Le protocole permet une fonction isolée rapide de petites sous-populations de cellules dans les îlots pancréatiques de Langerhans. Les avantages de cette technique incluent la nature en temps réel et la puissance statistique élevée, et donc la reproductibilité élevée, des données acquises. Pour immobiliser les îlots pour l’imagerie, assemblez une chambre d’imagerie pour un microscope inversé et placez un couvercle en verre à l’intérieur de la chambre.
Assurez-vous que l’interface de la chambre de verre est étanche et confirmez que le glissement du couvercle est à la portée de l’objectif du microscope. Ensuite, coupez 20 carrés de 20 millimètres de maille fine et grossière et utilisez de 45 à 50 micromètres de ruban adhésif épais pour créer deux murs d’espacement sur un morceau de maille fine. Immerger le maillage grossier et le poids dans une boîte de Pétri de 35 millimètres de solution d’imagerie, et placer le maillage fin sous un microscope disséquant.
Tournez la maille fine avec les murs de l’espaceur à l’envers et les entretois orientés vers le haut. Et utilisez une pipette p20 pour transférer plusieurs îlots entre les deux astronautes. À l’aide des forceps des horlogers, placez le maillage à l’envers à l’intérieur de la chambre d’imagerie du microscope inversé de sorte que les entretois face vers le bas pour s’asseoir directement sur la feuille de couverture de la chambre, piégeant les îlots entre les entre les entretois et le maillage au milieu de la feuille de couverture.
Faites en sorte que le maillage soit bien hydraté sans contenir des volumes excessifs de solution qui provoqueraient le mouvement latéral de l’échantillon. Placez ensuite le maillage grossier et le poids sur le maillage fin dans la chambre, et ajoutez la solution d’imagerie à la chambre. Une fois que les îlots ont été immobilisés, sélectionnez le mode d’imagerie et l’objectif sur le microscope inversé et placez la chambre avec les îlots au stade contrôlé par la température du microscope.
Après avoir réglé la perfusion, placez l’afflux plus bas que le flux sortant à l’intérieur de la chambre et réglez le flux de sortie pour être supérieur au flux d’afflux. Assurez-vous que l’écoulement a un contact minimal avec la solution de sorte qu’il supprime la solution dans plusieurs petites gouttelettes séquentielles, en évitant de longs intervalles de suppression continue de la solution. Ensuite, lancez la perfusion avec une solution d’imagerie contenant trois millimolaires de glucose, et sélectionnez le chemin lumineux et les filtres pour l’imagerie des fluorophores verts.
Exécutez ensuite l’imagerie en direct pour configurer les paramètres d’imagerie et ajuster la vue pour capturer les îlots d’intérêt. Pour optimiser le rapport signal-bruit de l’image, ajustez l’intensité lumineuse d’excitation, le temps d’exposition et le binning, en veillant à ce que les paramètres permettent une visualisation distincte de chaque cellule à l’intérieur des îlots à l’intensité lumineuse et à l’exposition minimales possibles. Puis imagez les îlots à 0,1 à 5 hertz, en vérifiant la qualité des données acquises telles qu’elles sont capturées.
Lorsque l’activité des cellules alpha est détectable, utilisez un graphique en ligne de la dynamique du signal dans le logiciel d’acquisition que possible et ajoutez de l’adrénaline ou du glutamate dans la solution de bain pendant deux à cinq minutes. Un saut rapide en calcium suivi d’un ralentissement ou d’une annulation des oscillations des cellules alpha sera observé. Ensuite, ajouter la ghréline, qui a été récemment signalé pour activer les cellules delta sélectivement.
Une augmentation réversible rapide du calcium sera observée dans une petite sous-population de cellules d’îlots. Ajouter ensuite 10 millimolaires de glucose. Une réponse oscillatoire coordonnée dans la sous-population de cellules bêta sera observée.
Notez également les réponses des cellules qui ont été précédemment activées par l’adrénaline ou le glutamate et la ghréline. Après avoir sauvé les images, importez les données dans un logiciel d’analyse de données approprié et normalisez les données d’intensité de fluorescence brute à la valeur initiale de la fluorescence. Si l’ensemble de données sur l’intensité de la fluorescence de la variabilité cellule à cellule est encore important, définissez une région de contrôle pour la plage de temps pendant laquelle la solution de contrôle a été appliquée.
Si la région de contrôle a un signal non oscillatoire clair, supposons que l’intensité de fluorescence est revenue à la ligne de base après chaque application de la solution de commande. Pour corriger les données de laps de temps pour chaque cellule, divisez les données en segments séparés par les points où la solution de contrôle a été ajoutée et appliquez une correction linéaire à chaque segment. Si la plage de contrôle présente des oscillations claires ou si d’autres facteurs sont présents, utilisez un algorithme de détection des pointes.
Pour mesurer la fréquence des pointes de calcium et la réponse à l’ajout d’agonistes et d’antagonistes, divisez l’enregistrement en intervalles de temps égaux, comptez les pointes dans l’intervalle et normalisez la durée de l’intervalle pour calculer le cours du temps de la fréquence partielle. Alternativement, définissez le seuil et calculez la fraction du plateau pour chacun des intervalles. La fraction indique le pourcentage de temps dans l’intervalle que la cellule a passé dans l’état excité.
Ou calculer la zone partielle sous la courbe pour chacun des intervalles. À moins que la composition lipidique de la membrane n’ait été affectée, les îlots se chargent assez bien avec des dyes tropicaux. Le vecteur humain de type 5 de l’adénovirus cible également avec succès les cellules des îlots.
La poussée de calcium dans les cellules alpha peut être facilement détectée à de faibles niveaux de glucose, et il existe une corrélation cellule par cellule élevée entre l’activité à faible taux de glucose et la réponse à l’adrénaline et au glutamate. Ghrelin active certaines cellules sensibles à l’adrénaline à faible taux de glucose, mais n’a aucun effet sur la dynamique du calcium dans la plupart des cellules qui sont activées par un faible taux de glucose. Lorsqu’elles sont analysées en termes de fréquence partielle, les cellules stimulées par l’adrénaline ou la ghréline affichent une augmentation substantielle dans les conditions de tout ou rien, bien que les changements globaux entre le spiking basal et l’effet d’adrénaline soient subtils.
En revanche, la zone partielle sous la courbe est sensible aux changements introduits par l’adrénaline dans toutes les cellules, même lorsque l’activité basale est élevée. Assurez-vous que tous les mailles sont en contact avec la solution d’imagerie et prenez soin de positionner le tissu raisonnablement densément pour éviter les bulles d’air. La méthode peut être étendue pour inclure l’intelligence artificielle pour la différenciation entre les types de cellules.
Les marqueurs pharmacologiques peuvent être remplacés par la technologie de reconnaissance des motifs, réduisant ainsi le temps d’enregistrement.
