We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Cura&#231;ao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.

NOTE: Réactifs pour être préparés pour Serial Block Face imagerie des échantillons de corail 1. Preinfiltration Cire <ol><li> Faire fondre 3,6 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre. Mélangez bien sur une plaque chaude (60-70 ° C). </li><li> Ajouter 400 mg de Soudan IV (pour minimiser la cire fond fluorescence). Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint. </li><li> Ajouter 96 ml de la paraffine fondue chaude (100%) et bien mélanger. </li></ol> 1.2) Embedding Cire <ol><li> Faire fondre 7,2 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre et bien mélanger sur une plaque chaude (60-70 ° C). </li><li> Ajouter 0,8 g du Soudan IV. Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint. </li><li> Ajouter granulés de paraffine (162 g) et mélanger jusqu&#39;à ce que la paraffine fond complètement. </li><li> Ajouter 30 g de blanc granulaire Vybar et fondre complètement dans le même bécher; Une fois fondu, mélanger. </li><li> Fermer sans serrer la bouteille en verre avec un couvercle. Placer le flacon en verre à 60 ° C une convection ovfr pour garder les ingrédients dans un état liquide. Effectuer toutes les infiltrations dans ce four. </li><li> Diviser le volume total de 200 ml de la cire rouge dans deux flacons en verre de 100 ml chacune. Utilisez une aliquote pour l&#39;infiltration et l&#39;autre pour l&#39;incorporation finale. </li></ol> 1.3) incorporation Coral tissus pour Serial Block Face Imaging <ol><li> Laver les polypes coralliens recueillies sur le terrain (SI vidéo 1) et stockées (3-6 mois à 4-5 ° C dans du paraformaldéhyde) dans un tampon phosphate salin (3x 5 min) et détartrer lorsque vous êtes prêt à imager. Détartrer les polypes en solution Excal pendant 24 heures ou jusqu&#39;à ce que les polypes sont totalement dépourvus de CaCO3. Incuber plusieurs polypes coralliens décalcifié comme un seul bloc dans une série 25, 50, 75, et 100% d&#39;éthanol, suivie d&#39;un substitut de xylène 1x à déshydrater les échantillons. </li><li> Placez les polypes transformés dans un four préchauffé à 65 ° C four contenant 100% de substitut de xylène. Incuber pendant 30 min à deux reprises par Changing de solution fraîche. Orienter les polypes de telle manière que la partie supérieure des polypes orientée vers le bas et la surface supérieure est aussi plat que possible. </li><li> Faire des solutions de 2: 1, 1: 1, et 1: 2 substitut de xylène et preinfiltration cire (étape 1.1) dans 50 ml tubes Falcon. </li><li> Incuber polypes de corail avec ces trois concentrations croissantes de cire de preinfiltration, suivis par 3x incubation dans 100% de cire de preinfiltration pendant 30-60 minutes à chaque fois. </li><li> Remarque: Selon l&#39;épaisseur des échantillons, étapes 1.3.1-1.3.5 pourrait être augmenté avec de plus longues périodes. </li><li> Déplacez les échantillons à l&#39;intégration de la cire (voir l&#39;étape 1.2.6) après incubation en 3x 100% cire de preinfiltration. </li><li> Retirer la cire intégration après 30 min. Remplacer avec de la cire d&#39;enrobage frais et continuer incubation pour un minimum de 4 heures à 65 ° C. </li></ol> 1.4) L&#39;intégration dans Red Wax <ol><li> Photographier le bloc (la plaque en acier inoxydable où la cire blanche et est placé au-dessus de laquelle le sample est placé). Ceci est nécessaire parce que, une fois incorporé dans la cire, l&#39;emplacement de l&#39;échantillon devient invisible comme l&#39;enrobage de cire rouge est opaque. </li><li> Placez de petites gouttes de haut point de fusion de la cire autour de la nouvelle intégration moule en acier inoxydable préchauffé et laissez-le refroidir. Verser une petite quantité de cire fondue à partir de l&#39;incorporation fraîchement second récipient comme indiqué à l&#39;étape 1.2.6. </li><li> Placez le polype vers le bas rapidement sur la cire point blanc, puis placez un porte-échantillon en plastique sur la plaque en acier inoxydable et verser de la cire plus plongement de sorte que la cire remonte à la surface du moule en plastique. </li><li> Prenez toute la configuration de 65 ° C du four et laisser refroidir sur un banc ou une surface froide jusqu&#39;à ce que la cire durcit complètement. </li><li> Cela peut prendre 6 heures jusqu&#39;au jour ou deux. Placez le bloc desséché dans un réfrigérateur à 4 ° C, à l&#39;abri de la lumière, pour le stockage à long terme. </li></ol> 1.5) de sectionnement à la configuration Block Face série <ol><li> Trim le bloc et couper 1 um sections à l&#39;aide d&#39;un microtome. Ne pas recueillir les sections car elles deviendront comme de la poudre. Rappelez-vous, nous sommes imagerie que la face du bloc. L&#39;échantillon apparaît lorsque la cire blanche commence à disparaître. </li><li> Capturer des images de la face lisse du bloc qui contient l&#39;échantillon chaque fois qu&#39;un article est retiré. Continuez jusqu&#39;à ce que le polype disparaît en SI Vidéo 2. </li><li> Record / capture les images avec une caméra monochrome en utilisant un filtre fluorescent FITC pour ramasser l&#39;auto-fluorescence de la chromatophores / corail polype. Image 3-4 noyaux décalcification de chaque espèce. </li></ol> 2. imagerie coraux de moins de deux photons microscopie de fluorescence <ol><li> Fixer des noyaux de polypes coralliens, contenant chacune environ 10-12 polypes environ un pouce de diamètre, à 4% de paraformaldéhyde sur le site de collecte (rivage) dès qu&#39;ils sont récoltés sous l&#39;eau. </li><li> Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;imagerie. Noyaux lavés sont placés dans ee même solution à l&#39;envers dans un plat à fond de verre de couverture (0,17 mm d&#39;épaisseur). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un laser à deux photons à 780 nm excitation, l&#39;image 3-4 polypes à deux agrandissements différents (zoom numérique) en utilisant un (NA 0,3) objectif 10X. La forme de polype et la hauteur varie entre les échantillons (généralement 1-2 mm) et la profondeur d&#39;imagerie est également limité par la distance de travail de l&#39;objectif d&#39;imagerie. </li><li> Utilisez le mode de balayage de tuile de recueillir environ 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 carreaux) images par plan focal en xy et 50-100 des images par le biais de l&#39;axe z à intervalle de 10 ou 20 um, totalisant environ 5.000-10.000 images / polype. </li><li> Image en trois quatre zones de polypes pour représenter un noyau et des espèces coralliennes. NOTE: Image temps d&#39;acquisition varie entre 2-5 h / zone de polype. </li><li> Stocker toutes les images de format de données brutes dans le disque dur du système LSM 5 Rendu 3D d&#39;une analyse d&#39;images 3D et de rendu logiciel. </li></ol> 3. rendu 3D du volume et Visualization de SBFI et à deux photons de fluorescence spectrale des données <ol><li> Recadrer les données 2D afin de réduire la taille du fichier en se concentrant sur un seul polype en utilisant l&#39;outil de recadrage carré dans le programme et le compiler comme un seul fichier TIFF (réduire la taille du fichier aussi en enregistrant le fichier au format 8 bits) dans le logiciel d&#39;acquisition. </li><li> Ouvrez les fichiers assemblés des données de SBFI (collectés à l&#39;étape 1.5.1) ou les multiples z piles de tuiles de sections optiques de deux photons (collectés à l&#39;étape 2.1.4) dans le programme Imaris Surpass module sous algorithme de volume. </li><li> Projeter les données de SBFI rendus en 3D en utilisant une projection de l&#39;ombre. Créer un mode isosurface où les voxels sont seuillés pour créer un motif de surface solide (SI Vidéo 3). </li><li> Visualisez les projections en 3D en utilisant un algorithme coupure de plan à xy, xz et yz modes orthogonaux pour révéler la structure 3D et la forme des coraux. </li><li> Animer les projections utilisant un module clé d&#39;animation de trame dans le même programme de Imaris (SI Videos 3-7). </li><li> Générer des fichiers vidéo à 5% de compression et de générer un clips en format avi en utilisant un volume (SI Vidéos 4 et 6), 3D et Isosurface modalités (SI Vidéos 5 et 7). </li></ol>

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The authors declare no conflict of interests.

Recherche sur les récifs de corail est un effort de recherche hautement interdisciplinaire, comprenant l&#39;analyse de la simultanée physiques, chimiques, et des phénomènes biologiques qui opèrent dans le milieu marin. L&#39;étude des écosystèmes de récifs coralliens complexes est donc préférable terminé dans un &quot;Powers of Ten&quot; cadre contextuel (Figure 10). Cette compilation graphique montre que l&#39;écosystème corallien couvre un large éventail de dimensions spatiales (10 <su...

Le réchauffement climatique et les changements environnementaux accompagnement affectent directement la santé et la distribution des coraux marins tropicaux 1-4. Impacts multiples sont observés, y compris le blanchiment des coraux et l&#39;émergence de maladies infectieuses 5-6. Toutefois, une prévision plus précise de la future réponse de corail à ces menaces environnementales, il faudra qu&#39;une &quot;ligne de base&quot; histologique être établi, qui définit la morphologie des tissus et de la composition de la cellule et de la distribution pour les coraux &quot;apparemment en bonne santé&quot;. À son tour, &quot;touchés&quot; coraux peuvent alors être comparés quantitativement. En outre, cette référence devrait être établi pour les coraux apparemment en bonne santé dans une variété de conditions environnementales, de sorte que «réaction saine» peut également être évaluée à travers des gradients environnementaux. Comme un premier pas vers l&#39;établissement de cette base, une étude 3D à haute résolution a été réalisée de façon apparemment tissu polype corallienmorphologie et la composition cellulaire répond à l&#39;augmentation de la profondeur de l&#39;eau (WD) et des baisses d&#39;accompagnement dans la lumière du soleil irradiance. Les résultats peuvent ensuite être utilisées pour établir une compréhension mécaniste plus complet de corail adaptation, ainsi que de mieux comprendre l&#39;évolution de corail symbiote et l&#39;amélioration de la récolte de la lumière. Coraux durs (Scleractinia) sont coloniales animaux marins invertébrés qui accueillent un assemblage complexe d&#39;autres microorganismes, appelés collectivement le corail holobiont 7-10. Les recherches menées dans la présente étude cherche à utiliser une suite de technologies d&#39;imagerie de pointe pour suivre simultanément des changements avec l&#39;augmentation de la profondeur de l&#39;eau dans les pigments de tissus et de zooxanthelles symbiotiques des coraux d&#39;accueil apparemment en bonne santé. Ceci permettra d&#39;établir le tissu cellulaire comparative &quot;de base&quot; nécessaire dans un gradient bathymétrique des coraux apparemment en bonne santé et agissent comme des indicateurs de corail heaLTH 10. pigments coralliens, appelées chromatophores, agissent pour absorber, de réfléchir, la diffusion, la réfraction, la diffraction, ou interférer avec le rayonnement solaire incident 11. La relation endosymbiotique zooxanthelles-chromatophores a permis la coévolution de l&#39;optimisation lumière de récolte stratégique avantageuse et des stratégies de croissance du squelette, ainsi que la plasticité trophique (stratégies d&#39;alimentation déplacement de va-et-vient de autotrophie à Hétérotrophie) pour l&#39;animal corail 12. Les Caraïbes île nation sud de Curaçao (anciennement partie des Antilles néerlandaises) se trouve à environ 65 km au nord du Venezuela au sein de l&#39;orientation est-ouest Aruba-La Blanquilla archipel (figure 1A). Le 70 km côte sud de Curaçao contient un ancien récif corallien frangeant partie continue moderne et Miocène-Pliocène-Pléistocène-Holocène 13,14. SST moyenne annuelle sur Curaçao varie d&#39;environ 3 ° C unenuellement, allant d&#39;un minimum de 26 ° C à la fin de Janvier jusqu&#39;à un maximum de 29 ° C au début de Septembre, avec une température annuelle moyenne de 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST ensembles de données, 2000-2010). Le récif de corail à Playa Kalki (12 ° 22&#39;31.63 &quot;N, 69 ° 09&#39;29.62&quot; W), située près de la pointe nord-ouest de Curaçao (figure 1A), a été choisi pour l&#39;échantillonnage, car il a déjà été bien étudiée et la écosystème marin à cet endroit est baigné dans l&#39;eau de mer non polluée frais 7,15-19. . Deux espèces de coraux scléractiniens étroitement liées, M. annularis et M faveolata, ont été choisis pour l&#39;expérimentation et l&#39;analyse dans cette étude parce que chaque espèce: (1) des expositions très différentes et ne se chevauchent pas distributions bathymétriques sur les voies de récif par rapport à la limite du plateau continental et la milieux sédimentaires carbonate sédimentaires associés (M. gamme annularis = 0-10 m WD, M. faveolatagamme = 10-20 m WD 20; figures 1B, 2A, et 2B); (2) est un corail cadre commun de récif constructeur tout au long de la mer des Caraïbes 21; et (3) est bien étudiée écologique, physiologique, et les relations d&#39;évolution 22. échantillonnage sur le terrain pour la présente étude a été réalisée en utilisant des techniques de plongée sous-marine au large de standards Playa Kalki à Curaçao. Un bathymétrique de l&#39;eau peu profonde transect à profonde a été établi que traversait le plateau, sur le rebord du plateau, et dans les environnements récifaux antérieures en eau profonde. Apparemment, têtes de corail en bonne santé ont ensuite été identifiés pour l&#39;échantillonnage le long de ce transect bathymétrique, y compris: (1) trois individuel ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. annularis, qui étaient tous à 5 m de profondeur d&#39;eau (WD); et (2) trois individuels ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. faveolata, qui étaient tous à 12 m WD. Rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) a été mesurée comme 33-36% PAR à 5 m WD et 18-22% PAR à 10 m WD. L&#39;échantillonnage a été effectué en Janvier lorsque la SST était de 26 ° C à des profondeurs d&#39;eau de la 5 m et 12 m. Chacun de ces six têtes de corail a été échantillonné en triple exemplaire à des positions spatiales équivalentes (c&#39;est à dire., Environ 45 ° de latitude nord sur chacune des six têtes de corail hémisphériques). Chaque échantillon se composait d&#39;un diamètre de 2,5 cm corail biopsie de tissu-squelette qui a été recueilli avec un coup de poing de la voûte nettoyé. Trois biopsies de tissus-squelette de corail ont été échantillonnés sur la plongée sous-type avec des mains gantées de chacune des têtes de corail (9 de M. annularis colonies à 5 m WD et 9 de M. faveolata à 12 m WD). Immédiatement après la collecte de profondeur, chacune des carottes de biopsie a été placé dans un tube de polypropylene de 50 ml à centrifuger stérile, étanche vis-haut, et est retourné à la surface. L&#39;eau de mer a été décantée à partir de chaque tube de centrifugeuse et chaque biopsie au trocart est ensuite immergé, stocké et transporté dans 4% de paraformaldéhyde. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; imagerie SBFI a déjà été réalisée sur un large éventail d&#39;échantillons biologiques, y compris l&#39;ensemble du cerveau et tout-cardiaques tissus humains, des embryons de souris intactes, des embryons de poisson zèbre, et plusieurs types d&#39;échantillons d&#39;animaux avec des os intacts 23-30. La plupart de ces études utilisées microscopie optique / lumière soit avec fluorescence ou technique sur le terrain vives. Cependant, des études ont été menées à ultra-forts grossissements utilisant électronique à balayage bloc série visage imagerie dans le passé 31. Dans la présente étude, un protocole de SBFI modifié a été mis au point pour les coraux et appliqué pour la première fois. Parce que M. annularis et M. polypes coralliens faveolata sont 1-2 mm d&#39;épaisseur, aucune des techniques de microscopie optique de routine serait capable de pénétrer toute l&#39;épaisseur du tissu corail de polypes. Par conséquent, nous avons SBFI protocole de préparation des échantillons spécialement conçu pour les échantillons de corail. En outre, nous avons conçu sur mesure un porte-stéréoscopique, Qui est motorisé pour se déplacer dans les deux directions x et y. Cet appareil prend des images de la face du bloc de l&#39;échantillon plutôt que de recueillir les sections à l&#39;aide d&#39;un microtome régulier devant le microscope. Nous avons également introduit une autre à deux photons technique de microscopie optique non linéaire à l&#39;image les mêmes polypes coralliens dans toute l&#39;épaisseur des tissus coralliens. Cette surmonte les limitations imposées par SBFI en termes de décalcification et la possibilité de changements dans la morphologie des tissus et le volume (rétrécissement) pouvant être induites par la préparation des échantillons (déshydratation) et les protocoles de traitement. En outre, les profils d&#39;émission des coraux ont été résolues spectralement à identifier leurs émissions de pointe et les variations entre les chromatophores et les zooxanthelles photosynthétique. Ces résultats ont été évalués dans le contexte de la méthode utilisée et leurs avantages particuliers en ce qui concerne le temps d&#39;acquisition, le temps d&#39;analyse, et la capacité de résoudre des détails fins structurelles sans compromettre la strintégrité uctural du tissu corail.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Coral Tissue Skeleton</td>
			<td>None</td>
			<td>None</td>
			<td>2.5 cm Biopsy from natural habitat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arch Punch Coring Device</td>
			<td>C.S. Osborne and Company</td>
			<td>No. 149</td>
			<td>For Coral biopsy collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15700</td>
			<td>16% Pre-diluted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoclear/Safeclear II</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 64111-04</td>
			<td>Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene and Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Richard Allen Scientific</td>
			<td>Type H REF 8338</td>
			<td>Infiltration solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybar</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stearin</td>
			<td>The Candle Maker</td>
			<td>None</td>
			<td>Component of Red Wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S667-25</td>
			<td>Red Wax-Opaque background</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>W32466</td>
			<td>For labeling&#160; Coral Mucus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36095</td>
			<td>Anti-fade mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro Dish</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD-35-100</td>
			<td>For two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Motor, Driver and Controller</td>
			<td>Lin Engineering</td>
			<td>211-13-01R0, R325, R256-RO</td>
			<td>XY Translational Movement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>DC-220</td>
			<td>Melting all wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection Oven</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>DX-600</td>
			<td>Infiltration and Embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ASP 300</td>
			<td>Dehydration, Infiltration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2055</td>
			<td>Disposable knifes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stereolumar V 12</td>
			<td>1.5x (30 mm WD) Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope with ApoTome</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Axiovert M 200, ApoTome I System</td>
			<td>Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiocam camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>MRm</td>
			<td>Monochrome camera 1388x1040 pixels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Version 4.8</td>
			<td>Image acquisition program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-Photon Laser</td>
			<td>Spectraphysics</td>
			<td>Maitai eHP, pulsed laser (70 fs)</td>
			<td>With DeepSee module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 710 with Spectral Detector</td>
			<td>34 channel PMT detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>2010 or above</td>
			<td>for two-photon and spectral image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Suite Software</td>
			<td>Bitplane, Inc.,</td>
			<td>Version 7.0 or above</td>
			<td>3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal optical microscopy methods reveal polyp tissue morphology and structure in caribbean reef building corals

Une suite intégrée de techniques d&#39;imagerie a été appliquée pour déterminer le (3D) morphologie tridimensionnelle et la structure cellulaire des tissus des polypes comprenant l&#39;coraux constructeurs de récifs des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Ces approches comprennent la microscopie à fluorescence (FM), le bloc de série visage imagerie (SBFI), et à deux photons laser microscopie confocale à balayage (TPLSM). SBFI fournit des images des tissus profonds après sectionnement physique; Il détaille la texture de surface de tissu et visualisation 3D pour des profondeurs du tissu de plus de 2 mm. FM complémentaire et de rendement de TPLSM images de très haute résolution de la structure cellulaire des tissus. Les résultats ont: (1) identifier les morphologies de tissus lobés non signalés précédemment sur ​​la paroi extérieure de polypes coralliens individuels et (2) a créé les premières cartes de la surface de la densité de la distribution et du tissu 3D de chromatophores et endosymbiontes dinoflagellés zooxanthelles algues comme. Pois d&#39;absorption spectraleks de 500 nm et 675 nm, respectivement, indiquent que M. annularis et M. faveolata contient types de chlorophylle et de chromatophores similaires. Toutefois, M. annularis et M. faveolata présentent des différences significatives dans la densité et la distribution de tissu 3D de ces composants cellulaires essentiels. Cette étude portant sur les méthodes d&#39;imagerie indique que SBFI est extrêmement utile pour l&#39;analyse de grands échantillons mm échelle de tissus coralliens décalcifier. FM gratuit et TPLSM révèlent de subtiles changements d&#39;échelle submillimétrique de la distribution et de la densité cellulaire dans des échantillons de tissus de corail nondecalcified. La technique permet de TPLSM: (1) préparation de l&#39;échantillon à effraction minimale, (2) de capacité supérieure sectionnement optique, et (3) l&#39;absorption de la lumière et de diffusion minimale, tout en permettant l&#39;imagerie des tissus profonds.

Un appareil de SBFI conçu sur mesure (fabriqués spécifiquement pour la présente étude; Figure 3) a produit les premières cartes détaillées 3D numériques d&#39;élévation (MNE) de la texture de la surface extérieure et la morphologie de la M. annularis et M. polypes coralliens faveolature (figure 4 et SI Vidéos 1-2). Cela a donné des images de lobes empilés jusqu&#39;alors inconnus de tissus de corail concentrique rayonner à l&#3...

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Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

Une suite intégrée de techniques d&#39;imagerie a été appliquée pour déterminer polype morphologie et la structure des tissus dans le coraux des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Fluorescence, le visage de bloc série, et à deux photons laser microscopie confocale à balayage ont identifié la structure lobée, murs de polype, et chromatophores estimée et la densité de zooxanthelles et des distributions.

Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

multimodal-optical-microscopy-methods-reveal-polyp-tissue-morphology

Research

JoVE Journal

Environment

12.2K vues.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer polype morphologie et la structure des tissus dans le coraux des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Fluorescence, le visage de bloc série, et à deux photons laser microscopie confocale à balayage ont identifié la structure lobée, murs de polype, et chromatophores estimée et la densité de zooxanthelles et des distributions. 

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Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of natural proteins have a molecular mass between 40 - 200 kDa1,2, a robust and high-throughput method with a nanometer resolution capability is needed. Negative staining (NS) electron microscopy (EM) is an easy, rapid, and qualitative approach which has frequently been used in research laboratories to examine protein structure and protein-protein interactions. Unfortunately, conventional NS protocols often generate structural artifacts on proteins, especially with lipoproteins that usually form presenting rouleaux artifacts. By using images of lipoproteins from cryo-electron microscopy (cryo-EM) as a standard, the key parameters in NS specimen preparation conditions were recently screened and reported as the optimized NS protocol (OpNS), a modified conventional NS protocol 3 . Artifacts like rouleaux can be greatly limited by OpNS, additionally providing high contrast along with reasonably high&#8208;resolution (near 1 nm) images of small and asymmetric proteins. These high-resolution and high contrast images are even favorable for an individual protein (a single object, no average) 3D reconstruction, such as a 160 kDa antibody, through the method of electron tomography4,5. Moreover, OpNS can be a high&#8208;throughput tool to examine hundreds of samples of small proteins. For example, the previously published mechanism of 53 kDa cholesteryl ester transfer protein (CETP) involved the screening and imaging of hundreds of samples 6. Considering cryo-EM rarely successfully images proteins less than 200 kDa has yet to publish any study involving screening over one hundred sample conditions, it is fair to call OpNS a high-throughput method for studying small proteins. Hopefully the OpNS protocol presented here can be a useful tool to push the boundaries of EM and accelerate EM studies into small protein structure, dynamics and mechanisms.

More than half of proteins are small proteins (molecular mass &#60;200 kDa) that are challenging for both electron microscope imaging and three-dimensional reconstructions. Optimized negative staining is a robust and high-throughput protocol to obtain high contrast and relatively high resolution (~1 nm) images of small asymmetric proteins or complexes under different physiological conditions.

Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Recherche

Environnement

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Méthodes de rééchantillonnage du sol pour surveiller les changements dans les concentrations chimiques des sols forestiers

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Building Double-decker Traps for Early Detection of Emerald Ash Borer

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions of forest and landscape ash (Fraxinus spp.) trees. Several artificial trap designs to attract and capture EAB beetles have been developed to detect, delineate, and monitor infestations. Double-decker (DD) traps consist of two corrugated plastic prisms, one green and one purple, attached to a 3 m tall polyvinyl chloride (PVC) pipe supported by a t-post. The green prism at the top of the PVC pipe is baited with cis-3-hexenol, a compound produced by ash foliage. Surfaces of both prisms are coated with sticky insect glue to capture adult EAB beetles. Double-decker traps should be placed near ash trees but in open areas, exposed to sun. Double-decker trap construction and placement are presented here, along with a summary of field experiments demonstrating the efficacy of DD traps in capturing EAB beetles. In a recent study in sites with relatively low EAB densities, double-decker traps captured significantly more EAB than green or purple prism traps or green funnel traps, all of which are designed to be suspended from a branch in the canopy of ash trees. A greater percentage of double decker traps were positive, i.e., captured at least one EAB, than the prism traps or funnel traps that were hung in ash tree canopies.

Effective traps to attract and capture the emerald ash borer (EAB) are a key element of detecting and managing this invasive pest. Double-decker traps, placed in full sun near ash trees, incorporate visual and olfactory cues and were more likely to capture EAB than other trap designs in field trials.

Bâtiment à deux étages pièges pour la détection précoce de l’agrile du frêne

Emerald ash borer (EAB) (Agrilus planipennis Fairmaire), the most destructive forest insect to have invaded North America, has killed hundreds of millions ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindication de vérification des flux environnement qualités pour jeunes d’eau douce perles de moules à l’aide de méthodes In Situ de l’exposition

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm morphogenesis, that is the structural diversification of biofilms during community assembly, represents a remarkable challenge across spatial and temporal scales. Here, we present an automated biofilm imaging system based on optical coherence tomography (OCT). OCT is an emerging imaging technique in biofilm research. However, the amount of data that currently can be acquired and processed hampers the statistical inference of large scale patterns in biofilm morphology. The automated OCT imaging system allows covering large spatial and extended temporal scales of biofilm growth. It combines a commercially available OCT system with a robotic positioning platform and a suite of software solutions to control the positioning of the OCT scanning probe, as well as the acquisition and processing of 3D biofilm imaging datasets. This setup allows the in situ and non-invasive automated&#160;monitoring of biofilm development and may be further developed to couple OCT imaging with macrophotography and microsensor profiling.

Microbial biofilms form complex architectures at interphases and develop into highly scale-dependent spatial patterns. Here, we introduce an experimental system (hard- and software) for the automated acquisition of 3D optical coherence tomography (OCT) datasets. This toolset allows the non-invasive and multi-scale characterization of biofilm morphogenesis in space and time.

Tomographie automatisée de cohérence optique 3D pour élucider la morphogénèse du biofilm sur de grandes échelles spatiales

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Split Point Analysis and Uncertainty Quantification of Thermal-Optical Organic/Elemental Carbon Measurements

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon (EC). This is commonly accomplished using thermal-optical OC/EC analyzers (TOAs), which enable measurement via controlled thermal pyrolysis and oxidation under specific temperature protocols and within constrained atmospheres. Several commercial TOAs exist, including a semi-continuous instrument that enables on-line analyses in the field. This instrument employs an in-test calibration procedure that requires relatively frequent calibration. This article details a calibration protocol for this semi-continuous TOA and presents an open-source software tool for data analysis and rigorous Monte Carlo quantification of uncertainties. Notably, the software tool includes novel means to correct for instrument drift and identify and quantify the uncertainty in the OC/EC split point. This is a significant improvement on the uncertainty estimation in the manufacturer&#8217;s software, which ignores split point uncertainty and otherwise uses fixed equations for relative and absolute errors (generally leading to under-estimated uncertainties and often yielding non-physical results as demonstrated in several example data sets). The demonstrated calibration protocol and new software tool enabling accurate quantification of combined uncertainties from calibration, repeatability, and OC/EC split point are shared with the intent of assisting other researchers in achieving better measurements of OC, EC, and total carbon mass in aerosol samples.

This article presents a protocol and software tool for the quantification of uncertainties in the calibration and data analysis of a semi-continuous thermal-optical organic/elemental carbon analyzer.

Analyse des points fractionnés et quantification de l'incertitude des mesures du carbone organique/élémentaire thermique-optique

Researchers from myriad fields frequently seek to quantify and classify concentrations of carbonaceous aerosols as organic carbon (OC) or elemental carbon ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimation de l'indice de la zone des feuilles à l'aide de trois méthodes distinctes dans les peuplements à feuilles caduques pures

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bactéries étiquetées fluorescentes comme traceur pour révéler de nouvelles voies de flux de carbone organique dans les écosystèmes aquatiques

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, or proteostasis. Caenorhabditis elegans occupies a unique and powerful niche for HSR research because the HSR can be assessed at the molecular, cellular, and organismal levels. Therefore, changes at the molecular level can be visualized at the cellular level and their impacts on physiology can be quantitated at the organismal level. While assays for measuring the HSR are straightforward, variations in the timing, temperature, and methodology described in the literature make it challenging to compare results across studies. Furthermore, these issues act as a barrier for anyone seeking to incorporate HSR analysis into their research. Here, a series of protocols is&#160;presented for measuring induction of the HSR in a robust and reproducible manner with RT-qPCR, fluorescent reporters, and an organismal thermorecovery assay. Additionally, we show that a widely used thermotolerance assay is not dependent on the well-established master regulator of the HSR, HSF-1, and therefore should not be used for HSR research. Finally, variations in these assays found in the literature are discussed and best practices are proposed to help standardize results across the field, ultimately facilitating neurodegenerative disease, aging, and HSR research.

Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans

Here, standardized protocols are presented to assess induction of the heat shock response (HSR) in Caenorhabditis elegans using RT-qPCR at the molecular level, fluorescent reporters at the cellular level, and thermorecovery at the organismal level.

Méthodes normalisées pour mesurer l’induction de la réponse de choc thermique à Caenorhabditis elegans

The heat shock response (HSR) is a cellular stress response induced by cytosolic protein misfolding that functions to restore protein folding homeostasis, ...