Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health Grant DK083327 et DK093491 (à SZH).

1. Préparer les cellules acineuses pancréatiques pour l&#39;imagerie calcique <ol><li> Préparer le tampon d&#39;incubation HEPES contenant HEPES 20 mM, NaCl 95 mM, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,3 mM CaCl2, 10 mM de glucose, glutamine 2 mM, et 1 × acides aminés non essentiels moyen de minimum aigle. Ajustez la solution finale à pH 7,4 avec NaOH. </li><li> Préparation d&#39;un tampon d&#39;incubation par addition de BSA (BSA 1% p / v final) à 25 ml du tampon d&#39;incubation HEPES (décrit plus haut). </li><li> Préparation d&#39;un tampon de digestion à la collagénase en ajoutant 1,1 mg / ml (200 unités / ml) de type 4 de la collagénase et de 1 mg / inhibiteur de trypsine de soja ml à 6 ml de tampon d&#39;incubation BSA (décrit plus haut). </li><li> Acid-wash mm lamelles 22x22 par immersion en deux parties HNO 3 et une partie HCl pendant 2 h. Puis décanter avec de l&#39;eau DI et de stocker dans l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Euthanasier une souris par asphyxie au CO2. Orient l&#39;animal en décubitus dorsal, et préparer la surface abdominale par cleAning avec de l&#39;éthanol à 70%. Effectuez une laparotomie pour exposer la cavité abdominale. Disséquer le pancréas et rincer immédiatement dans un petit bateau peser contenant 6 ml de tampon de digestion par la collagénase. </li><li> Disséquer les gros morceaux de vaisseaux sanguins gras ou visible, puis retirez 5 ml de tampon de digestion à la collagénase et ajoutez-le au tube conique de 15 ml. </li><li> Avec des ciseaux de dissection fines mâche le pancréas dans le bateau pesant petit contenant 1 ml de tampon de digestion par la collagénase. Hachez jusqu&#39;à ce que la solution résultante apparaît dispersée uniformément. </li><li> Transférer le produit hachée dans un flacon en plastique 125 Erlenmeyer, puis ajoutez le reste de 5 ml de tampon de digestion par la collagénase dans le récipient. Assurez-vous que le tissu est entièrement immergé dans un tampon. </li><li> Placer la fiole dans un bain ° C de l&#39;eau 37 et serrer à 90 tours par minute pendant 30 minutes. Pendant ce court laps de temps d&#39;arrêt, préparer des agonistes d&#39;activation de calcium (par exemple caeruléine, carbachol) et rincer le couvercle 22x22 mm lavé à l&#39;acideglissades d&#39;eau DI. Sec, puis placer au-dessus d&#39;une surface plane bordée par le film laboratoire. </li><li> Après les 30 min digest est terminée, transférer la suspension arrière au tube conique de 15 ml et de permettre aux cellules de se déposer. Pipette délicatement le tampon de digestion à la collagénase et la remplacer par 6 ml de tampon d&#39;incubation BSA. Agiter vigoureusement le tube la main pendant 10 s, afin de disperser les cellules dans des secteurs plus restreints. Immédiatement après la secousse, enlever toute grande, débris flottants dans les médias en suspens. </li><li> Laisser les cellules restantes de s&#39;installer, et d&#39;échanger des médias avec un tampon d&#39;incubation BSA frais. </li><li> Répétez l&#39;étape 1.11 deux fois, jusqu&#39;à ce que la suspension est composée de seulement de petits groupes qui ne sont finement visible à l&#39;œil nu. Les cellules doivent ressembler à celles représentées sur la figure 1A (rangée du haut). </li><li> Retirez le tampon d&#39;incubation BSA et le remplacer par un tampon d&#39;incubation HEPES. </li><li> Préparer un 750 uM, stock 100X de Fluo-quatre heures dans 10% DMSO. </li><li> Charger les cellules dans le tube conique de 15 ml contenant de la suspension cellulaire et du tampon d&#39;incubation exempt de HEPES BSA. Pour ce faire, ajoutez un volume approprié (1:100 dilution) de la solution mère de la suspension cellulaire. Puis la plaque 500 pi de cette suspension sur chaque lamelle 22x22 mm. </li><li> Gardez lamelles dans l&#39;obscurité, à température ambiante. Prenez la première Ca 2 + mesures 30 min après le chargement. Le colorant est automatiquement éliminé du milieu lors du démarrage de la perfusion, ce qui devrait avoir lieu 30 minutes après le chargement colorant. </li></ol> 2. Mesure de calcium dans les cellules acineuses pancréatiques <ol><li> Rincez chaque perfusion set-up avec de l&#39;eau DI et remplir avec une quantité appropriée de tampon ou un agoniste. Premier chaque seringue avec un tampon ou un agoniste d&#39;assurer un débit correct. Pince seringues à un anneau reposer environ 1-2 mètres au-dessus de la platine du microscope. </li><li> Utilisez des pinces fines pour saisir soigneusement de sa une suspension de cellules contenant de lamelle de bord. Inclinez le couvercleglisser 45 °, et permettre à l&#39;excès de tampon de s&#39;écouler. Placer la lamelle couvre-objet sur ​​le dessus du joint en caoutchouc avec les cellules au-dessus de la lamelle couvre-objet, et à assembler la chambre (figures 2A et 2B). </li><li> Fixer la chambre d&#39;irrigation à la scène et insérer le tube qui contient du tampon dans la première entrée de la chambre (figure 2C). Tourner la seringue contenant le tampon et de permettre à la mémoire tampon pour perfuser sur toute la surface de la lamelle. Une fois que le tampon a atteint l&#39;extrémité opposée de la chambre, insérer une ligne de vide dans l&#39;entrée d&#39;aspiration. Insérez les autres tubes (contenant des agonistes, inhibiteurs, etc) dans leur position appropriée le long de la chambre. </li><li> Visualiser les cellules en utilisant soit une, 1,4 objectif d&#39;ouverture numérique 200X ou 400X et un laser à argon à exciter le colorant Fluo-quatre heures à une longueur d&#39;onde de 488 nm (figure 1A, en bas). Les réglages de puissance du laser doit être ajustée de telle sorte que le tube photomultiplicateur (PMT) N&#39;est pas saturé par la lumière émise. En outre, la tension aux bornes de la PMT doit être optimisée pour la détection de lumière maximale. </li><li> Des signaux d&#39;émission passe-long de&gt; 515 nm sont collectées en utilisant une vitesse de trame de 2-5 sec / trame pour visualiser les modèles d&#39;oscillation lente et de 0,2 à 0,3 sec / trame pour visualiser plus rapide, les ondes de calcium globaux (figures 3 et 4). </li><li> Après l&#39;exposition est terminée, fermez les seringues et retirer tous les tubes. Démontez la chambre et répétez les étapes 2.2-2.4. </li><li> Recueillir des données sous forme de valeurs numériques d&#39;intensité de fluorescence au cours du temps et le transfert à l&#39;image J (logiciel fourni sous forme de freeware par le National Institutes of Health et peut être trouvé à <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). </li><li> Voir les images cellulaires en temps réel et d&#39;identifier les régions d&#39;intérêt (ROI, c&#39;est-apicale, basolateral, nucléaire, etc) </li><li> Acquérir des intensités de fluorescence pour ces régions d&#39;intérêt et represent comme intensité de fluorescence / base intensité de fluorescence (ie f/f0). </li><li> Générer des tracés en traçant F / F 0 vs temps. En plus des tracés, des images représentatives sont généralement fournies et affichées à l&#39;aide pseudocouleur. </li></ol> 3. Préparation des cellules acineuses pancréatiques pour les dosages des blessures cellulaires <ol><li> Chaudes DMEM F-12 médias (sans rouge de phénol) à 37 ° C. </li><li> Ajouter BSA (0,1% v / v final), et de l&#39;HCl (50 pM final) aux DMEM F-12 médias. </li><li> Aliquote de 50 ml de milieu DMEM dans un tube conique. </li><li> Préparer un tampon de collagénase par addition de 0,5 mg / ml (12 U / ml) de la collagénase de type IV de 10 ml de DMEM supplémenté F-12 médias. </li><li> Euthanasier une souris par asphyxie au CO2. Orient l&#39;animal en décubitus dorsal, et préparer la surface abdominale par un nettoyage à l&#39;éthanol à 70%. Effectuez une laparotomie pour exposer la cavité abdominale. Disséquer le pancréas et rincer immédiatement dans un petit bateau pesant contenant 6 ml de tampon de collagénase. </li><li> Hachez le tissu avec des ciseaux de dissection fines pendant 3-5 min ou jusqu&#39;à ce que la solution résultante apparaît dispersée uniformément. </li><li> Transférer le tissu haché dans une fiole Erlenmeyer 125 avec 5 ml de tampon de collagénase supplémentaire, puis le placer dans un 37 ° C au bain d&#39;eau sous agitation à 90 rpm pendant 5 min. </li><li> Retirer du shaker, permettent aux cellules de s&#39;installer brièvement, et d&#39;échanger avec 5 ml de tampon de collagénase frais. Puis incuber pendant une 35 min supplémentaires à 37 ° C au bain d&#39;eau sous agitation à 90 rpm. </li><li> Vigoureusement remettre le digest aide d&#39;une pipette de transfert jusqu&#39;à la suspension apparaît homogène sans grumeaux cellulaires évidentes. Puis ajouter doucement la suspension de cellules à travers un tamis de nylon de mouillage préalable dans un Erlenmeyer. </li><li> Vigoureusement pipette une supplémentaire de 3 ml de DMEM frais F-12 médias (avec de la collagénase) à travers les mailles, afin de forcer à travers toutes les cellules restantes. </li><li> Ajouter un autre 6-10 ml de DMEM F-12 des médias et uneermettez les cellules se contenter de 2-3 min. Répétez cette étape deux fois, et retirer le surnageant après le lavage final. </li><li> Ajouter DMEM frais F-12 médias, remettre en suspension les cellules, et la plaque 500 pl de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 48 puits. Les cellules doivent ressembler à celles représentées sur la figure 1B. </li><li> Laisser la plaque de s&#39;asseoir dans ° C au bain-marie à 37 à 90 tours par minute pendant 5 min avant d&#39;ajouter agonistes. </li><li> Stimuler les cellules avec des agonistes variant de 2-4 heures. </li><li> Inclinez la plaque à un angle pour permettre aux cellules de se déposer et la pipette avec précaution une partie aliquote de médias (généralement 100 pi) et de gel rapide dans l&#39;azote liquide. </li><li> Un gel de la suspension cellulaire restant. Congélation Flash n&#39;est pas indispensable pour les mesures LDH. Comme alternative échantillons peuvent être conservés dans la glace si elles seront analysés le même jour ou stockés dans des -20 ° C pour le stockage à long terme. </li></ol> 4. Mesure de l&#39;étanchéité de la lactate déshydrogénase <ol><li&gt; Mesure lactate déshydrogénase (LDH) fuite principalement en utilisant les réactifs et les instructions fournis dans le kit CytoTox 96 de test de cytotoxicité non radioactif Promega (voir le tableau des réactifs et matériels spécifiques). </li><li> Reconstituer le substrat LDH (qui est fourni dans le kit) avec 12 ml de tampon d&#39;essai (également fourni). </li><li> Dégeler suspension de cellules congelées échantillons de milieu dans un bain d&#39;eau à température ambiante. </li><li> Plate 50 ul de chaque échantillon médias dans une plaque de 96 puits. </li><li> Pour la suspension de cellules, ajouter le volume nécessaire de tampon de lyse 10X de telle sorte que la concentration finale est 1X. Vortex brièvement et incuber à 37 ° C pendant 60 min. </li><li> Centrifuger les échantillons lysées à 250 g pendant 4 min à débris culot cellulaire. </li><li> Pour lysats cellulaires, plaque 50 pi d&#39;une dilution 1:10 dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits. </li><li> Ajouter 50 ul de substrat reconstitué dans chaque puits, incuber la plaque dans l&#39;obscurité à la température ambiante pendant 30 min. </li><li> Arrêter la réaction enajoutant 50 pl de la solution d&#39;arrêt (fourni dans le kit) dans chaque puits. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 490 nm. </li><li> Utilisez la formule suivante pour calculer% LDH fuite. Les densités optiques suivantes sont corrigées en soustrayant une lecture OD vide à partir d&#39;un puits contenant uniquement PBS, le substrat et la solution d&#39;arrêt. </li></ol> LDH dans les médias = (Media OD492) x (facteur de dilution médias) x (vol. des médias) * Comme il n&#39;est généralement pas nécessaire de diluer les échantillons des médias, le facteur de dilution sera le plus souvent Equal1. LDH totale = ((lysat OD 490) x (facteur de dilution lysat) x (vol. en suspension de cellules)) + ((Media OD 490) x (facteur de dilution) x (vol. des médias aliquotés pour l&#39;échantillonnage)) <img alt="Équation 1" fo:src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50391/50391eq1.jpg" /> 5. Infecter les cellules acineuses pancréatiques avec un adénovirus <ol><li> Préparercellules acineuses pancréatiques telles que décrites dans la section 3. </li><li> Après l&#39;étape 3.12, ajouter 10 7 unités infectieuses (IFU) d&#39;adénovirus à la suspension de cellules et incuber pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Uniformément plaque 2 ml de suspension cellulaire dans une plaque à 6 puits. </li><li> Pour la plupart des constructions d&#39;expression, les cellules doivent être suffisamment infectés dans les 18 heures, et pour certaines constructions luciférase, juste au sein de 6 heures. </li></ol>

<ol>
	<li>Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+agonist-evoked+cytoplasmic+Ca2++signals+in+exocrine+acinar+cells+analysed+by+digital+image+microscopy.">Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy.</a> Embo J. 11, 1623-1629 (1992).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolar+and+submicromolar+Ca2++spikes+regulating+distinct+cellular+functions+in+pancreatic+acinar+cells.">Micromolar and submicromolar Ca2+ spikes regulating distinct cellular functions in pancreatic acinar cells.</a> Embo J. 16, 242-251 (1997).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor+mediates+early+zymogen+activation+in+pancreatitis.">The ryanodine receptor mediates early zymogen activation in pancreatitis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14386-14391 (2005).</li><li>Raraty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+enzyme+activation+and+vacuole+formation+in+the+apical+granular+region+of+pancreatic+acinar+cells.">Calcium-dependent enzyme activation and vacuole formation in the apical granular region of pancreatic acinar cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13126-13131 (2000).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+mitigates+caerulein-induced+pancreatitis+in+vivo+in+mice.">Dantrolene mitigates caerulein-induced pancreatitis in vivo in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299, G196-G204 (2009).</li><li>Shah, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+Activation+during+in+vivo+Pancreatitis+is+Dependent+upon+Calcineurin+Activation.">Protease Activation during in vivo Pancreatitis is Dependent upon Calcineurin Activation.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2009).</li><li>Muili, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+and+genetic+inhibition+of+calcineurin+protects+against+carbachol-induced+pathologic+zymogen+activation+and+acinar+cell+injury.">Pharmacologic and genetic inhibition of calcineurin protects against carbachol-induced pathologic zymogen activation and acinar cell injury.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Orabi, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+enhances+carbachol-induced+protease+activation+and+accelerates+Ca2++waves+in+isolated+rat+pancreatic+acini.">Ethanol enhances carbachol-induced protease activation and accelerates Ca2+ waves in isolated rat pancreatic acini.</a> J. Biol. Chem. 286, 14090-14097 (2011).</li><li>Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O'Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Ca2++wave+propagation+in+pancreatic+acinar+cells.">Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 267, 18118-18121 (1992).</li><li>Reed, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+extracellular+pH+induces+damage+in+the+pancreatic+acinar+cell+by+enhancing+calcium+signaling.">Low extracellular pH induces damage in the pancreatic acinar cell by enhancing calcium signaling.</a> J. Biol. Chem. 286, 1919-1926 (2011).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Van Acker, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+progression+locus-2+is+a+critical+regulator+of+pancreatic+and+lung+inflammation+during+acute+pancreatitis.">Tumor progression locus-2 is a critical regulator of pancreatic and lung inflammation during acute pancreatitis.</a> J. Biol. Chem. 282, 22140-22149 (2007).</li><li>Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+control+of+multiple+forms+of+Ca(2+)+spikes+by+inositol+trisphosphate+in+pancreatic+acinar+cells.">Kinetic control of multiple forms of Ca(2+) spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells.</a> J. Cell Biol. 146, 405-413 (1999).</li><li>Leite, M. F., Burgstahler, A. D., Nathanson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++waves+require+sequential+activation+of+inositol+trisphosphate+receptors+and+ryanodine+receptors+in+pancreatic+acini.">Ca2+ waves require sequential activation of inositol trisphosphate receptors and ryanodine receptors in pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 122, 415-427 (2002).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46, 143-151 (2008).</li><li>Schild, D., Jung, A., Schultens, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+calcium+entry+through+calcium+channels+in+olfactory+receptor+neurones+using+a+laser+scanning+microscope+and+the+calcium+indicator+dyes+Fluo-3+and+Fura-Red.">Localization of calcium entry through calcium channels in olfactory receptor neurones using a laser scanning microscope and the calcium indicator dyes Fluo-3 and Fura-Red.</a> Cell Calcium. 15, 341-348 (1994).</li><li>Saluja, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretagogue-induced+digestive+enzyme+activation+and+cell+injury+in+rat+pancreatic+acini.">Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 276, 835-842 (1999).</li><li>Husain, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptors+contribute+to+bile+acid-induced+pathological+calcium+signaling+and+pancreatitis+in+mice.">Ryanodine receptors contribute to bile acid-induced pathological calcium signaling and pancreatitis in mice.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. , (2012).</li><li>Gurda, G. T., Guo, L., Lee, S. H., Molkentin, J. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+activates+pancreatic+calcineurin-NFAT+signaling+in+vitro+and+in+vivo.">Cholecystokinin activates pancreatic calcineurin-NFAT signaling in vitro and in vivo.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 198-206 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode d&#39;isolement cellulaire et des essais ultérieurs décrits ici sont des outils puissants pour étudier les caractéristiques physiologiques et physiopathologiques du pancréas exocrine. La méthode pour isoler des cellules acineuses dispersées a été décrite par Amsterdam et Jamieson en 1972 11. Les méthodes présentées ici ont été adaptés à partir de méthodes d&#39;isolement plus récents décrits par Van Acker et ses collègues 12. Bien que ces techniques sont hautement r...

Changements dynamiques de calcium cytosolique sont nécessaires pour les événements de cellules acineuses la fois physiologiques et pathologiques. Ces effets divergents de calcium sont censés résulter de configurations spatiales et temporelles distinctes de la signalisation calcique 1. Par exemple, une enzyme et la sécrétion d&#39;un fluide à partir de la cellule des cellules acineuses sont liés à des pics de calcium à partir d&#39;une région limitée du pôle apical où la sécrétion a lieu 2. En revanche, une vague de calcium global, suivi par des signaux calciques non oscillatoires intense est associé à des événements pathologiques précoces qui conduisent à une pancréatite aiguë 3,4. Il s&#39;agit notamment de l&#39;activation intra-acinaire protéase, la sécrétion de l&#39;enzyme réduite, et la lésion des cellules acineuses. Notre laboratoire utilise isolé acini pancréatiques pour étudier ces événements pathologiques précoces qui conduisent à la maladie à la fois in vivo et in vitro 5-7. Les méthodes décrites ci-dessous décrivent l&#39;isolement des cellules acineuses primaires dans le but de mesurer cyles niveaux de calcium tosolic et lésions cellulaires. Une méthode d&#39;infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mice</td>
 <td>NCI</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Male 20-30 grams; virtually any strain should yield comparable results.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>American Bioanalytical</td>
 <td>AB00892</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3624-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>3040-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium Chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M-8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium Chloride</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C79</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextrose</td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>1916-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G-8540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1X minimum Eagle's medium non-essential amino acid mixture</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>11140-050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>EM</td>
 <td>SX0593</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A7906</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Soybean Trypsin Inhibitor</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>T-9003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Carbon Dioxide</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td> 124-38-9 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>125 ml Erlenmeyer plastic flask</td>
 <td>Crystalgen </td>
 <td>26-0005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection kit</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14161-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70% Ethanol</td>
 <td>LabChem</td>
 <td>LC222102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>P1000, P100, P10 pipettes</td>
 <td>Gilson</td>
 <td>FA10005P</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Weighing boat</td>
 <td>Heathrow Scientific</td>
 <td>HS1420A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>USA Scientific</td>
 <td>1020-2500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352095</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml conical tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>05-408-129</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.65 ml micro-centrifuge tube</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20170-293</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>22 x 22 mm glass coverslips</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>032811-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A483-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A142-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized water</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 x 18 mm coverslips</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>021510-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laboratory film</td>
 <td>Parafilm</td>
 <td>PM-996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F14201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylsulfoxide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luer lock</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>932777</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 ml syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>DG567805</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 &frac34; gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>9328270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE50 tubing</td>
 <td>Clay Adam</td>
 <td>PE50-427411</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flat head screwdriver </td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM F-12, no Phenol Red</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21041-025 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30.5 gauge needle</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 CC syringe</td>
 <td>BD Bioscience</td>
 <td>309603</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml Erlenmeyer flask</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FB50025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh filter </td>
 <td>Nitex</td>
 <td>03-150/38</td>
 <td>150 &mu;m pore size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3548</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well tissue culture plate </td>
 <td>Costar</td>
 <td>3795</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6 well tissue culture plate</td>
 <td>Costar</td>
 <td>3506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen</td>
 <td>Matheson Gas</td>
 <td>7727-37-9</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytotoxicity assay kit</td>
 <td>Promega</td>
 <td>G1782</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adeno-GFP</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Gift from J. Williams</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring stand with clamps</td>
 <td>United Scientific</td>
 <td>SET462</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perifusion chamber</td>
 <td>N/A</td>
 <td>N/A</td>
 <td>Designed by S.Z.H and colleagues at Yale University</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum line</td>
 <td>Manostat</td>
 <td>72-100-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water bath with shaker</td>
 <td>Precision Scientific</td>
 <td>51220076</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>LSM 710</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BioTek Synergy H1 plate reader</td>
 <td>BioTek</td>
 <td>11-120-534</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>Nuaire</td>
 <td>NU-425-600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture Incubator</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>3110</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of pancreatic acinar cells for the purpose of calcium imaging, cell injury measurements, and adenoviral infection

Les cellules acineuses du pancréas est la principale cellule parenchymateuse du pancréas exocrine et joue un rôle primordial dans la sécrétion d&#39;enzymes pancréatiques dans le canal pancréatique. Il est également le site pour l&#39;initiation d&#39;une pancréatite. Nous décrivons ici comment les cellules acineuses sont isolés de signaux intracellulaires de calcium tout le tissu du pancréas et sont mesurées. En outre, nous décrivons les techniques de transfection de ces cellules avec des constructions adénoviraux, et mesurer ensuite la fuite de lactate déshydrogénase, un marqueur de lésion des cellules, dans des conditions qui induisent des lésions des cellules acineuses in vitro. Ces techniques constituent un outil puissant pour caractériser la physiologie des cellules acineuses et la pathologie.

Un exemple de mesures de calcium des cellules acineuses en réponse à des stimuli physiologiques est fourni à la figure 3. cellules acineuses ont été chargés avec le calcium colorant Fluo-4 et perfusé avec l&#39;acétylcholine, un analogue carbachol (CCH; 1 M)) 8. Les cellules ont réagi, sous la forme d&#39;une onde de calcium qui déclenche dans la région apicale et se propage dans la région basolatérale 3,9. tracés représentatifs illustré à la figure 3B</str...

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Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Nous décrivons une méthode reproductible de préparation de cellules acineuses pancréatiques de souris à partir d&#39;une souris dans le but d&#39;examiner les signaux calciques des cellules acineuses et des lésions cellulaires avec physiologiquement et pathologiquement stimuli pertinents. Une méthode d&#39;infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.

Préparation des cellules acineuses pancréatiques à des fins d&#39;imagerie calcique, mesures de blessures cellulaires, et les infections à adénovirus

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.2K vues.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. Nous décrivons une méthode reproductible de préparation de cellules acineuses pancréatiques de souris à partir d'une souris dans le but d'examiner les signaux calciques des cellules acineuses et des lésions cellulaires avec physiologiquement et pathologiquement stimuli pertinents. Une méthode d'infection par adénovirus de ces cellules est également fournie.

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Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolement et culture de cellules primaires de souris acineuses du pancréas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Recherche

Biologie

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Imagerie de cellules vivantes primaires de rats néonatals cardiomyocytes Suite à adénovirus et Lentivirales transduction confocale à disque rotatif Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

Évaluation de la capacité sécrétoire des cellules pancréatiques acineuses

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Mesures de Sphincter urétral cystométriques et externe chez le rat éveillé avec cathéter implanté et électrodes permettant des mesures répétées

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...