Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH CA141009 et GM39067. Nous remercions E. Parnell et R. Yarrington des commentaires sur la partie écrite.

1. Isolement de souris CD4 naïfs T spléniques Cells <ol><li> Sacrifiez la souris de façon humaine compatible avec Institutional Animal Care et utilisation Comité protocoles (IACUC). Disséquer la rate et le placer dans un plat de Pétri contenant 10 ml de DMEM avec 10% de FBS. </li><li> Ecrasez la rate à l&#39;aide givrés extrémités de deux lames de verre pour libérer les splénocytes. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg (~ 1200 rpm pour une centrifugeuse clinique avec le diamètre de rotor) pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Remettre les cellules en 2 tampon ACK ml lyse des globules rouges, 1 min à température ambiante (RT). Arrêter la réaction en ajoutant 8 ml de DMEM avec FBS. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Reprendre les cellules dans 5 ml de DMEM contenant FBS et passer à travers un filtre à tamis 70 pm (BD Falcon, Cat # 352350). Compter les cellules et de procéderà l&#39;isolement de cellules CD4 T naïfs cellules en utilisant un kit d&#39;isolation des CD4 (Miltenyi, Cat # 130-095-248) en utilisant les instructions du fabricant. Recueillir cellules T CD4 naïfs par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C. Reprendre les cellules dans 10 ml de DMEM avec FBS. </li></ol> 2. Préparation de la chromatine <ol><li> Ajouter 37% de formaldéhyde à une concentration finale de 1% à la suspension de cellules dans du DMEM et secouez-la délicatement à la température ambiante (par exemple en utilisant un Nutator) pendant 15 min pour réticuler l&#39;ADN: les complexes protéiques. </li><li> Arrêter réticulation par addition de 1 M de glycine à une concentration finale de 125 mM. Continuez à balancer pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules en remettant en suspension dans 5 ml de contenant des inhibiteurs de la protéase du PBS glacé. Laver en PBS inhibiteurs de protéase contenant glacées 3 fois au total et recueillir les cellules par centrifugation à 4 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 mlun tampon de lyse cellulaire glacée contenant des inhibiteurs de protéase. Incuber sur de la glace pendant 15 min. L&#39;efficacité de la lyse cellulaire peut être déterminée par la remise en suspension une petite aliquote de cellules dans une solution de bleu trypan à 0,4% (Sigma, Cat # T8154) et en observant avec un microscope. </li><li> Recueillir les noyaux par centrifugation à 200 xg (typiquement ~ 1200 rpm) pendant 5 min à 4 ° C. Jetez soigneusement le surnageant. </li><li> Reprendre les noyaux dans 500 pi de tampon de lyse nucléaire contenant des inhibiteurs de protéase. Incuber sur de la glace pendant 15 min. </li><li> Soniquer les cellules en utilisant un Sonicator Misonix 3000, la sonde taille 1,6 mm: niveau de sortie 4, 15 sec rafale, 4 fois sur la glace. Chaque échantillon doit être refroidi sur la glace pendant 1-2 min avant de sonication à nouveau pour éviter la surchauffe des échantillons. La surchauffe peut provoquer le renversement de liens croisés. </li><li> Centrifugeuse la chromatine sonifié à 16.000 xg (~ 13,200 rpm dans une micro) pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Prendre une aliquote de 20 ul de supern clairatant, ajouter colorant de charge de l&#39;ADN et vérifier l&#39;ADN traité par ultrasons par électrophorèse sur un gel d&#39;agarose à 2% (taille idéale de l&#39;ADN traité par ultrasons pour la plupart des applications est de 200-500 pb). </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre UV. Chromatine cisaillé peut être utilisé immédiatement pour mettre en place réaction d&#39;immunoprécipitation de la chromatine ou conservé à -80 ° C. Typiquement, nous obtenons 7,5-10 ug d&#39;ADN 2-3 x 10 6 CD4 lymphocytes T purifiés par souris. </li></ol> 3. Immunoprécipitation de la chromatine (toutes les mesures doivent être effectuées à 0-4 ° C) <ol><li> Diluer la chromatine sonifié à une concentration d&#39;ADN de pg / ml 5-10 (volume total = 1 ml) dans un tampon de dilution ChIP avec les inhibiteurs de protéase. </li><li> Économisez 100 pi (10%) comme entrée. Stocker sur la glace. </li><li> Aliquote de 450 ul chacune en deux microtubes 1,7 ml étiquetés comme isotype contrôle (souris ou de lapin IgG) et de l&#39;anticorps d&#39;intérêt. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisés, un seul contr isotypeol sera suffisant pour effectuer cette analyse. Vous aurez besoin de plusieurs contrôles isotypiques si les anticorps d&#39;une source animale différente ou isotype sont utilisés. </li><li> Ajouter 2-5 ug d&#39;anticorps spécifiques, en fonction de la spécificité de l&#39;anticorps utilisé, ou le contrôle isotypique vers les tubes respectifs. </li><li> Basculer les tubes à l&#39;aide d&#39;un Nutator une nuit à 4 ° C pour permettre la formation de complexes anticorps-chromatine. </li><li> Ajouter 25 ul de billes magnétiques de la protéine G (1:1 suspension de billes en suspension) au mélange ci-dessus et laisser bercer pendant au moins 2 heures à 4 ° C. Perles de notre fournisseur peuvent être utilisées directement. </li><li> Placer les microtubes sur un support magnétique et permettent aux perles de recueillir sur le côté aimanté. </li><li> Retirez délicatement la solution par aspiration sans déranger les perles. </li><li> Ajouter 1 ml de solution faible de lavage de sel et laisser bercer doucement pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant un support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois.</li><li> Ajouter 1 ml de solution de lavage haute teneur en sel et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois. </li><li> Ajouter 1 ml de solution de lavage de chlorure de lithium et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage. Répéter une fois. L&#39;utilisation de LiCl améliore l&#39;élimination efficace des interactions de la chromatine non spécifiques avec les billes. </li><li> Ajouter 1 ml de solution TE et laisser bercer pendant 5 min sur un Nutator. Collecter les perles en utilisant le support magnétique et retirer la solution de lavage. </li><li> On élue l&#39;ADN à partir des billes en ajoutant 250 pi de tampon d&#39;élution. Roche pendant 15 min à température ambiante. Introduire à la pipette hors de l&#39;éluat et sauver ce matériel dans un nouveau microtube 1,7 ml. Répéter une fois de plus et de combiner les deux élutions. Jeter les perles. </li><li> Pour inverser les liaisons transversales ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 0,3 M et 1 pl de RNase A (20 m<html> g / ml) à l&#39;ADN élue. Ajouter 400 pi de tampon d&#39;élution pour les entrées sauvegardées à l&#39;étape 3.2, pour rendre le volume 500 pi. Pour ajouter des entrées NaCl à 0,3 M, 1 pl de RNase A, 10 pl d&#39;EDTA 0,5 M, 20 pi de Tris-HCl 1 M pH 6,5 et 1 pl de la protéinase K (20 mg / ml). </li><li> Incuber les tubes pendant une nuit à 65 ° C dans un bloc de chauffage à sec. Pour éviter l&#39;évaporation des échantillons, sceau ou placez un poids sur les tubes pour les empêcher de s&#39;ouvrir. Four à hybridation peut également être utilisé. </li><li> Laisser les tubes refroidir à température ambiante. Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 100% et incuber 2 h-nuit à -80 ° C pour précipiter l&#39;ADN. </li><li> Centrifuger les tubes à 16.000 g pendant 15 min pour obtenir un culot d&#39;ADN. Laver le culot d&#39;ADN fois avec 70% d&#39;éthanol et sécher à l&#39;air le culot. Reprendre le culot d&#39;ADN dans 100 ul d&#39;eau distillée stérilisée à l&#39;autoclave. </li><li> Purifier l&#39;ADN en utilisant des colonnes de centrifugation Qiaquick et sont élues dans le volume total de 50 ul de tampon d&#39;élution. Cet ADN est prêt à être utilisé pour la PCR. </li></ol>&quot;&gt; 4. Préparation de la réaction PCR (toutes les mesures doivent être effectuées sur glace) <ol><li> Ramassez tous les échantillons d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons d&#39;entrée à puce et correspondant. En outre, de collecter tous les réactifs et les amorces pour la région ciblée par PCR et une région de contrôle. Utilisez un &quot;hotstart&quot; Taq ADN polymérase. Nous allons utiliser un dosage à base de vert SYBR de quantifier l&#39;amplification d&#39;ADN dans cette procédure, mais les kits mastermix qPCR peut être utilisé si nécessaire. </li><li> Faire une dilution en série de l&#39;ADN d&#39;entrée pour générer une courbe d&#39;étalonnage pour l&#39;analyse qPCR: par exemple 10%, 1%, 0,1% et 0,01% dans du tampon d&#39;élution (à partir des colonnes de centrifugation QIAquick dans l&#39;étape 3.18). La gamme de concentration et de l&#39;accroissement de ce jeu de modèle de courbe standard peuvent varier selon les niveaux prévus de l&#39;enrichissement à puce, etc Distribuer 10 ul d&#39;échantillons d&#39;ADN d&#39;entrée dans les puits respectifs d&#39;une plaque de 96 puits (Genemate, chat # T-3182-1 ), en double exemplaire. </li><li> Verser 10 ml d&#39;ADN de puce du contrôle isotypique ainsi que anticorps spécifiques dans respectivepuits, en trois exemplaires. </li><li> Faites un &quot;mélange maître&quot; contenant soit des amorces cibles ou des amorces de contrôle (concentration finale 0,1 uM de chaque amorce) et distribuer 10 ul dans les puits respectifs. Par exemple, dans le modèle ci-dessous dispenser mélange maître contenant des amorces ciblées dans des puits marqué vert et distribuer mélange maître avec amorces de contrôle dans les puits marqués en rouge. </li><li> Recouvrir la plaque de PCR avec un film d&#39;étanchéité en matière plastique optique et centrifuger à 500 xg dans une centrifugeuse clinique (~ 1200 rpm) pendant 1 min à température ambiante pour recueillir tout au fond du puits. </li><li> Déclencher la réaction PCR. Nous allons utiliser le LightCycler 480 II (Roche) fonctionnant LightCycler 480SW logiciel 1.5 pour exécuter la qPCR dans cet exemple. </li></ol> La pré-incubation: 1 cycle: 95 ° C / 5 min. Amplification: 40-45 cycles: 94 ° C / 5 sec, 60 ° C / 5 sec, 72 ° C/10 sec (température de recuit doit être 2-3 ° C inférieure à la temperatur de fusione des amorces). courbe de fusion: 1 cycle. Refroidissement: 1 cycle. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 10% d&#39;entrée </td><td> 10% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> B </td><td> 1% d&#39;entrée </td><td> 1% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> C </td><td> 0,1% d&#39;entrée </td><td> 0,1% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td> Entrée 0,01% </td><td> Entrée 0,01% </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> 10% d&#39;entrée </td><td> 10% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td> 1% d&#39;entrée </td><td> 1% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td> 0,1% d&#39;entrée </td><td> 0,1% d&#39;entrée </td><td> Isotype </td><td> Spécifique </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td> Entrée 0,01% </td><td> Entrée 0,01% </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Vert: Utilisez amorces des régions ciblées. Rouge: Utilisez région amorces de contrôle. 5. Analyse <ol><li> Programme du logiciel de qPCR pour la quantification de la quantité absolue d&#39;ADN. Surtout, l&#39;utilisation d&#39;une courbe standard pour des montants ADN interpoler dans les échantillons spécifiques et isotype inconnus permet l&#39;évaluation et adaptation de la qualité et l&#39;efficacité de tous les jeux d&#39;amorces dans la gamme de concentrations trouvées dans les échantillons. En outre, il fournit également un more méthode fiable pour convertir les valeurs Cq (t C ou C p) pour des résultats d&#39;enrichissement de pliage relative finale que les procédés usingΔΔCq et connexes. </li><li> Aller à l&#39;éditeur d&#39;échantillon et marquer les puits contenant des échantillons d&#39;entrée de différentes dilutions (10%, 1%, 0,1% et 0,01%) avec leurs valeurs de la courbe standard. Étiqueter aussi les puits avec des échantillons de puces inconnus, exactement comme la plaque PCR est aménagé. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d&#39;autres machines de qPCR, désigner des sous-ensembles qui correspondent à des réactions de chaque paire d&#39;amorces, la valeur de la courbe étalon et l&#39;échantillon de contrôle expérimental et isotype conséquence. </li><li> Dans le logiciel LightCycler, accédez à l&#39;éditeur de sous-ensemble et marquer les sous-ensembles, y compris les puits avec des échantillons d&#39;entrée ainsi que les échantillons de copeaux inconnus. Les échantillons inconnus seront quantifiées en utilisant la courbe d&#39;étalonnage générée à partir des concentrations connues d&#39;échantillons d&#39;entrée pour l&#39;analyse. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d&#39;autres appareils de qPCR, désigné sous-ensembles corresponding à toutes les réactions pour chacune des paires d&#39;amorces. </li><li> Après l&#39;amplification par PCR est terminée, effectuer l&#39;analyse avec &quot;Abs Quant/2nd dérivés Max&quot; et sélectionnez le sous-ensemble d&#39;analyse et appuyez sur OK. Dans le logiciel équivalent utilisé dans d&#39;autres appareils de qPCR, convertir la valeur Cq à la quantité d&#39;ADN dans chaque sous-ensemble. </li><li> Appuyez sur «Calculer» qui va générer la courbe d&#39;étalonnage en utilisant les concentrations connues d&#39;échantillons d&#39;entrée et affichera la quantité absolue d&#39;ADN présent dans les échantillons inconnus. </li><li> Si la qualité de l&#39;ADN cisaillé est bonne, et si les amorces se lient spécifiquement à la région ciblée, l&#39;efficacité PCR devrait être proche de 2. </li><li> Effectuer une analyse de la courbe de fusion avec &quot;Tm Calling&quot; pour le même sous-ensemble, si disponible. Un seul pic indique que seul un produit spécifique a été amplifié. L&#39;amplification de l&#39;ADN spécifique peut également être testée par électrophorèse du produit de PCR avec l&#39;échelle d&#39;ADN à travers un gel d&#39;agarose. </li><li> Exporter des données sous forme d&#39;onglet-fichier texte délimité, qui peut être ouvert dans Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie. </li><li> Utilisation de Microsoft Excel, divisez le montant de l&#39;ADN de l&#39;anticorps spécifique avec le contrôle isotypique pour amorces ciblées. Répétez cette étape pour la région amorces de contrôle. Si plusieurs anticorps du même isotype sont utilisées pour différents immunoprécipitat, normaliser chacune d&#39;entre elles avec les valeurs de la même isotype contrôle. Par ailleurs, si plusieurs couples d&#39;amorces ciblées sont utilisées, les quantités d&#39;ADN à partir d&#39;une amorce contrôle unique jeu de paire doivent être utilisés pour la normalisation de chaque cible (Figures 1 et 2). Les valeurs de sortie représentent l&#39;anticorps immuno fois enrichissement spécifique à chaque emplacement par rapport aux non-spécifique fond anticorps immuno-précipitation. </li><li> Diviser l&#39;enrichissement fois (à Isotype Control) pour amorces ciblées avec l&#39;enrichissement fois (à Isotype Control) pour la région amorces de contrôle pour obtenir un enrichissement par rapport à unrégion non reliée de commande (figure 1). Surtout, notez qu&#39;en raison de la génération de courbes standard avec l&#39;ADN d&#39;entrée totale pour chaque échantillon, chacune des valeurs d&#39;immunoprécipitation dessus interpolée à partir des courbes standards sont déjà normalisées par rapport à, et exprimé comme la fraction de l&#39;apport total par le logiciel de la machine. </li><li> Si la rigueur des tampons utilisés pour l&#39;immunoprécipitation ou lavage est trop élevé, il est possible que l&#39;amplification robuste à partir d&#39;échantillons immunoprécipités avec des anticorps spécifiques sera observée, tandis que l&#39;amplification du contrôle isotype immunoprécipitait échantillons ne seront pas respectées. Dans un tel scénario, il est préférable de soustraire le montant de la puce de contrôle isotypique de puce à anticorps spécifique à la fois la région ciblée et la région non liée. Enrichissement relatif peut être calculé en divisant la différence pour la région ciblée par différence pour la région non liée (Figure 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters.">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Molecular and Cellular Biology. 21, 6820-6832 (2001).</li><li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 37-47 (2002).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+nuclear+localization+of+NFAT+in+Foxp3++regulatory+T+cells+independent+of+calcineurin+activity.">Constitutive nuclear localization of NFAT in Foxp3+ regulatory T cells independent of calcineurin activity.</a> J. Immunol. 188, 4268-4277 (2012).</li><li>Shakya, A., Kang, J., Chumley, J., Williams, M. A., Tantin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct1+is+a+switchable,+bipotential+stabilizer+of+repressed+and+inducible+transcriptional+states.">Oct1 is a switchable, bipotential stabilizer of repressed and inducible transcriptional states.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 450-459 (2011).</li><li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Lubelsky, Y., Macalpine, H. K., Macalpine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+localization+of+replication+factors.">Genome-wide localization of replication factors.</a> Methods. 57, 187-195 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+characterization+of+the+early+embryo+with+a+chromatin+immunoprecipitation+protocol+applicable+to+small+cell+populations.">Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.</a> Nature Genetics. 38, 835-841 (2006).</li><li>Sikes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+rapid+and+sensitive+chromatin+immunoprecipitation.">A streamlined method for rapid and sensitive chromatin immunoprecipitation.</a> Journal of Immunological Methods. 344, 58-63 (2009).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution.">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li><li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes.">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li><li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins.">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole ci-dessus fournit une méthode robuste de quantifier avec précision l&#39;enrichissement de l&#39;ADN des lymphocytes primaires utilisant le morceau. Une raison majeure de robustesse dans ce protocole est l&#39;inclusion de la diversité biologique répétitions. Le protocole ci-dessus utilise trois répétitions, l&#39;enrichissement, pour lesquels est calculé indépendamment. Les sorties sont ensuite moyennées pour fournir un degré d&#39;enrichissement et écarts-types calculés pour fournir une mesur...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-8775</td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline</td>
 <td>Hyclone</td>
 <td>SH30256.01</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor tablets</td>
 <td>Roche</td>
 <td>04693116001</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein G magnetic beads</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>101945</td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase A (20 mg/ml)</td>
 <td>EMD Millipore</td>
 <td>556746</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K (20 mg/ml)</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03115879001</td>
 <td>Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>10966-034</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Green I</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S7567</td>
 <td>Store at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Glycine</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Prepare fresh</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris-HCl, pH 6.5</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Store at RT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Specific Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clay Adams Brand Nutator</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>Model: 421105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic Stand</td>
 <td>Promega</td>
 <td>Z5342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masonix Sonicator 3000</td>
 <td>QSonica</td>
 <td>Model: S3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Spectrophotometer</td>
 <td>NanoDrop Technologies</td>
 <td>ND-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13259-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotator</td>
 <td>VWR</td>
 <td>80085-692 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated bench top centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Model: Allegra X-12R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5415 D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table of Equipment </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

efficient chromatin immunoprecipitation using limiting amounts of biomass

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode largement utilisée pour déterminer les interactions entre différentes protéines avec de l&#39;ADN en chromatine des cellules vivantes. Exemples spécifiques d&#39;une séquence d&#39;ADN de liaison facteurs de transcription, histones et leurs différents états de modification, les enzymes telles que les ARN polymérases et des facteurs auxiliaires, et des composants de réparation de l&#39;ADN. En dépit de son omniprésence, il ya un manque de jusqu&#39;à à ce jour-, les méthodes détaillées à la fois pour la préparation du banc de matériau et pour une analyse précise permettant des mesures quantitatives de l&#39;interaction. En raison de ce manque d&#39;information, et aussi parce que, comme tout immunoprécipitation, les conditions doivent être ré-optimisés pour les nouvelles séries de conditions expérimentales, le dosage de la puce est sensible à des résultats inexacts ou mal quantitative. Notre protocole est finalement dérivé du travail séminal sur le facteur de transcription: interactions ADN 1,2, mais intègre un certain nombre d&#39;améliorations sensivité et la reproductibilité pour à obtenir difficiles types de cellules. Le protocole a été utilisé avec succès 3,4, à la fois en utilisant qPCR de quantifier l&#39;enrichissement de l&#39;ADN, ou en utilisant une variante semi-quantitative du protocole ci-dessous. Cette analyse quantitative du matériel amplifié par PCR est effectuée calcul, et représente un facteur limitant dans l&#39;essai. Contrôles importants et d&#39;autres facteurs incluent l&#39;utilisation d&#39;un anticorps isotype, ainsi que l&#39;évaluation d&#39;une zone de contrôle de l&#39;ADN génomique, comme une région intergénique prévu de ne pas être lié par la protéine à l&#39;étude (ou prévu de ne pas montrer les changements dans les conditions expérimentales). En outre, une courbe standard de matériel d&#39;entrée pour chaque échantillon puce est utilisée pour calculer les niveaux absolus de l&#39;enrichissement dans le matériau expérimental. Utilisation des courbes standard permet de tenir compte des différences entre les jeux d&#39;amorces, peu importe avec quel soin ils sont conçus, et aussi l&#39;efficacité différerrences sur toute la gamme de concentrations de modèle pour un ensemble d&#39;amorces. Notre protocole est différent des autres qui sont disponibles en 5-8 que nous couvrons largement la phase d&#39;analyse ultérieure.

L&#39;immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) protocole présenté ici contrôles des différences, le cas échéant, de la quantité d&#39;ADN utilisée dans la PCR par l&#39;utilisation d&#39;une paire d&#39;amorces qui amplifie une région non liée de génome, servant ainsi de «contrôle de chargement&quot;. Dans l&#39;exemple illustré à la figure 3, nous avons utilisé la région codante du gène Loi de l &#39;souris comme une région non liée à notre protéine d&#39;int...

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Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l&#39;efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d&#39;analyse des données est présentée.

Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K vues.  University of Utah School of Medicine. Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

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Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Recherche

Biologie

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Immunoprécipitation ADN méthylé

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l&#39;expression génique dans les cellules humaines Activé

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l&#39;aide Drosophila Tissus

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...