> Rimuovere il corretto numero di flaconcini di maestri del kit PCR per testare tutti i campioni dei pazienti, più 5 controlli. Lasciate che i flaconi master, soluzione Mg e PCR grado disgelo dell&#39;acqua nel blocco di raffreddamento. Ogni flaconcino master contiene reagenti sufficienti per 12 test. </li><li> Vortice delicatamente le fiale di master e rapido li girare nella centrifuga alla massima velocità. </li><li> Unire il contenuto di ciascun flacone maestro in un flaconcino, e agitare delicatamente di nuovo. </li><li> Unire il master mix e la soluzione Mg nelle quantità indicate nel foglio di lavoro PCR in un unico tubo microcentrifuga sterile. </li><li> Mescolare delicatamente e un&#39;aliquota di 15 ml di master mix con Mg in ogni provetta capillare, tranne il capillare in posizione 5, che è per lo standard di quantificazione (QS). </li></ol></li><li> Spostare il blocco di raffreddamento contenente i capillari e le master mix con Mg dalla cappa pulita ad una cappa di elaborazione. </li><li> Aggiungere 2 ml di controllo interno (IC) per i rimanenti 30 ml di maestromescolare con Mg. Mescolare delicatamente e aliquota 15 microlitri nel capillare in posizione 5 (posizione per il QS). </li><li> Pipettare 10 ml di acqua, controllano il DNA, o DNA campione nel tubo capillare appropriata. Tappare le provette capillari utilizzando lo strumento di tappatura. </li><li> Prendere raffreddamento blocco / campioni allo strumento PCR real-time. </li></ol></li><li> Programmare il real-time PCR Instrument (cfr. tabella 1) </li><li> Amplificazione e la rilevazione eseguite sullo strumento PCR real-time <ol><li> Accedere al computer </li><li> Fare doppio clic sull&#39;icona dello strumento e accedere al software. </li><li> Accendere lo strumento PCR real-time </li><li> Clicca su &quot;CMV / EBV&quot; dallo schermo anteriore. </li><li> Seguire le istruzioni della procedura guidata macro. </li><li> Selezionare la casella per eseguire un auto-test quando richiesto dal software. Un self-test deve essere eseguito una volta al giorno lo strumento è in uso. </li><li> Assegnare un nome alla corsa. </li><li> Regolare il conteggio del campione si trova nella LEF superioret angolo della pagina per la somma di controlli e pazienti inclusi nella corsa e inserire il numero identificativo di ogni campione del paziente. </li><li> Fare clic sulla scheda &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> In &quot;Tipo di campione&quot;, assegnare il tipo di campione appropriato per lo standard. </li><li> Digitare le concentrazioni previste per lo standard di quantificazione (QS). </li><li> Rimuovere i tubi capillari sul blocco di raffreddamento e metterli nella posizione corrispondente nella giostra (raffreddamento blocco campioni # 1 deve essere posto in posizione # 1 sulla giostra, ecc). </li><li> Posizionare la giostra in centrifuga e premere start dello strumento. </li><li> Aprire centrifuga e rimuovere la giostra. </li><li> Posizionare la giostra nello strumento PCR real-time. Chiudere il coperchio. </li><li> Premere il tasto &quot;Start Esegui&quot;. </li><li> Lo strumento PCR real-time controllerà ogni posizione per un campione. Non a piedi dallo strumento fino a quando questo controllo è stato completato, specialmentecialmente se uno dei capillari non è nel carosello. Lo strumento di notare che questo e chiedere se la corsa deve essere continuato. Rispondere di sì prima di partire. </li><li> Una volta che la corsa è completa, chiudere il report che è stato generato. </li><li> Clicca su &quot;Absolute Quantitation&quot;. </li><li> Fare clic sulla freccia accanto a Colore compensazione. </li><li> Fare clic su &quot;Select compensazione del colore&quot; dalla casella a discesa. </li><li> Scegliere il file di compensazione colore più attuale da applicare alla corsa. </li><li> Fare clic su OK quando la finestra si apre. </li><li> Fare clic sulla freccia curva standard. </li><li> Selezionare &quot;uso esterno&quot; dal menu a discesa. </li><li> Selezionare più file corrente curva standard esterno, quindi fare clic su OK. </li><li> Guardate ogni curva sotto il menu Assoluto Quantificazione per garantire che le curve siano presenti e non linea piatta, se la concentrazione è assegnato. L&#39;Assoluto quantificazione del 705/Back 530 viene analizzata automaticamente. </li></ol></li><li> Qucontrollo nalità <ol><li> Genera una nuova curva standard ogni volta che viene ricevuto un numero nuovo lotto di reagenti, o ogni sei mesi, a seconda di quale è più frequente. </li><li> Aggiungere 10 ml di ogni standard al master mix con Mg. Considerate le norme incluse nel kit come DNA precedentemente estratto. </li><li> Aggiungere 1 ml di controllo interno per ogni standard al master mix con Mg utilizzati per generare la curva standard per assicurare quantificazione accurata. Non aggiungere IC al master mix con Mg per il Control Template No (NTC). </li><li> Preparare un NTC e tre repliche di quantificazione Standards QS 4, 3, 2, 1, e una diluizione 1:10 del QS4 per la corsa per generare la curva standard, pari a 16 punti dati. </li><li> Selezionare &quot;replica di&quot; nel menu a tendina per gli standard ripetute </li><li> Scegli canale 530/back nessuno e attivare compensazione del colore quando si analizza la corsa, </li><li> In &quot;Curva Standard (In Run)&quot;, selezionare &quot;salva con nome exinterna &quot;e il nome della curva. Inserisci il commento &quot;applicato come curva standard&quot; per il salvataggio. </li><li> Rappresentare graficamente i risultati. Il coefficiente di linearità risultante deve essere ≥ 0,81. </li><li> Per le corse giornaliere, includere una copia del QS3 o QS4 come controllo nella corsa. L&#39;attuale curva standard esterna può essere importato in corsa durante la fase di analisi. </li><li> Esegui controlli: nessun controllo del DNA, di controllo negativo, bassi e alti controlli positivi. Carica virale atteso è determinato e regolato per ogni fornitore e numero di lotto. </li><li> Aggiungere un IC a ciascun campione e controllo durante l&#39;estrazione del DNA. </li><li> Se uno qualsiasi dei controlli cadono fuori portata, registrare i risultati inaccettabili e di sottoporre il test per la risoluzione dei problemi. </li></ol></li><li> Frequenza dei controlli <ol><li> Includere in ogni corsa: un NTC, alto positivo, e standard di controllo positivo negativo, basso. </li></ol></li></ol> NOTA: i limiti accettabili per i controlli. Nessun picchi dovrebbero essere osservared per il modello no (NTC) e controlli negativi. Peaks dovrebbero essere presenti nel canale 530 e carica virale attesi sono determinati e adeguati per ogni fornitore e il numero di lotto per i controlli positivi alte e basse.

<ol>
	<li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Clnical Microbiology. 2, 1558-1574 (2011).</li><li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+(CMV)+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers.">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li><li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers.">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li><li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection.">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li><li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded,+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies.">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li><li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li><li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world.">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li><li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection.">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li><li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections.">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li><li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection:+prognostic+implications+for+pregnancy.">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li><li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease.">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Molti metodi di laboratorio sono disponibili per la diagnosi di citomegalovirus (CMV), tra cui la sierologia, coltura virale, saggi viremia molecolare, istologia del materiale bioptico, e, come recentemente dimostrato, saggi molecolari di fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) biopsia 5,6 tessuto. Sierologia, una volta che un pilastro della diagnosi, identifica solo in modo affidabile l&#39;esposizione e non si correla bene con acuta infezione da CMV 7. Cultura virale, sia convenzionali ...

Interpretazione del citomegalovirus (CMV) in campioni clinici è estremamente importante. CMV è un membro della sottofamiglia Betaherpesvirinae degli herpesvirus. Analogamente agli altri herpesvirus, CMV ha la capacità di stabilire infezione persistente o latente caratterizzata da una mancanza di replicazione virale attiva 1. La riattivazione del virus può verificarsi durante periodi di stress o di altro immunosoppressione, che porta alla replicazione virale attiva caratterizzata dal rilascio di virioni, che può essere accompagnata da manifestazioni di malattia 2-4. Gastrointestinale (GI) sintomi di malattia CMV spesso includono dolore addominale e / o feci sanguinolente 1. La diagnosi di CMV gastroenterite da istologia utilizza ematossilina ed eosina (H &amp; E) per identificare inclusioni virali CMV. Nei casi in cui è alta ancora presenti inclusioni evidenti si osservano sospetto clinico, immunoistochimica (IHC) è spesso utilizzato come metodo di prova aggiunto. Tuttavia, IHCpuò anche essere ostacolata da figuranti pattern di colorazione cellulare non classici rare (equivoci), rendendo difficile interpretazione (Figura 2) 5. Si è cercato di utilizzare il DNA estratto da fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) tessuti GI biopsia e quantitativa reazione a catena della polimerasi (qPCR) per rilevare CMV in biopsie di GI. Questa tecnica ha dimostrato di essere utile nel rilevamento di CMV in biopsie GI, ed è particolarmente utile in casi di colorazione IHC equivoci 5,6. Inoltre, qPCR ha anche dimostrato di correlare bene con l&#39;aggiunta di dati di test clinici CMV quando è disponibile 6. L&#39;uso di qPCR nel rilevare CMV può portare a diagnosi precoce e il trattamento in caso di sospetto clinico per CMV è alto, ma H &amp; E e CMV IHC sono negativi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

E &#39;fondamentale individuare citomegalovirus (CMV) nel tratto gastrointestinale (GI) dei pazienti immunodepressi, data la loro maggior rischio di sviluppare infezioni gravi. Sono stati sviluppati molti metodi di laboratorio per la rilevazione di infezione da CMV, compresa sierologia, coltura virale, e metodi molecolari. Spesso, questi metodi riflettono coinvolgimento sistemico con CMV e non individuano il coinvolgimento del tessuto locale. Pertanto, il rilevamento di infezione da CMV nel tratto GI è spesso fatto da istologia tradizionale di tessuto bioptico. Ematossilina e eosina (H &amp; E) colorazione in combinato disposto con l&#39;immunoistochimica (IHC) sono rimasti i pilastri di esaminare tali biopsie. H &amp; E e IHC volte provocano atipici (equivoci) pattern di colorazione, rendendo difficile l&#39;interpretazione. E &#39;stato dimostrato che polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) per CMV può correttamente essere eseguita su fissato in formalina, biopsia dei tessuti inclusi in paraffina (FFPE) per moltoalta sensibilità e specificità. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come eseguire il test qPCR per la rilevazione di CMV nella biopsia del tessuto FFPE in un ambiente di laboratorio clinico. Questo metodo è probabile che sia di grande beneficio per i pazienti in caso di colorazione equivoca di CMV in biopsie di GI.

Un totale di 228 blocchi di tessuto sono stati testati dal quantitativo polymerase chain reaction (qPCR), che comprendeva 91 citomegalovirus (CMV) casi positivi sulla base di istologia ed immunoistochimica positiva (IHC), 18 con equivoca CMV IHC, e 79 controlli negativi. Come illustrato nella figura 2, i casi positivi CMV avrebbero dimostrato tipiche inclusioni CMV virali (A) e / o positivo colorazione IHC (B). Casi dubbi avrebbero dimostrato rare, non classici pattern ...

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Views.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

Video: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Rilevazione immunofluorescenza di due analoghi della timidina (CldU e IDU) in tessuto primario

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

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Biologia

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Rilevamento dal vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Celle di PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...