Compte tenu de la complexité des réactions d’ubiquitination et de dubiquitination à l’intérieur des cellules, il est important d’établir des analyses in vitro avec des composants purifiés définis. Cela aide à comprendre les mécanismes de l’ubiquitination et de la déubiquitination et aussi à déterminer comment les mutations associées aux gènes qui codent les enzymes responsables de cette réaction peuvent causer des maladies humaines. Nous pouvons identifier les domaines et les motifs de ces composants qui conduisent ces réactions.
Nous pouvons également développer des analyses d’écran à haut débit qui peuvent être utilisées pour dépister les inhibiteurs de petites molécules qui peuvent être développés comme thérapeutiques potentielles. Pour commencer la lyse bactérienne, ajouter le PMSF et le cocktail antiprotéase dans le tampon de lyse glacée A.Ajouter 25 milliltères du tampon de lyse A dans la bouteille contenant des granulés bactérieux et résuspendre la pastille. Transférer le lysate contenant des bactéries dans un tube pour la sonication.
Utilisez un sonicateur de sonde pour sonifier le lysate à 70% d’amplitude de sortie pendant 30 secondes, quatre à cinq fois. Puis centrifugeuse à 21 000 fois g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir incubé les bactéries lysate avec des perles GSH pendant cinq heures selon le manuscrit, transférer les perles avec 10 millilters de tampon dans une colonne de chromatographie vide.
Ensuite, ajoutez 1,5 milliltres de tampon A contenant 25 millimolaires de glutathion dans la colonne et recueillez l’élitution par gravité en microtubes de 1,5 millilitre. Répétez la procédure d’élitution quatre fois avec le tampon frais A un traitement continu des fractions élucidées selon le manuscrit. Pour commencer, resuspendez les granulés de bactéries His-BAP1 et MBP-DEUBAD dans 25 milliltères de tampon de lyse glacée B.Mix 25 milliltères de chaque lysate et incuber sur la glace pendant 15 minutes.
Sonicate, puis centrifugeuse du lysate à 21 000 fois g pendant 20 minutes. Après centrifugation lysate, filtrer le lysate à travers un filtre à seringue pore de 0,45 micromètre dans une bouteille et le mélanger avec les perles Nickel NTA. Incuber à quatre degrés Celsius en secouant pendant cinq heures.
Après ça, faites tourner les perles à 25 000 fois g pendant trois minutes. Utilisez une pipette pour sauver le surnatant dans un tube de 50 millilitres que le flux à travers. Laver les perles avec cinq milliltères de tampon B, contenant 20 millimolaires d’imidazole, six fois avec une centrifugeuse de trois minutes.
Après le dernier lavage, transférer les perles avec 10 milliltères de tampon B dans une colonne de chromatographie vide et ajouter un millilitre de tampon B contenant 200 millimolaires d’imidazole. Recueillir l’élitution par gravité en microtubes de 1,5 millilitre contenant de la TNT et de l’EDTA. Répétez la procédure d’élitution quatre fois et mettre en commun les fractions allongées désirées dans un tube de 15 millilitres.
Ajouter le tampon C pour diluer le complexe élucidé trois fois. Ensuite, transférez l’elution diluée aux perles d’amylose préparées dans des tubes et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses. Le matin, centrifugez les tubes à 2500 fois g pendant trois minutes et gardez le supernatant dans un tube de 15 millilitres comme écoulement à travers.
Lavez les perles liées aux protéines avec cinq milliltères de tampon C pendant cinq à six fois. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon D au complexe purifié His-BAP1/MBP-DEUBAD sur les perles d’agarose d’amylose pour faire une solution de perles à 50%. Transférer 20 microlitres de la solution de perles à 50% dans un tube de microcentrifugeuse et ajouter 20 microlitres de deux fois tampon échantillon Laemmli pour L’analyse bleue SDS-PAGE et Coomassie.
Conservez le reste de la solution de perles à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Après culture, les cellules HEK293T, plaquent 12 millions de cellules en 20 milliltères de médias complets dans un plat de culture de 15 centimètres, un jour avant la transfection. Après une journée, sous le capot de la culture cellulaire, aspirer les médias et fournir 12 milliltères de sérum médias libres.
Transfect les cellules avec 21 microgrammes de pCDNA plat-H2A utilisant 63 microlitres de PEI à un milligramme par millilitre. Après 12 heures, passer à un milieu complet. Après la récolte des cellules selon le manuscrit, résuspendez la pastille cellulaire dans environ 10 volumes de tampon E contenant nem pour inhiber les deubiquitinases et vous couvez sur la glace pendant 20 minutes.
Après centrifugation à 3000 fois g pendant cinq minutes, jeter le supernatant. Lavez la pastille de chromatine deux fois avec 10 volumes de tampon E d’abord, puis lavez-la deux fois avec le tampon F.Resuspendez la chromatine en cinq milliltères de tampon F et traitez la pastille avec de la nucléase micrococcique à la concentration de trois unités par millilitre pendant 10 minutes à température ambiante. Après incubation, transférer un aliquot de 40 microlitres du mélange dans un tube de 1,5 millilitre pour l’analyse des fragments d’ADN nucléosomal.
Ajouter 40 microlitres de phénol-chloroforme et 20 microlitres de six fois tampon de chargement de l’ADN. Vortex et tourner à 18 000 fois g pendant deux minutes. Puis transférer 15 microlitres de la phase aqueuse dans un gel agarose de 2% pour charger l’ADN.
Après avoir arrêté la réaction et la centrifugation selon le manuscrit, incuber la fraction soluble de chromatine avec des perles de résine anti-drapeau dans un tube de 15 millilitres pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec secousses. Lavez les perles six fois avec le tampon G.Transférez les perles avec cinq milliltères de G tampon dans une colonne de chromatographie vide. Diluer les nucléosomes liés de la perle avec 260 microlitres de G tampon contenant 200 microgrammes par millilitre de peptide d’élitution du drapeau et un à cinq tris molaires au pH huit.
Elute les nucléosomes trois fois, une heure dans la chambre froide. Pour effectuer l’analyse d’ubiquitination, ajoutez d’abord un microgramme des nucléosomes purifiés dans 40 microlitres d’enzymes conjuguées H.After tampon, ajoutez un mélange de solutions enzymatiques contenant 250 nanogrammes d’UBE1, 672 nanogrammes d’enzymes conjuguées UB et E2 UB et un microgramme d’ubiquitine BMI1-RING1B E3 complexe de ligastine dans le tube. Incuber la réaction pendant trois heures à 37 degrés Celsius avec des secousses occasionnelles.
Arrêtez la réaction en ajoutant 40 microlitres de deux fois Tampon échantillon Laemmli et d’analyser l’ubiquitination histone H2AK119 par ballonnement occidental. Pour effectuer le test de déubiquitination in vitro, réutilisez les nucléosomes purifiés dans 40 microlitres de tampon I et un microgramme de bactéries purifiées perles His-BAP1/MBP-DEUBAD. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois heures pour effectuer la réaction de désubiquitination avec des secousses occasionnelles.
Puis arrêter la réaction en ajoutant 40 microlitres de deux fois tampon Laemmli et d’analyser par immunoblotting. Dans cette expérience, la coloration bleue Coomassie pour une purification typique du complexe GST-BM1-RING1B à l’aide de perles d’affinité de TPS montre que les bandes migrent à un poids molaire prévu autour de 45 kilodaltons et 13 kilodaltons respectivement. De même, la purification du complexe His-BAP1 MBP-DEUBAD a également donné lieu à des préparations homogènes relativement élevées avec des bandes d’environ 90 kilodaltons et 55 kilodaltons respectivement.
D’autre part, la fraction nucléosomale purifiée est essentiellement composée par une bande de 147 paires de base indiquant la présence d’une fraction mononucléosomale hautement enrichie. La coloration bleue coomassie des nucléosomes purifiés montre un modèle typique de bande des quatre sous-unités d’histone avec des quantités stoichiométriques. L’ubiquitination de l’histone H2A avec le complexe BMI1-RING1B montre une augmentation dépendante du temps de la forme ubiquitinated de la protéine tandis que les niveaux de la forme non modifiée sont simultanément diminués.
La réaction d’ubiquitination est totale car pratiquement toutes les protéines H2A sont transformées en H2A K119ub. D’autre part, l’essai de déubiquitination a été mené nucléosomes indigènes. Après incubation de ces nucléosomes avec BAP1-DEUBAD, une réduction dépendante du temps du signal H2A K119ub a été observée.
Le succès des réactions d’ubiquitination et de dubiquitination dépend de la façon dont la protéine est purifiée. Nous avons besoin d’un bon rendement et l’utilisation tampon pour la résuspension et la purification des protéines doit être compatible avec les réactions biochimiques. Lorsque ces analyses d’ubiquitination et de déubiquitination sont bien établies, nous pouvons tester les activateurs et inhibiteurs affectifs ainsi que l’impact des mutations génétiques associées à la maladie.
Cette méthode a été établie par la contribution de plusieurs laboratoires et sont très utiles pour comprendre les mécanismes d’ubiquitination et de déubiquitination. Plusieurs produits chimiques sont dangereux et doivent être manipulés dans le capot. Ceci inclut le phénol-chloroforme, les acides, les bases, et les agents réducteurs.
