Ce protocole utilise un microscope multi-filtre pour l’imagerie en direct de toute la structure de la surface oculaire de la souris dans le modèle de souris transgénique fluorescente double. La combinaison d’une plate-forme microscopique multiphoton personnalisée et de souris transgéniques fluorescentes doubles permet la visualisation en temps réel de la surface oculaire et de sa structure. Pour configurer le microscope multiphoton, sélectionnez l’objectif immersion d’eau 20X, 1.00 NA et définissez le laser Sapphire de titane comme source d’excitation sur un microscope droit.
Réglez la longueur d’onde de sortie laser à 880 nanomètres pour EGFP et 940 nanomètres pour tdTomato. Inclure deux miroirs dichroïques pour la séparation de SHG EGFP et EGFP tdTomato et utiliser 434-17, 510-84 et 585-40 nanomètres bande filtres de passage pour séparer spectralement les signaux SHG EGFP et tdTomato. Pour installer le support oculaire, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale chez une souris anesthésiée de 8 à 12 semaines, placez la souris sur le stade du microscope chauffé et insérez une sonde de surveillance de la température.
Placez la souris dans un porte-souris stéréotaxique personnalisé et insérez des barres d’oreille dans le meatus auditif externe. Utilisez une fixation à trois points pour fixer le porte-tête et appliquez une solution hydrochlorique et saline oxybuprocaine de 0,4 % sur la surface oculaire. Couvrez les extrémités d’une paire de forceps Dumont numéro cinq avec la boucle du tube PE.
Après trois minutes effectuer une rétractation manuelle des paupières pour confirmer la saillie du globe oculaire et placer soigneusement une boucle de tube de support PE le long de la marge des paupières pour exposer la surface oculaire. Et utilisez le bouton du support pour stabiliser le globe oculaire avec les forceps. Ensuite, couvrez la surface cornéenne avec un gel pour les yeux avec un indice réfractif de 1,338.
Pour l’imagerie en série Z de la surface cornéenne, utilisez une source de lumière mercure pour imager le champ de ciblage et ouvrir le logiciel microscope. Sélectionnez le multiplicateur photo approprié et les gains numériques pour visualiser la structure cellulaire dans la surface oculaire et définissez la première et la dernière diapositive pour permettre l’acquisition d’une pile d’images. Réglez la résolution d’image à 512 par 512 pixels et l’étape Z à un micromètre.
Ensuite, cliquez sur commencer à recueillir des images en série Z acquérir une image en direct avec une excitation de 880 nanomètres pour la collecte de signaux SHG EGFP, et une image en direct à une excitation de 940 nanomètres pour egfp tdTomato collecte de signaux dans chaque zone. Tout au long de l’image, utilisez le support de scène motorisé stepper pour faire pivoter le globe oculaire pour permettre l’imagerie sur toute la surface cornéenne. Lorsque toutes les images ont été acquises, chargez les images en série Z aux Fidji et sélectionnez le plugin de filtre 3D médian.
Après avoir supprimé le bruit de fond, sélectionnez le paquet filtre masque flou Fidji pour aiguiser les images et cliquez sur le contraste de luminosité automatique pour optimiser automatiquement la qualité des images. Après traitement, enregistrez les images sous forme de séquence d’image sérielle et exportez la séquence d’image dans un logiciel de reconstruction 3D approprié. Dans toutes les images de microscopie multiphoton, présenter les signaux EGFP tdTomato et SHG en pseudo vert, rouge et cyan respectivement avant de capturer les images de la structure 3D par instantané.
La microscopie multiphoton permet la visualisation de cellules superficielles de l’aile et du basal dans l’épithélium cornéen des souris transgéniques fluorescentes doubles. Les cellules simples de la couche basale peuvent être cartographiées à la couche superficielle ainsi que les cellules superficielles hexagonales simples. Comme l’a révélé l’expression cytoplasmique du signal tdTomato, le système vésiculaire intracellulaire riche en protéines membranaires, y compris l’appareil golgi et le réticulum endoplasmique, est dispersé dans les cellules de l’aile.
Dans le stroma collagenous, les coratesites en forme de stellate sont décrites par la membrane ciblant les fluorescents EGFP chez ces souris. Les coratesites incorporées dans le stroma collegen sont plus lâchement espacées que dans les cellules endothéliales. En outre, les nerfs ram ramissants minces dans le stroma cornéen peuvent également être visualisés par membrane ciblant des signaux de tdTomato et des monolayers endothéliales cornéens de cellules démontrent une forme hexagonale relativement homogène reliée dans un modèle alvéolé.
L’épithélium limbal se compose d’une à deux couches de cellules épithéliales. La double souche transgénique fluorescente reporter permet également l’imagerie des capillaires dans la conjonctive, facilitant la reconstruction de l’architecture 3D des capillaires décrivant l’endothélium vasculaire. Stabiliser le globe oculaire avec une pression modérée sans blessure est essentiel pour acquérir des images de bonne qualité car une pression insuffisante ou excessive peut compromettre la qualité de l’image.
Cette plate-forme d’imagerie d’image NVivo peut être modifiée pour la visualisation des structures sous la surface oculaire et peut être appliquée à des études in situ de diverses maladies ophtalmiques.
