Cette technique vise à nous aider à mieux comprendre la biologie de l’hématopoïèse normale et de la maladie de la moelle osseuse en injectant et en transplantant en toute sécurité des échantillons de patients précieux dans les souris par voie intra-orale, suivie d’une aspiration de la moelle osseuse. On sait depuis longtemps qu’il est plus efficace de transplanter de petites quantités d’échantillons précieux directement dans la moelle osseuse de souris pour des expériences effectuées par injection intraveineuse. Cependant, il n’y a pas de vidéos techniques réelles, donc c’était généralement considéré comme une technique à haut niveau.
Notre protocole permet de greffer facilement et en toute sécurité tout échantillon précieux dans la souris avec un petit nombre de cellules. Il y a une forte demande pour cette technologie, et avec l’aide de cette vidéo, n’importe qui peut l’apprendre rapidement. Nous espérons que tout le monde pourra maîtriser cette technologie et contribuer de manière significative à l’avancement de la science.
Pour commencer, préparez des suspensions cellulaires avec jusqu’à 3 millions de cellules d’échantillon en utilisant 20 microlitres de tampon FACS ou de milieu de décongélation. Conservez-les sur de la glace avant l’injection. Désinfectez la jambe contenant le fémur à injecter avec trois séries de gommages alternés à l’aide d’un gommage à la povidone iodé ou à la chlorhexidine et d’éponges de gaze imbibées à 70 % d’éthanol.
Stabilisez la jambe en pinçant le fémur avec le pouce et l’index. Poussez le tibia avec l’anneau ou le cinquième doigt pour maintenir le tibia plié par rapport au fémur. Assurez-vous d’un bon positionnement pour une injection réussie.
Utilisez le bord d’une aiguille 27G stérile vide pour picorer le tendon rotulien sur le dessus du fémur. Pour assurer le meilleur point d’insertion, insérez l’aiguille 27G avec une seringue attachée juste sous le tendon rotulien. En la logeant solidement entre les deux condyles du fémur, faites pivoter l’aiguille vers l’extérieur et vers le haut pour l’aligner parallèlement à la tige du fémur.
Faites pivoter l’aiguille en cercles tout en l’avançant dans la cavité de la moelle fémorale. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’il y ait une réduction notable de la résistance. Confirmez le bon positionnement de l’aiguille par un mouvement latéral.
Créez une pression négative en tirant le piston de l’aiguille vers l’arrière tout en déplaçant l’aiguille dans la cavité de la moelle osseuse. Vérifiez qu’il y a du sang ou de la moelle osseuse dans la seringue pour vous assurer que l’aiguille est dans la cavité de la moelle osseuse. Après vous être assuré du bon placement de l’aiguille, retirez-la lentement et insérez la cellule contenant la seringue à travers la même racine.
Il est important de se rappeler la racine et l’angle de la première injection lors du passage à une nouvelle aiguille. Une fois que les cellules sont injectées avec succès dans le fémur, retirez soigneusement l’aiguille et la seringue, en maintenant la pression sur la seringue. Retirez ensuite la souris du cône nasal et placez-la sur une serviette en papier propre pour éviter l’aspiration de la litière.
Pour la récupération, gardez la souris sur un coussin chauffant ou une autre surface contrôlée. Assurez-vous de la récupération de l’anesthésie avant de les remettre sur le support de souris. Observez les souris pour détecter des signes de détresse ou d’infection au cours des prochaines 24 heures.
Commencez par vous préparer à l’intervention avant d’aspirer la moelle osseuse, mouillez une seringue de 0,5 millilitre de 27G avec du CSM en remplissant et en expulsant le CSM deux à trois fois. Ensuite, aspirez doucement la moelle osseuse de la souris anesthésiée, ce qui donne 20 à 50 microlitres de moelle osseuse. Ensuite, retirez complètement l’aiguille du fémur et suspendez l’échantillon aspiré dans 500 microlitres de CSM.
Retirez la souris du cône nasal et placez-la sur une serviette en papier propre pour éviter l’aspiration de la litière pendant la récupération. Surveillez toutes les souris pour vérifier la récupération de l’anesthésie avant de les placer à l’arrière du support de souris. Cellules en granulés de la moelle osseuse avec une rotation de cinq minutes à 300G à quatre degrés Celsius.
Aspirez le surnageant et ajoutez le tampon de lyse ACK dans chaque tube. Vortex les cellules pour les remettre en suspension et placez-les sur de la glace pendant 5 à 10 minutes. Filtrez la suspension cellulaire à travers une maille de nylon dans un nouveau tube.
Rincez le tube d’origine avec un tampon FACS et passez-le à travers le maillage en nylon, en cuillant à nouveau les cellules en tournant pendant cinq minutes à 300G à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant des cellules granulées et ajoutez la solution de coloration contenant les anticorps souhaités. Gardez les tubes sur de la glace pendant 20 minutes.
Lavez les cellules et procédez à leur analyse selon le dispositif expérimental. Les techniques de transplantation peuvent être facilement évaluées avec une invasion minimale de souris à l’aide d’une image de bioluminescence. Ici, la transplantation d’une lignée cellulaire K562 dérivée de l’homme avec Acalook a été observée dans un modèle de souris xénogreffe sur le côté du fémur injecté.
La transplantation de HSPC CD34 positives a entraîné plus de 10 à 20 % de la greffe de cellules humaines huit semaines après la transplantation. De même, la transplantation de CSH dérivées de sang de cordon a entraîné jusqu’à 10 % de greffe humaine huit semaines après la transplantation. Cette procédure a permis d’effectuer une transplantation réussie de HSPC dérivées de la moelle osseuse adulte, de cellules souches leucémiques, de HSPC dérivées du sang de cordon éditées par CRISPR Cas9 et d’iPSC LMA dérivées de patients.
