Ce travail a été rendu possible grâce au soutien financier de la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM), la bourse postdoctorale Milton Safenowitz recherche sur la SLA (ALS Association), NIH NS05462 subventions du NINDS et NS034382, et l&#39;ANR HyperMND.

1. Première étape Pré-anesthésique médicaments: 10-15 min avant l&#39;induction de l&#39;anesthésie, injecter atropine (0,20 mg / kg) et methylprenidsolone (0,05 mg) sous-cutanée pour éviter salivation, un œdème, respectivement. 2. Deuxième étape L&#39;induction de l&#39;anesthésie: injection de pentobarbital sodique (70 mg / kg) ou un mélange de kétamine / xylazine (100 mg / kg et 10 mg / kg, respectivement) intra-péritonéale. Laissez la souris jusqu&#39;à passer sous aucun réflexe pincement de l&#39;orteil peut être obtenue. Si l&#39;anesthésie semble trop claire, complète avec 1/4 de la dose. 3. Troisième étape * Remarque: cette chirurgie est une procédure terminale. Quand un plan chirurgical de l&#39;anesthésie a été atteint, le transfert de la souris sur une couverture posée au chaud dans une position couchée. <ol><li> Couvrir le nez de la souris avec un masque délivrant O 2 pur à un débit d&#39;environ 100 ml / min. </li><li&gt; Utilisation d&#39;une tondeuse à cheveux, raser la région dorsale, depuis la nuque du cou à la base de la queue. </li><li> Shave également la patte arrière droite. </li><li> Retournez la souris à la position couchée, mais prenez soin de laisser le masque à oxygène à la place. </li></ol> 4. Quatrième étape Assurer la souris en place par des sutures en boucle autour des branches et fixé aux quatre coins de la surface de travail. 5. Cinquième étape Insérer une sonde de température pour surveiller la température à coeur de la souris. Réglez couverture chauffante / puissance de la lampe pour maintenir la température centrale de 36 ° C et 38 ° C. 6. Trachéotomie et ventilation artificielle <ol><li> Avec des ciseaux émoussés, faire une coupe au-dessus de la trachée et tirez la peau loin des deux côtés. </li><li> Utilisant le forceps émoussé, déchirer la glande salivaire de manière à exposer deux muscles sterno minces () couvrant la trachée. </li><li> Utilisant le forceps émoussé, séparer le musc deuxles le long de leur séparation médiane pour révéler la trachée. </li><li> En utilisant un 7 Dumont pince, faites glisser deux longueurs de 4,0 suture de soie sous la trachée. </li><li> Faites une coupe transversale dans la trachée entre deux anneaux cartilagineux mais prenez garde à ne pas complètement la section de la trachée. </li><li> Insérer le tube trachéal dans la trachée, puis la fixer sur les deux côtés de l&#39;ouverture d&#39;insertion en reliant les points de suture sur elle. Le tube trachéal est relié à un ventilateur de souris (SAR-830/AP, Inc CWE) et un capnographe (μcapstar, CWE Inc). Le ventilateur est relié, par l&#39;intermédiaire d&#39;un sac de conformité, à une source d&#39;O 2 pur. Réglez les paramètres du ventilateur (100-150 bpm rythme respiratoire, le volume de fin d&#39;expiration 170-310 pi) de sorte que la souris ne se bat pas contre la ventilation artificielle et la pCO fin d&#39;expiration 2 est stable entre 4 et 5%. </li></ol> 7. Placement des lignes intraveineuses <ol><li> En utilisant des techniques de dissection émoussés, exposer la jugulaireveine d&#39;un côté de la nuque. A ce niveau, la veine jugulaire se divise en deux troncs principaux, les veines antérieures et postérieures du visage. </li><li> Effectuez les étapes suivantes deux fois, une fixés pour chacun de ces troncs: <ol><li> Utilisation Dumont 4 ou 5 pince, dégagez soigneusement la veine de son tissu conjonctif environnant. </li><li> En utilisant une pince Dumont 7, faites glisser deux longueurs de 6,0 points de suture de soie sous la veine. les séparer autant que possible le long de la longueur de la veine. </li><li> Placez un clip petit bâtiment sur le côté proximal de la veine (le côté le plus proche du cœur), et attacher le côté distal de la veine. </li><li> En utilisant des ciseaux très fins iris, faire une petite incision transversale dans la veine, en prenant grand soin de ne pas la section de la veine complètement. </li><li> Insérer un cathéter pré-remplie 1Fr (premicath, Vygon) dans l&#39;ouverture, jusqu&#39;à la pince navire. </li><li> Tenir la veine et le cathéter ensemble dans un 4 Dumont pince, retirer délicatement le clip navire, puis pousser le cathéter d&#39;un mor quelquese millimètres dans la veine. </li><li> Fixer le cathéter en l&#39;attachant avec deux fils de suture, des deux côtés de l&#39;insertion. </li></ol></li><li> L&#39;un des cathéters est reliée à une seringue ou une pompe à seringue pour injecter des doses supplémentaires d&#39;anesthésiques chaque fois que nécessaire (en général chaque min 10-30). La dose IV est soit 6 mg / kg de pentobarbital de sodium ou 1250 40 ug / kg / min de kétamine / xylazine 12. Le cathéter autre est reliée à une pompe à seringue pour une injection intraveineuse lente (50 ul / heure) d&#39;une solution de glucose à 4% contenant NaHCO 3 (1%) et plasmion (14%). </li></ol> 8. Fermez la peau du cou avec aiguille et la suture, et le retour de la souris pour position couchée 9. Dissection du muscle Hind-membres et les nerfs <ol><li> Avec des ciseaux, faire une incision du haut de la cuisse au tendon d&#39;Achille. Séparer la peau des muscles sous-jacents, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins. Cautériser au besoin. </li><li&gt; Identifier le bord antérieur du muscle biceps crural, qui apparaît comme une ligne blanche courir dans la cuisse. Avec des ciseaux, ouvrir avec précaution le long de la ligne à partir du genou tout le chemin jusqu&#39;à l&#39;os de la hanche. Séparez les muscles. Le nerf sciatique est maintenant visible sous le biceps crural. </li><li> Disséquer soigneusement les biceps crural. Cautériser / ligature au besoin pour prévenir les saignements. Le biceps fémoral peut être totalement retirée ou simplement incliné pour exposer le nerf sciatique et les triceps sural muscles. </li><li> Disséquer le nerf sural. </li><li> Utiliser du fil de soie 8/0, ficeler la partie distale du nerf fibulaire commun et couper distale du nœud. Disséquer le nerf tout le chemin jusqu&#39;à, au plus près de la hanche que possible. </li><li> Identifier le nerf tibial entre les nerfs péronier commun et Sural. Parmi les différentes branches du nerf tibial, identifier les branches qui innervent le muscle triceps sural des branches qui vont plus en profondeur (ci-après dénommé nerf tibial). </li><li> Utilisation 8/0 de la soiefil, relier toutes les branches du nerf tibial tout en gardant intactes les branches innervent le triceps sural. Couper le nerf tibial distal du au noeud et à disséquer le nerf aussi loin que possible. </li><li> Couvrir la totalité des membres postérieurs avec une gaze imbibée de sérum physiologique pour éviter le dessèchement tout en procédant à l&#39;étape suivante. </li></ol> 10. Laminectomie <ol><li> Avec des ciseaux, faire une incision le long de la colonne vertébrale. Séparer la peau des muscles sous-jacents. </li><li> Faire deux incisions de chaque côté de la vertèbre pour séparer les muscles sous-cutanés. Puis couper chaque tendon des muscles qui se fixent sur le côté de la vertèbre de chaque côté. </li><li> Utilisant le forceps émoussé et une curette fine, retirer le reste du muscle de la face dorsale des vertèbres autour des apophyses épineuses d&#39;identifier clairement chaque vertèbre individuelle. </li><li> Identifier les vertèbres T13 et L1. T13 est la dernière vertèbre à des nervures ci-joint. La colonne vertébrale wmal être immobilisé à l&#39;aide des pinces Cunningham moelle épinière vertébrales (Stoelting Co.). Placer les pinces vertébrales, de chaque côté de T13 et L1. Veillez à ne pas comprimer la moelle épinière, mais mettre un peu de tension dans l&#39;axe longitudinal. Vérifiez que la colonne vertébrale soit bien fixée en appuyant doucement avec une pince. </li><li> Utilisation rongeurs fines, retirer les apophyses épineuses des vertèbres, puis les lames sur T13 et L1, exposant ainsi la moelle épinière. </li><li> Couvrir le cordon médullaire exposée avec de petits morceaux de coton imbibés ou spongel avec du sérum physiologique pour éviter la dessiccation. </li><li> Placez une coutume de bain en plastique sur le dessus du dos, qui entoure la moelle épinière. Fixez le bain en place avec du fil de soie 4/0. Assurez-vous que le bain est étanche en la scellant avec Kwik-Cast étanchéité (WPI). </li><li> Une fois que le Kwik-Cast a séché, retirez le coton couvrant la moelle épinière, et remplir la baignoire avec de l&#39;huile minérale. </li><li> Utilisation Dumont 5 pinces et ciseaux très fins iris, tirez doucement sur le second duréer entourant la moelle épinière, et ouvrez-le aussi loin que possible dans les deux sens. Plier la durée de chaque côté de la moelle épinière. </li><li> Abaisser la plate-forme surélevée sur laquelle la souris est située de manière à maintenir suspendu par la pince vertébrale. </li><li> Utilisez une autre pince vertébrale pour serrer une apophyse épineuse de la région sacrée pour soutenir la région lombaire de l&#39;animal. </li><li> Dispositif de serrage troisième est utilisé pour immobiliser la patte arrière droite et de la cheville, à un angle de flexion de 90 ° au niveau du genou. </li></ol> 11. Dissection du tendon d&#39;Achille <ol><li> Avec la branche coudée à 90 ° au niveau du genou et de la cheville, retirer la toile recouvrant la zone des pattes arrière, et disséquer le tendon d&#39;Achille sans le tissu environnant. Disséquer le plus possible le triceps sural du tissu environnant ainsi. </li><li> Couper le tendon du muscle plantaire près de calcanéum, puis coupez-le de nouveau pour enlever complètement le tendon. </li><li> En utilisant une aiguille fileté, fixez fil 6/0 de la soie à travers èmee tendon d&#39;Achille et faire un noeud triple autour du tendon. </li><li> Placez le capteur de force près du nœud, coupez la partie distale du tendon, et l&#39;attacher à l&#39;aide du capteur de force le fil de soie. </li><li> Insérez deux longueurs de fil d&#39;acier inoxydable sous l&#39;aponévrose des muscles triceps sural. Ces fils sont reliés à un amplificateur de courant alternatif pour l&#39;enregistrement extracellulaire EMG. </li><li> Placez le nerf fibulaire commun et le nerf tibial sur deux électrodes bipolaires crochet. </li><li> Placer le triceps sural nerf sur la cathode d&#39;une électrode de crochet, avec l&#39;anode de toucher un muscle à proximité. </li><li> Connecter tous les électrodes de stimulation à une unité d&#39;isolement. </li><li> Placer une électrode de bille sur la surface dorsale de la moelle épinière, relié à un amplificateur AC extracellulaire à enregistrer les potentiels de cordon dos. Placez une électrode de référence Ag / AgCl en contact avec un muscle du dos. </li></ol> 12. Douze Étapes Stimuler le nerf triceps suralà l&#39;aide de 50 microsecondes carré impulsion d&#39;intensité croissante à basse fréquence (&lt;1 Hz) jusqu&#39;à ce que l&#39;amplitude contraction maximale est observée. Déplacer lentement le transducteur de force pour étirer le muscle tout en surveillant l&#39;amplitude de la réponse contractile jusqu&#39;à l&#39;amplitude contraction atteint un maximum. 13. Les enregistrements intracellulaires de motoneurones A partir de ce moment-là, des techniques électrophysiologiques sont utilisés pour préparer une électrode intracellulaire, pénétrer dans un neurone dans la moelle épinière et l&#39;identifient comme un motoneurone. <ol><li> Tirez une micropipette de verre à une extrémité ~ 1 um à l&#39;aide d&#39;un extracteur de pipette (P-97 Micropipette Puller, Instruments Sutter). Remplir l&#39;électrode avec une solution de KCl 3M (résistance de l&#39;électrode de 10-20 MQ). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un micropositionneur, conduire la micropipette, connecté à un amplificateur intracellulaire (Axoclamp 2B, Axon Instruments) dans la moelle épinière. Surveiller les potentiels de champs locaux provoquées par la stimulation de la ehaque nerf pour localiser le parc de véhicules du triceps sural. </li><li> Soigneusement approcher motoneurones putatifs tout en surveillant la résistance de la microélectrode. Lorsque l&#39;on pousse contre une membrane, la résistance augmente. La pénétration peut parfois être facilitée en utilisant le «buzz» en fonction de l&#39;amplificateur intracellulaire. </li></ol> 14. Procédure euthanasie A la fin de l&#39;expérience, l&#39;animal est euthanasié par une surdose de pentobarbital (210 mg / kg IV), suivie par décapitation.

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	<li>Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+some+other+factors+of+reflex+inhibition.">Recruitment and some other factors of reflex inhibition.</a> Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).</li><li>Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+spinal+motoneurones+of+normal+and+dystrophic+mice.">Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice.</a> The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).</li><li>Alstermark, B., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recordings+of+bulbospinal+excitation+in+adult+mouse+forelimb+motoneurons.">In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons.</a> Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).</li><li>Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+properties+of+mouse+lumbar+motoneurons+revealed+by+intracellular+recording+in+vivo.">Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo.</a> Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).</li><li>Iglesias, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+mode+oscillations+in+mouse+spinal+motoneurons+arise+from+a+low+excitability+state.">Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).</li><li>Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+mice+lacking+V2a+interneurons,+gait+depends+on+speed+of+locomotion.">In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion.</a> J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).</li><li>Talpalar, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+minimal+neuronal+networks+involved+in+flexor-extensor+alternation+in+the+mammalian+spinal+cord.">Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord.</a> Neuron. 71, 1071-1084 (2011).</li><li>Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1-dependent+spinal+interneuron+subtypes+are+required+for+the+formation+of+left-right+alternating+locomotor+circuitry.">Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry.</a> J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Simpson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+(12+hours)+intravenous+anesthesia+in+the+rat.">Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat.</a> Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).</li><li>Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Unit+Types+-+Functional+Specializations+in+Motor+Control.">Motor Unit Types - Functional Specializations in Motor Control.</a> Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).</li><li>Kerkut, G. A., Bagust, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+mammalian+spinal+cord.">The isolated mammalian spinal cord.</a> Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).</li><li>Carp, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+protocol+for+recording+from+spinal+motoneurons+of+adult+rats.">An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vitro+Spinal+Cord+Slice+Preparation+for+Recording+from+Lumbar+Motoneurons+of+the+Adult+Mouse.">An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse.</a> Journal of Neurophysiology. , (2011).</li><li>Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+duration+perforated+patch+recordings+from+spinal+interneurons+of+adult+mice.">Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice.</a> Journal of Neurophysiology. , (2011).</li><li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha,+beta+and+gamma+motoneurons:+functional+diversity+in+the+motor+system's+final+pathway.">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).</li><li>Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decerebrate+adult+mouse+model+for+examining+the+sensorimotor+control+of+locomotion.">A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).</li><li>Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fictive+locomotion+in+the+adult+decerebrate+and+spinal+mouse+in+vivo.">Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo.</a> The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La préparation décrite ici est la première qui permet, chez la souris adulte, simultanée d&#39;un enregistrement intracellulaire motoneurone lombaire et la mesure de la force produite par les fibres musculaires innervées par son axone. En raison de la petite taille de l&#39;animal, les compétences chirurgicales nécessaires pour cette préparation peut être difficile à acquérir. Cependant, une fois ces compétences sont maîtrisées, toute la chirurgie peut être réalisée en trois...

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Marin Manuel 
 
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Manuel Marin

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Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Le sulfate d&#39;atropine </td><td> Aguettant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methylprenidsolone </td><td> Pfizer </td><td> Solu-Medrol </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital de sodium </td><td> Sanofi-Aventis </td><td> Pentobarbital </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Expanseur du volume plasmatique </td><td> Roger Bellon </td><td> Plasmagel </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à bouts ronds </td><td> FST </td><td> 14079-10 </td><td></td></tr><tr><td> Blunt ciseaux fins </td><td> FST </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Ciseaux Spring </td><td> FST </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Fine pince à dents de scie </td><td> FST </td><td> 11370-32 </td><td></td></tr><tr><td> Fine pince à dents de scie </td><td> FST </td><td> 11370-31 </td><td></td></tr><tr><td> Cunningham Adaptateur épinière </td><td> Stoelting Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kwik-Cast étanchéité </td><td> WPI </td><td> # KWIK-CAST </td><td></td></tr><tr><td> Ventilateur </td><td> CWE Inc </td><td> SAR-830/AP </td><td></td></tr><tr><td> Capnographe </td><td> CWE Inc </td><td> μcapstar </td><td></td></tr><tr><td> Couverture chauffante </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507221F </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur intracellulaire </td><td> Axon Instruments </td><td> Axoclamp 2B </td><td></td></tr><tr><td> Pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333-500G </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo

Le motoneurone spinal a longtemps été un bon modèle pour l&#39;étude de la fonction nerveuse parce que c&#39;est un neurone du système nerveux central avec des propriétés uniques de (1) ayant des cibles facilement identifiables (les fibres musculaires) et donc ayant une fonction bien connue (pour contrôler la contraction musculaire), (2) d&#39;être la cible de convergence de plusieurs réseaux spinaux et descendant, d&#39;où le nom de «voie finale commune», et (3) ayant une grande soma qui permet de les pénétrer avec de fortes électrodes intracellulaires . En outre, lorsqu&#39;ils sont étudiés in vivo, il est possible d&#39;enregistrer simultanément l&#39;activité électrique des neurones moteurs et la force développée par leurs cibles musculaires. Effectuer des enregistrements intracellulaires de motoneurones in vivo donc mis l&#39;expérimentateur dans la position unique d&#39;être en mesure d&#39;étudier, dans le même temps, tous les compartiments de l &#39;&quot;unité moteur&quot; (le nom donné à l&#39;motoneurone, son axone, etles fibres musculaires qu&#39;il innerve 1): les entrées empiétant sur ​​le motoneurone, les propriétés électrophysiologiques du motoneurone, et l&#39;impact de ces propriétés sur la fonction physiologique des motoneurones, c&#39;est à dire la force produite par son moteur. Cependant, cette approche est très difficile parce que la préparation ne peut pas être paralysé et donc la stabilité mécanique de l&#39;enregistrement intracellulaire est réduite. Ainsi, ce type d&#39;expériences a été réalisée que chez les chats et les rats. Cependant, l&#39;étude des systèmes spinaux pourrait faire un bond formidable s&#39;il était possible de réaliser des expériences similaires chez les souris normales ou génétiquement modifiés. Pour des raisons techniques, l&#39;étude des réseaux spinaux chez la souris a été principalement limitée aux nouveau-nés dans les préparations in vitro, où les motoneurones spinaux et les réseaux sont immatures, les motoneurones sont séparés de leurs objectifs, et lorsqu&#39;ils sont étudiés en tranches, le motoneurons sont séparées de la plupart de leurs intrants. Jusqu&#39;à récemment, seuls quelques groupes ont réussi à effectuer des enregistrements intracellulaires de motoneurones in vivo 2-4, y compris notre équipe qui a publié une nouvelle préparation qui nous a permis d&#39;obtenir des enregistrements très stables des motoneurones in vivo chez la souris adulte 5,6. Toutefois, ces enregistrements ont été obtenus chez les animaux paralysés, c&#39;est à dire sans la possibilité d&#39;enregistrer la sortie de force de ces motoneurones. Ici, nous présentons une extension de cette préparation originale dans laquelle nous avons pu obtenir des enregistrements simultanés des propriétés électrophysiologiques des motoneurones et de la force développée par leur moteur. Il s&#39;agit d&#39;une réalisation importante, car elle nous permet d&#39;identifier les différents types de motoneurones en fonction de leur profil de force, et révélant ainsi leur fonction. Couplés avec des modèles génétiques perturbant la colonne vertébrale segmentaire circuits 7-9, ou reproducting humaine disea10,11 soi, nous nous attendons que cette technique soit un outil essentiel pour l&#39;étude du système moteur spinal.

La figure 1 montre comment identifier un motoneurone du groupe triceps sural après la pénétration. Au intensité de la stimulation faible, seule une EPSP monosynaptique peuvent être observées (figure 1A). A plus haute intensité, l&#39;EPSP peut être suffisamment importante pour déclencher une &quot;orthodromique&quot; pic (figure 1B). Au intensité de stimulation encore plus élevé, un antidromique tout-ou-rien pic apparaît, avec une latence plus courte que l&...

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Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

Cette nouvelle méthode permet l&#39;enregistrement simultané intracellulaire d&#39;une souris adulte seul motoneurone et la mesure de la force produite par les fibres musculaires. L&#39;enquête combine des propriétés électriques et mécaniques des unités motrices chez les animaux normaux et génétiquement modifiées est une percée pour l&#39;étude du système neuromusculaire.

Enregistrement simultané intracellulaire d&#39;un motoneurone lombaire et la force produite par l&#39;unité de moteur chez la souris adulte<em&gt; In vivo</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

simultaneous-intracellular-recording-lumbar-motoneuron-force-produced

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

14.6K vues.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Cette nouvelle méthode permet l'enregistrement simultané intracellulaire d'une souris adulte seul motoneurone et la mesure de la force produite par les fibres musculaires. L'enquête combine des propriétés électriques et mécaniques des unités motrices chez les animaux normaux et génétiquement modifiées est une percée pour l'étude du système neuromusculaire.

Vidéo: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neurosciences

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d&#39;explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Un guide pour<em&gt; In vivo</em&gt; Simple unité d&#39;enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.