Nous remercions le personnel de AniCan (CRCL, Lyon) pour leur assistance technique aux soins des animaux. Ce travail a été financé par l&#39;Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), la Ligue Nationale Contre le Cancer, l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer, par l&#39;Institut National du Cancer, et par des bourses de la Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), de l&#39;Institut National du Cancer (JG), du Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche de la France (RMP et DFV) et de l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).

Toutes les procédures ont été approuvées par un comité d&#39;éthique en vertu de la réglementation de l&#39;autorité gouvernementale («Comité d&#39;Evaluation Commun au Centre Léon Bérard, à l&#39;Animalerie de transit de l&#39;ENS, au PBES et au laboratoire P4&quot; (CECCAPP)). Les souris ont été maintenus dans une animalerie sans pathogène spécifique à la &quot;Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard&quot; (Lyon, France) et traités en conformité avec les directives institutionnelles. Une représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1. 1. Dissection du pancréas et Dilacération (jour 0) Une dissection très rapide est essentiel pour un rendement optimal d&#39;extraction et d&#39;assurer une bonne viabilité des cellules en culture. Afin de réduire le temps nécessaire pour l&#39;isolement du pancréas, tous les instruments et les équipements doivent être prêts avant l&#39;euthanasie de la souris. <ol><li><html> Euthanasier souris par asphyxie au CO2 ou la dislocation cervicale. </li></ol> A partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées sous atmosphère stérile (poste de sécurité microbiologique, niveau II) avec du matériel de dissection stérile. <ol start="2"><li> Fixer la souris et pulvériser l&#39;abdomen de souris avec de l&#39;éthanol à 70%. Avec des ciseaux et des pinces à disséquer, faire une incision en forme de V à la région génitale et le poursuivre jusqu&#39;à la membrane d&#39;ouvrir complètement la cavité abdominale. </li><li> Positionner les lobes de foie contre le diaphragme, ils doivent y rester si la cavité du corps est ouverte assez loin. Tirez l&#39;intestin et le colon en dehors de la cavité abdominale à votre gauche, et de trouver le rectum. Avec une paire de pinces et de ciseaux courbes dissection, appui et la section du rectum. </li><li> Avec la même paire de forceps, déroulez soigneusement entièrement l&#39;intestin par le rectum à l&#39;estomac en tirant l&#39;intestin sur votre gauche. </li></ol>ent &quot;&gt; À cette étape, le pancréas ne peut être distinguée comme une petite bande située entre l&#39;estomac et le début de l&#39;intestin. Ses ligatures avec la rate restent intacts. <ol start="5"><li> Utilisation Noyes ciseaux et une paire de pinces, couper soigneusement le pancréas long de l&#39;intestin et de la libérer de la rate du reste de l&#39;appareil digestif. </li><li> Prenez la rate et le pancréas section qui s&#39;y rattachent (Figure 2). </li></ol> À cette étape, assurez-vous qu&#39;aucun tissu adipeux mésentérique et / ou d&#39;autres tissus adjacents (rate, intestin, etc) pourraient être recueillies avec le pancréas, pour éviter toute contamination cellulaire. Pour le reste de la procédure, tous les tampons doivent être préparés sans ion calcium Ca2 + chélateurs d&#39;éviter la dissociation complète du tissu pancréatique exocrine dans les cellules acineuses simples. <ol start="7"><li> Rincer le pancréas deux fois dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) 1x. </li></ol> À cette étape, comme les tissus adipeux flottera contrairement à pancréas qui va couler, il est facilement possible de visualiser et de supprimer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas. Si le pancréas doit être transporté à l&#39;installation de culture de cellules, il doit être conservé sur la glace dans HBSS 1x. <ol start="8"><li> Transférer le pancréas dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 ml de HBSS 1x. Utiliser Noyes ciseaux et un scalpel, découper le pancréas en petits morceaux de 1 à 3 mm 3 (figure 3A). </li></ol> 2. Dissociations enzymatiques et mécaniques du pancréas (jour 0) <ol><li> Les transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml. </li><li> Centrifuger pendant 2 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments des cellules et des cellules sanguines. </li><li> Ajouter 10 ml de solution IA collagénase (HBSS 1x contenant 10 mM HEPES, 200 U / ml de CollagenaSE IA et 0,25 mg / ml d&#39;inhibiteur de trypsine) à des sections de pancréas. Avec une pipette sérologique 25 ml, transférer à un flacon de 25 cm2. Incuber pendant 20-30 min à 37 ° C. Pendant ce temps (5 min), effectuer une dissociation mécanique par déplacement énergiquement va-et-vient des fragments de pancréas dizaine de fois, dans des pipettes stériles de taille décroissante (25, 10, et 5 pipettes sérologiques ml). </li></ol> À cette étape, il est essentiel de surveiller fréquemment la mesure de la dissociation enzymatique des sections du pancréas. <ol start="4"><li> Lorsque le tissu pancréatique semble être bien dissocié (en fonction de la disparition de fragments du pancréas et de l&#39;augmentation de la turbidité de la solution) (figure 3B), arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 10 ml de froid tamponnée solution de lavage (HBSS 1x contenant 5 % de sérum foetal bovin (FBS) et HEPES 10 mM). </li><li> Transférer dans un tube en polypropylène stérile de 50 ml et centrifuge pendant 2 minutes à 450 x g et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant pour éliminer la solution IA collagénase. </li><li> Remettre en suspension et laver le culot avec 10 ml de solution de lavage tamponnée. Centrifuger 3 min à 450 xg et 4 ° C. Aspirer délicatement et jeter le surnageant. Répétez cette étape deux fois. </li></ol> 3. La filtration et l&#39;ensemencement de Dispersés Acini (jour 0) <ol><li> Reprendre le culot cellulaire dans 7 ml de milieu de Waymouth contenant 2,5% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine mélange (PS), 0,25 mg / ml d&#39;inhibiteur de trypsine, et 25 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain recombinant (FEM). </li><li> Filtrer le mélange de cellules en lui permettant de passer à travers un filtre pour retenir les fragments non digérés (canaux, les vaisseaux sanguins, et les îlots de Langerhans) 100 um. structures acineuses pancréatiques (acinus des cellules 10-15) passent à travers. </li><li> Rincez le filtre avec 6 ml de milieu FBS contenant de Waymouth, PS, trypsine habibitor et EGF. </li></ol> Après cette étape, les cellules doivent être traitées avec soin, afin d&#39;éviter tout acini dissociation. <ol start="4"><li> Seed acini isolé dans une boîte de culture à 6 puits (2 ml par puits) (figure 3C). Culture eux à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) 2. </li></ol> Après cette étape, les cellules acineuses sont cultivées en suspension. 4. Acinaire culture cellulaire (jour 1 à 10) <ol><li> Vingt-quatre heures après, transférer les acini (en suspension) dans une nouvelle boîte de culture à 6 puits, afin d&#39;éliminer les cellules contaminantes et les débris cellulaires qui ont adhéré pendant la nuit (figure 4). </li></ol> Si la culture cellulaire doit être prolongée pendant plusieurs jours ou si les conditions expérimentales exigent cellules cultivées en monocouche, il est recommandé de transfert et de semences acini sur des échafaudages matrice. <ol start="2"><li> La veille de voirDing sur la matrice de support (jour 0), manteau une boîte de culture à 6 puits avec collagène de type I (5 mg / cm 2). Ajouter 1 ml de solution de collagène de type I (50 ug / ml dans l&#39;acide acétique 0,02 M, 0,2 um-filtrée) à chaque puits et permettre de manière passive s&#39;adsorber sur du plastique, pendant 1 h à 37 ° C (ou pendant une nuit à 4 ° C ). </li><li> Aspirer le type solution de collagène de type I et rincez-le bien couché deux fois avec un tampon phosphate salin 1x. </li><li> Autoriser l&#39;enduit bien sécher (sous un poste de sécurité microbiologique) au moins 12 heures avant utilisation. </li><li> Transférer le primaire acini isolé (obtenu à l&#39;étape 4.1) dans le plat je enduite de collagène 6 puits culture et la culture dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment (à 37 ° C sous 5% de CO atmosphère (v / v) 2) Type . Les cellules adhèrent au substrat de collagène de type I pendant 2 jours. </li><li> Au jour 3, changer le milieu de culture pour éliminer les cellules non viables qui n&#39;ont pas adhéré. Avec le temps, la culture, les cellules vont progressivement splu sur le support contenant du collagène. Changer le milieu de culture tous les 3 jours (Figure 5). </li></ol> Les cellules acineuses isolées obtenues peuvent être comptés, après une dissociation mécanique complète en utilisant une chambre de comptage de cellule de Thoma. Notez que les cellules acineuses isolées ne peuvent pas être maintenues en culture par la suite. La qualité de la culture acinaire obtenue peut être contrôlée en contrôlant l&#39;expression de marqueurs spécifiques acinaires comme Trypsinogen, Pancréas Transcription Factor 1 sous-unité alpha, ou Carboxypeptidase A1 (par immunohistochimie ou immunofluorescence expériences).

<ol>
	<li>Lardon, J., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaplasia+in+the+pancreas.">Metaplasia in the pancreas.</a> Differentiation. 73, 278-286 (2005).</li><li>Sphyris, N., Logsdon, C. D., Harrison, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retention+of+zymogen+granules+in+cultured+murine+pancreatic+acinar+cells+and+induction+of+acinar-ductal+transdifferentiation+in+vitro.">Improved retention of zymogen granules in cultured murine pancreatic acinar cells and induction of acinar-ductal transdifferentiation in vitro.</a> Pancreas. 30, 148-157 (2005).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+I.+Dissociation+technique+and+morphologic+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1037-1056 (1974).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+dispersed+pancreatic+exocrine+cells.+II.+Functional+characteristics+of+separated+cells.">Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. II. Functional characteristics of separated cells.</a> J. Cell. Biol. 63, 1057-1073 (1974).</li><li>Schultz, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guinea+pig+pancreatic+acini+prepared+with+purified+collagenase.">Guinea pig pancreatic acini prepared with purified collagenase.</a> Exp. Cell Res. 130, 49-62 (1980).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+binding+and+biologic+effects+on+mouse+pancreatic+acini.">Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).</li><li>Han, B., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+induction+of+mob-1+chemokine+expression+in+pancreatic+acinar+cells+requires+NF-kappaB+activation.">Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation.</a> Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).</li><li>Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+between+rat+and+mouse+CCKA+receptors+determine+the+divergent+acinar+cell+response+to+the+cholecystokinin+analog+JMV-180.">Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180.</a> J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).</li><li>Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+induces+expression+of+cytokine-induced+SH2+protein+(CIS)+in+rat+brain+astrocytes:+involvement+of+phospholipase+A2,+cyclooxygenase,+and+lipoxygenase.">Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase.</a> Glia. 48, 102-111 (2004).</li><li>Gaiser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activation+of+trypsinogen+in+transgenic+mice+induces+acute+but+not+chronic+pancreatitis.">Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis.</a> Gut. 60, 1379-1388 (2011).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+acinar+cells+in+monolayer+culture:+direct+trophic+effects+of+caerulein+in+vitro.">Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro.</a> Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).</li><li>Stanger, B. Z., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+cellular+origins+of+pancreatic+cancer.">Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer.</a> Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tif1gamma+suppresses+murine+pancreatic+tumoral+transformation+by+a+smad4-independent+pathway.">Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway.</a> Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+TIF1gamma+cooperates+with+Kras+to+induce+cystic+tumors+of+the+pancreas.">Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas.</a> PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+pancreatic+alpha,+beta,+duct+and+acinar+populations+with+cell+surface+markers.">Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers.</a> Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).</li><li>Case, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+intracellular+transport+and+discharge+of+exportable+proteins+in+the+pancreatic+acinar+cell+and+other+cells.">Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Dans ce protocole, nous décrivons une procédure pour isoler des cellules acineuses du pancréas. Cette méthode permet d&#39;isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par animal en moins d&#39;une heure. Merci à sa mise en œuvre simple et rapide (moins de 10 pancréas peuvent être traitées indépendamment par expérience en parallèle), ce protocole apparaît comme un bon compromis entre les méthodes d&#39;isolation existants 3-5,9-12,17. Les étapes critiq...

Un problème fréquemment rencontré dans les laboratoires de recherche travaillant sur ​​le tissu pancréatique exocrine est la difficulté de cultiver des cellules acineuses in vitro pour une période de temps suffisamment longue pour permettre une expérience à long terme. Un facteur entravant le développement de ces systèmes de culture est la sensibilité intrinsèque du tissu pancréatique à la manipulation expérimentale en raison de la forte teneur en enzymes de la glycolyse, protéolytique et lipolytique, qui digèrent littéralement le tissu pancréatique quand ils sont libérés au cours de l&#39;isolement des cellules pancréatiques. Un deuxième facteur est la remarquable plasticité in vitro des cellules acineuses, qui ont tendance à perdre leurs caractéristiques sécrétoires et transdifférencier à d&#39;autres cellules matures, telles que les cellules canalaires pancréatiques ou de cellules hépatocytes comme 1. In vitro, cette plasticité cellulaire varie avec les conditions expérimentales (tels que la composition du milieu de culture) 2 </sup&gt; et présente un degré de complexité dans la conception des conditions de culture appropriées pour les cellules pancréatiques exocrines 1. Plusieurs méthodes ont été développées pour l&#39;isolement et la culture des cellules acineuses, premier du pancréas de porc Guinée 3-5. Initialement, ces protocoles impliqués digestion du tissu pancréatique avec de la collagénase, la chymotrypsine, et un cocktail de protéase, avec isolation ultime par dissociation mécanique vigoureuse. Les cellules pancréatiques isolés de cette manière affichées caractéristiques structurelles et fonctionnelles anormales, notamment une perte des structures apicales et des dommages importants à leurs récepteurs membranaires. Les cellules isolées sont restées viables pour seulement 1 ou 2 jours. Préparation de la dispersion acini maintient leur architecture intra-et intercellulaires, en préservant les membranes cellulaires, ce qui limite les dommages aux récepteurs de surface, et d&#39;améliorer ainsi la sécrétion exocrine en réponse aux sécrétagogues 6-8. Comme une result, cette méthode offre l&#39;avantage majeur de l&#39;extension de la viabilité des cellules acineuses à 7-10 jours in vitro. En outre, cette méthode est actuellement préférable à l&#39;isolement des cellules acineuses 9-12 parce que l&#39;entretien de contacts intercellulaires, y compris les assemblages de cellules par les jonctions communicantes, est un déterminant essentiel du pancréas phénotype des cellules acineuses exocrine 13. Comme la dédifférenciation des cellules acineuses et leur transdifférenciation de cellules canalaires est l&#39;un des mécanismes proposés pour la genèse des cancers du pancréas exocrine agressifs 14, les acini modèle dispersée est également un système adéquat pour étudier la plasticité du pancréas et de ses mécanismes moléculaires ultérieures. En outre, en combinaison avec l&#39;utilisation d&#39;animaux génétiquement modifiés 15,16 et le développement des techniques de transfert de gènes (adénovirus 2 ou transduction lentiviraux, l&#39;utilisation de nanoparticules, etc), ce modèle de cellule acineuse primaire in vitro peutêtre très utile pour déterminer comment divers dysfonctionnements génétiques affectent la régulation de la différenciation des cellules acineuses ou dédifférenciation et devraient permettre de mieux comprendre les événements moléculaires responsables de l&#39;apparition d&#39;une pancréatite, des lésions précancéreuses et des changements dans la plasticité cellulaire. Isolation des dispersé acini est l&#39;approche que nous utilisons dans notre laboratoire pour la culture des cellules acineuses du pancréas. Nous décrivons ici et de discuter de la méthode utilisée. Elle implique la dissociation enzymatique du tissu pancréatique (avec une collagénase bactérienne) couplé à une rupture mécanique sans dissociation des cellules acineuses. Alors que la plupart des protocoles impliquent la culture de la acini, soit en suspension ou sur des substrats plastiques spécialement traités, nous les cultivons en suspension que brièvement (pendant 24 heures), les semis plus tard sur les échafaudages de la matrice si la culture cellulaire prolongé est nécessaire. Ce protocole permet l&#39;isolement rapide (en moins de 1 h) de dispersion pancréas acini, durable pendant plus d&#39;une semaine de culture. Il permet d&#39;isoler plus de 20 x 10 6 cellules acineuses par le pancréas de souris. Sa simplicité permet de traiter indépendamment jusqu&#39;à 10 pancréas en parallèle. En conservant l&#39;architecture intra-et intercellulaires des acini et donc le phénotype des cellules acineuses des cellules primaires isolées, ce modèle constitue un système de choix pour l&#39;étude des mécanismes de la transdifférenciation, comme tous les autres modèles pancréatiques exocrines actuellement disponibles sont dérivées de tumeurs pancréatiques affichant de nombreuses génétique altérations conduisant à la transformation cellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.2 &mu;m filter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>146560</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 &mu;m filter</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1000 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>20 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>200 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357535</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml polypropylene tube</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2676</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Curved forceps, Dumont #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14188</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting scissors, straight</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epidermal Growth Factor, human</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>C-60180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol absolute (AnalaR Normapur)</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumont #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14098</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hank's Balanced Salt Solution 1x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator O2/CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet, level II</td>
			<td>Faster</td>
			<td>SafeFast Elite 212 S</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Noyes scissors, sharp/sharp tips, German</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500228-G</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount Surgimed Ltd.</td>
			<td>Disposable Scalpel Size 23</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T25 flask, 25 cm2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707481</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin inhibitor, from Glycine Max</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Waymouth's medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31220-023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells

Ce protocole permet d&#39;isoler rapidement (en moins de 1 h) de acini du pancréas murin, ce qui permet de les maintenir en culture pendant plus d&#39;une semaine. Plus de 20 x 10 6 cellules acineuses peuvent être obtenus à partir d&#39;un seul pancréas murin. Ce protocole offre la possibilité de traiter indépendamment jusqu&#39;à 10 pancréas en parallèle. Car elle préserve l&#39;architecture acinaire, ce modèle est bien adapté à l&#39;étude de la physiologie du pancréas exocrine in vitro contrairement aux lignées cellulaires de tumeurs pancréatiques, qui affichent de nombreuses modifications génétiques résultant de la perte partielle ou totale de leur différenciation des cellules acineuses.

La figure 1 schématise le &quot;dispersé&quot; méthode acini des cellules d&#39;isolement acinaire primaire. Les étapes critiques, qui doivent être strictement respectées pendant le protocole, sont décrites dans la partie de la discussion. Pour faciliter son retrait, le pancréas doit être recueillie à partir de l&#39;abdomen avec la rate jointe (figure 2). Les deux organes doivent être coupées à part, et le tissu adipeux résiduel qui pourrait ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells at JoVE.com

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

isolation-and-culture-of-mouse-primary-pancreatic-acinar-cells

Research

JoVE Journal

Biology

35.3K vues.  Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.  Dans cette publication, nous décrivons une procédure rapide et pratique pour les cellules acineuses pancréatiques primaires culture du pancréas murin isoler et. Cette méthode constitue une approche intéressante à étudier la physiologie des cellules pancréatiques exocrines normales / non transformé primaires fraîches. 

Vidéo: Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Recherche

Biologie

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d&#39;imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

Évaluation de la capacité sécrétoire des cellules pancréatiques acineuses

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolement et culture de kératinocytes oraux primaires du palais de souris adulte

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...