Ce travail a été financé par une subvention de la BSF US-Israël à BS et EDSBS est titulaire d&#39;une chaire Hilda et Cecil Lewis en génétique moléculaire.

REMARQUE: Les procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Institut Weizmann des Sciences. Préparation de l&#39;échantillon 1 <ol><li> Isolement des acini pancréatiques <ol><li> Préparer 300 ml de bicarbonate frais de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) moyen avant de commencer. Mélanger 140 mM de NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, glucose 11 mM, HEPES 10 mM. Ajouter de l&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et de l&#39;inhibiteur de 0,1 mg / ml de trypsine de soja (STI) (milieu de remise en suspension). Préparation de 5 à 10 ml de milieu supplémenté remise en suspension avec de la collagénase (~ 0,75 mg / ml) (milieu de digestion). </li><li> Oxygéner le milieu KRB pour ~ 30 min. Ajouter BSA après oxygénation pour empêcher un barbotage. Apportez remise en suspension et de digestion médiums à 37 ° C. NOTE: L&#39;oxygénation du milieu réduit la mortalité cellulaire et améliore la réactivité de sécrétagogues. L&#39;effet de l&#39;oxygénation est apparente au moins pendant 6 heures. </li><li&gt; sacrifier la souris par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie, selon les directives de protection des animaux. Placez l&#39;animal sacrifié sur son dos, l&#39;attacher à un tampon de dissection et nettoyer la surface abdominale avec de l&#39;éthanol. REMARQUE: Pour éviter la contamination, l&#39;autoclave les outils de dissection et l&#39;eau utilisée pour les moyennes KRBH avant utilisation. Milieu filtrant KRBH à travers un filtre de 0,2 um. Avant l&#39;excision du pancréas rincer les outils de dissection avec 70% d&#39;éthanol et procéder à la dissection sur un banc propre. Effectuer des infections virales dans une armoire niveau 3 de biosécurité. Ajouter des antibiotiques pour le / milieu de culture N O (voir la section 4). </li></ol></li><li> Excision du pancréas de souris <ol><li> Incision largement la peau de l&#39;abdomen et de la couche sous-cutanée. Identifier le foie, l&#39;estomac, l&#39;intestin, du pancréas et de la rate (Figure 1). NOTE: Dans les étapes suivantes, la poignée de tissu pancréatique en douceur et éviter d&#39;appliquer forc mécanique excessivee pour éviter l&#39;auto-digestion de la mort de tissus et de cellules. </li><li> En utilisant deux forceps émoussé, retirer l&#39;intestin grêle. Commencer à la petite extrémité proximale intestin, près de la sortie de l&#39;estomac. Séparer le pancréas et l&#39;intestin de la retenir à l&#39;intérieur de la cavité du corps. Une fois atteint le gros intestin, remarquer un tissu conjonctif rose / blanc. Ne pas confondre avec le pancréas. </li><li> Effacer autant que possible le tissu pancréatique sans recueillir le tissu adipeux ou conjonctif. Retirer le pancréas en le détachant de la rate et l&#39;estomac et coupant les vaisseaux sanguins abdominaux dessous (figure 1A-C). NOTE: Depuis le rendement de acini pancréatiques à partir d&#39;un seul animal est élevé, on peut s&#39;abstenir de collecter tous les tissus du pancréas, afin d&#39;éviter la collecte d&#39;autres tissus. </li></ol></li><li> Digestion à la collagénase <ol><li> Rincer les pancréas à plusieurs reprises dans un milieu de remise en suspension chauffée à 37 ° C et enlever les parties restantes de non-pancréatiquetissus. Immerger dans le pancréas ~ 5 ml du milieu de digestion pré-chauffé dans un flacon à scintillation de 20 ml. Émincer le pancréas à des morceaux de 1-3 mm. Les placer dans un bain d&#39;eau chauffé (de manière optimale sous une agitation de 100 rpm ~). Pour accélérer la digestion, la pipette vers le haut de tissu digéré et en bas une fois toutes les quelques minutes. REMARQUE: La durée de la digestion par la collagénase dépend principalement de la concentration de la collagénase et de la quantité de force mécanique appliquée sur le tissu. Utilisation de 0,75 mg / ml de collagénase pendant environ 15 min et le tissu de pipetage avec une pipette 5 ml de polystyrène avec un orifice de 2 mm tous les 3 - 5 min, ce qui entraîne des acini de 10 à 30 cellules. Après la digestion, la suspension semble trouble contenant des morceaux visibles de tissu. Depuis collagénases efficacité varie entre les différents types commerciaux et lots, de déterminer le moment de la digestion de manière empirique. </li><li> Lavage et filtration <ol><li> Transférer le tissu digéré dans un tube de 50 ml et mettre fin à creuserestion en ajoutant 45 ml de milieu de remise en suspension. On filtre la suspension à travers un grossier (~ 1 mm) en maille métallique dans un tube frais. Centrifuger le accréditives à 100 g pendant 3 min. </li><li> Jeter le surnageant et remise en suspension du pancréas digérés dans 50 ml de milieu de remise en suspension. On filtre la suspension à travers une maille de nylon 70 ou 100 um. Centrifugeuse comme avant. </li><li> Afin d&#39;éliminer flottante, acini endommagé, jeter le surnageant et remettre en suspension dans le tissu pancréatique 3 - 5 ml de milieu de remise en suspension. Appliquer 1 ml d&#39;acini pancréatiques dans des tubes coniques de 15 ml remplis avec 7 ml d&#39;un milieu de remise en suspension. Laisser le acini reposer pendant 2 - 3 min. Recueillir les acini qui se sont installés au fond du tube avec une pipette de 1 ml, et répétez cette étape 2 - 3 fois. </li><li> Voir le acini pancréatiques sous un microscope optique ou dissection de tester leur condition. Dans la figure 2, observer la pureté de l&#39;isolement et des dommages infligés aux cellules Duril&#39;isolement ng. Utilisez ces acini immédiatement ou culture pour un maximum de 20 heures. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. la sécrétion d&#39;amylase Assay NOTE: Le dosage de la sécrétion d&#39;amylase sert de mesure globale de la capacité de sécrétion d&#39;acini pancréatiques. Ce résultat est obtenu en collectant le milieu dans lequel le acini pancréatiques ont été incubées, et détermination de l&#39;activité de l&#39;amylase du milieu, habituellement en utilisant un kit commercial. <ol><li> Déterminer le nombre de conditions expérimentales à examiner (par exemple par rapport à la non-stimulée stimulé). Utilisez au moins trois répétitions pour chaque condition. En outre, ajouter un ensemble de répétitions pour déterminer la teneur totale de l&#39;amylase cellulaire (échantillon &quot;total&quot;) et un ensemble pour l&#39;activité de l&#39;amylase du milieu (échantillon &quot;zéro&quot;). Attribuer une plaque multi-puits, dans lequel le dosage est effectué, et deux séries de micro-tubes pour chacune des répétitions à être utilisé. NOTE: 12 ou 24 puits plaques peut être utilisé pour surveiller 1 et 0,5 ml de suspension acineuses, respectivement. </li><li> Laver les acini deux fois dans 30 ml de milieu de remise en suspension KRBH et les incuber dans un milieu de remise en suspension pendant 30 min à 37 ° C. Pour la plaque multi-puits on ajoute une goutte de 10 ul de sécrétagogue d&#39;atteindre la concentration finale appropriée. </li><li> Acini pancréatiques répondent à un gradient de sécrétagogue d&#39;une manière bi-phasique. Les concentrations des valeurs optimales de sécrétion sont 50 - 100 pM de cholécystokinine (CCK) et 1 uM de carbachol (figure 3A) 5. </li><li> Lavez et remettre en suspension les acini en milieu de remise en suspension. S&#39;assurer que les acini sont répartis de manière homogène dans la suspension et aliquotes des quantités égales de suspension dans la plaque multi-puits et en les «microtubes de total&#39; marqué. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 ° C. (De préférence dans un bain d&#39;eau sous agitation modérée (environ 50 tours par minute)). REMARQUE: Le nombre exact de acini peut varier entre expérits mais devraient être semblables à répétitions dans chaque expérience. Ainsi, aliquotage précis de la suspension d&#39;acini est critique pour la comparaison entre les différentes répliques et conditions. </li><li> Pendant l&#39;incubation, de produire la «totale» et des échantillons «zéro». Centrifugeuse les microtubes «total» pour quelques secondes à 5000 × g et supprimer 50 pi à partir du surnageant en «microtubes zero&#39; marqués et les placer à 4 ° C. Lyse des acini dans les échantillons «total» en ajoutant du Triton X-100 pour les microtubes pour atteindre une concentration finale de 1%. Vortex les microtubes vigoureusement. REMARQUE: Aliquoter la «totale» réplique similaire aux répétitions de l&#39;expérience. Lyse acini, conduit à la libération de la teneur totale d&#39;amylase. Sinon, recueillir les acini à chaque état et lyse à la fin de l&#39;expérience, afin de déterminer le contenu cellulaire de chaque répétition. </li><li> Recueillir le plus de la suspension acinaire into le premier ensemble de microtubes pré-étiquetés. Centrifuger les microtubes de quelques secondes à 5000 x g. Transférer le surnageant dans le second ensemble de microtubes pré-étiquetés. </li><li> Doser le surnageant de l&#39;activité de l&#39;amylase avec un kit commercial. Calculer le pourcentage de l&#39;amylase sécrétée. NOTE: Il est essentiel de lire l&#39;activité de l&#39;amylase à sa gamme linéaire. Présenter le pourcentage d&#39;amylase sécrétée comme le pour cent de l&#39;amylase libérée à partir de la teneur totale initiale. Soustraire le niveau du milieu de chaque triple fond de l&#39;amylase et le diviser par le contenu total initial de même normalisée. </li></ol> 3. imagerie en direct de la sécrétion pancréatique La sécrétion de acini pancréatiques peut être contrôlé directement par imagerie en temps réel. Utilisation de différents colorants fluorescents et des capteurs, l&#39;imagerie en temps réel permet la caractérisation de sécrétion à une résolution de sous-cellulaire. <ol><li> Préparer le milieu de remise en suspension fraîchement oxygéné comme in l&#39;étape 1.1 et l&#39;amener à 37 ° C. Réglez le microscope, et s&#39;il est équipé d&#39;un régulateur de température, ajuster à 37 ° C. </li><li> Laver les cellules acineuses dans 30 ml de milieu de remise en suspension et de les placer dans une lame de verre ou de plastique. Remarque: Si des colorants lipophiles doivent être utilisés pour étiqueter Pour membrane plasmique marqué avec des colorants lipophiles, tacher les acini pour pas plus de 5 minutes pour éviter l&#39;étiquetage des membranes internes par endocytose. Tout au long de l&#39;œuvre, gérer les acini en douceur et éviter pipetage excessive. </li><li> Une fois au microscope, l&#39;image acini dont la morphologie est clair, et d&#39;éviter l&#39;imagerie de acini qui affichent des bulles basolatérales ou vacuoles intracellulaires. Ajouter goutte sécrétagogue sage ou à l&#39;aide d&#39;une chambre de perfusion, pendant ou immédiatement avant l&#39;ouverture de l&#39;imagerie. NOTE: A lentilles de zoom élevé avec des ouvertures numériques élevées (par exemple x 63 / 1,4 ou × 100 / 1.4) est recommandé d&#39;observer les structures sous-cellulaires. </li></ol> 4. O / N culture de pancréas Acini (Culture Cellulaire Autre Technique) REMARQUE: O / N culture est souvent utilisé pour l&#39;infection par le virus adéno. L&#39;infection est réalisée à 10 6 -10 7 pfu / ml pour 9 - 16 heures avant l&#39;examen. <ol><li> Culture acini pancréatiques jusqu&#39;à 20 h. Acini remises en suspension obtenus à partir d&#39;un seul pancréas dans 25 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec du sérum de veau foetal (SVF) (5%), du sodium pyruvate (1%), les antibiotiques (1%), de L-glutamine (0,5%), BSA (10 mg / ml) et STI (0,2 mg / ml), et divisé à cinq plaques de 10 cm. Infect acini de virus dans une armoire de niveau de biosécurité 3. </li><li> Incubé à 37 ° C acini pancréatiques dans un air 5% de CO 2 humidifiée. Autoriser les acini de récupérer dans un milieu de remise en suspension oxygéné pendant 30 min avant l&#39;examen ultérieur de 3,8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

En plus de la culture ex vivo, des configurations alternatives pour l&#39;étude de la sécrétion exocrine comprennent microscopie intravitale et la mesure de fluides à partir du canal pancréatique. Microscopie intravitale a été montré pour bien fonctionner dans la souris glandes salivaires 10. Cette méthode permet d&#39;enregistrer en temps réel de la sécrétion dans l&#39;animal intact, mais est limité dans sa résolution et des moyens pour manipuler le tissu exocrine. Évaluation de la s...

Le pancréas exocrine qui constitue la majeure partie de la masse du pancréas de mammifère et est dédié à la production et la sécrétion d&#39;enzymes digestives 1. L&#39;unité fonctionnelle du pancréas exocrine, l&#39;acinus, est un amas de cellules épithéliales qui forment et part une lumière commune. Lors de la stimulation hormonale ou des neurones, des vésicules remplies d&#39;enzymes sont transportés à la surface apicale de la cellule, avec le fusible et expulser son contenu dans la lumière de 1 à 3. Les enzymes sécrétées sont ensuite drainés par un ensemble de conduits de coalescence dans l&#39;intestin grêle, où elles catalysent la rupture de l&#39;alimentation en substances nutritives. Cette vidéo montre comment acini intacts sont isolés de l&#39;ensemble du pancréas et de la façon dont leur capacité de sécrétion peut être évaluée. En utilisant cette configuration, la sécrétion pancréatique est quantifiée en mesurant la quantité relative de l&#39;amylase qui a été publié après la stimulation. En variante, la sécrétion peut être visualisé en temps réel par l&#39;utilisation de différentsdes capteurs et des colorants. L&#39;ex vivo configuration des acini pancréatiques est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas intacts, peut être manipulé et contrôlé plus facilement que chez l&#39;animal entier 4-6. Cette configuration a été développé à l&#39;origine dans la fin des années 1970 et a depuis été étendu à l&#39;étude de plusieurs tissus exocrines telles que la salive et les glandes mammaires 3-7. Notamment, il permet l&#39;étude de la sécrétion minimisant les interférences avec les organisations cellulaires complexes de ces épithéliums polarisés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Les cellules acineuses pancréatiques produisent et sécrètent des enzymes digestives. Ces cellules sont organisées en grappes qui forme et actions une lumière commune. Ce travail démontre comment la capacité de sécrétion de ces cellules peut être évalué par culture de acini isolé. La configuration est avantageuse car acini isolé, qui conservent de nombreuses caractéristiques du pancréas exocrine intact peut être manipulée et contrôlée plus facilement que chez l&#39;animal entier. Une bonne isolation des acini pancréatiques est une condition essentielle pour que la culture ex vivo représentera la nature in vivo des acini. Le protocole démontre comment isoler acini intact par le pancréas de souris. Par la suite, deux méthodes complémentaires pour évaluer la sécrétion pancréatique sont présentés. Le dosage de la sécrétion d&#39;amylase sert de mesure global, tandis que l&#39;imagerie directe de la sécrétion pancréatique permet la caractérisation de sécrétion à une résolution de sous-cellulaire. Collectivement, les techniques PresenTed ici permet un large éventail d&#39;expériences pour étudier la sécrétion exocrine.

Acini pancréatiques qui ont été correctement isolé afficher une morphologie stéréotypé lorsqu&#39;il est vu par lumière transmise. Leurs domaines basolatérales doivent apparaître ronde et dépourvue de bulles. Le domaine apical est entouré par des centaines de vésicules de sécrétion et apparaît de couleur plus foncée (Figure 2A, B). Les noyaux gris centraux sont situés dans la région vésiculaire. Les débris cellulaires et les composants du système canalaire pancréatique et du pancr...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Acini pancréatiques isolés conservent leur morphologie et l&#39;activité in vivo et offrent des moyens puissants pour surveiller et manipuler la sécrétion. Ce travail démontre comment acini peuvent être isolées à partir du pancréas de souris, et la façon dont les capacités de sécrétion peuvent être évaluées.

Évaluation de la capacité sécrétoire des cellules pancréatiques acineuses

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K vues.  Weizmann Institute of Science.  Acini pancréatiques isolés conservent leur morphologie et l'activité in vivo et offrent des moyens puissants pour surveiller et manipuler la sécrétion. Ce travail démontre comment acini peuvent être isolées à partir du pancréas de souris, et la façon dont les capacités de sécrétion peuvent être évaluées. 

Vidéo: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

Isolement des cellules souches de l&#39;homme xénogreffes de cancer du pancréas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Recherche

Biologie

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d&#39;imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Phénotypage Souris fonction pulmonaire<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec le Capacité diffusion pulmonaire

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Quantification de la phagocytose épithéliale pigmentaire rétinienne et de l’accumulation de lipofuscine

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

Pleins feux sur l’auteur : Modèles améliorés de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines hautemen

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...