Ce travail a été financé par des subventions de recherche G0400268 et MR / K018396 / 1 du Conseil de recherches médicales, et par l&#39;action de la recherche médicale. Un soutien supplémentaire a été fourni par l&#39;Institut national de Collège hôpitaux de London Centre de recherche biomédicale de l&#39;Université de la recherche en santé.

Toutes les expériences pratiquées sur les animaux dans cette étude étaient conformes à la législation nationale et européenne et ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de l&#39;École de pharmacie de l&#39;UCL et de l&#39;Intérieur du Royaume-Uni (HO). Tous les travaux des animaux a été réalisée sous projet HO licences PPL 80/2243 et 70/7773 PPL. 1. Préparation Rat <ol><li> Effectuer toutes les expériences in vivo sur des rats nouveau-nés Wistar exempts d&#39;agents pathogènes. </li><li> Conservez toutes les portées de rats (12 nouveau-nés par colonie) dans des cages individuelles avec leurs mères allaitantes (9 - 11 semaine vieilles femelles), dans des conditions optimales (19 à 21 ° C, 45 - 55% d&#39;humidité, 15 - 20 changements d&#39;air / h et 12 h cycle lumière / obscurité). </li></ol> 2. Préparation cellules bactériennes <ol><li> Magasin E. coli K1 dans les stocks de 20% (v / v) de glycerol à -80 ° C. Pour chaque expérience, étaler actions bactéries SUR DES Mueller-Hinton (MH) des plaques d&#39;agar, et incuber à 37 ° CO / N. </li><li> La veille de l&#39;alimentation, inocufin 10 ml de bouillon MH avec un seul E. coli K1 colonie et culture O / N à 37 ° C, 200 rpm. Comme un contrôle de contamination moyen, préparer 10 ml de bouillon MH non inoculé et incuber à 37 ° C à 200 rpm. </li><li> Transférer 100 pl de O / N suspension bactérienne dans 9,9 ml de bouillon MH (1: 100 v / v), et on incube à 37 ° C, 200 tours par minute, jusqu&#39;à la mi-exponentielle de phase est atteinte, ce qui correspond à une densité optique de 0,6 mesurée à une longueur d&#39;onde de 600 nm (DO 600). </li></ol> 3. L&#39;alimentation de rats nouveau-nés avec E. coli K1 <ol><li> Tirez doucement l&#39;animal verticalement dans une main de la peau du cou, permettant la bouche pour l&#39;ouvrir. Introduire lentement la pointe de pipette stérile dans la bouche de l&#39;animal, et la pipette 20 ul de l&#39;inoculum (~ 37 ° C) dans la bouche de l&#39;animal sur une période de temps de 30 sec. Retour à l&#39;animal de sa mère immédiatement après le repas. </li><li> Vérifiez que de 4 - 8 x 10 6 bactéries ont été nourris to chaque chiot par dilution en série de l&#39;inoculum dans PBS et repérer sur gélose MH. </li></ol> 4. Évaluation de la colonisation par E. coli K1 <ol><li> Tirez doucement l&#39;animal dans une main de la peau du cou. Humidifiez un tampon de coton-tige stérile dans du PBS stérile, puis essuyez-la délicatement la zone péri-anale. Retour à l&#39;animal de sa mère immédiatement après badigeonnage. </li><li> Placez la pointe de l&#39;écouvillon dans un tube contenant 300 pi de PBS stérile et stocker sur la glace. </li><li> Déterminer le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques d&#39;agar de MacConkey. </li><li> Déterminer E. viable coli K1 par des tests de sensibilité bactériophage. Choisissez une colonie individuelle en utilisant une boucle microbiologique stérile, trempé dans 200 ul de PBS stérile, puis soumis à un agitateur vortex. </li><li> En utilisant une boucle microbiologique stérile, sous-culture sur gélose MH en ligne droite. Laissez sécher la plaque pendant 30 secondes, puis pipette de 10 pi de bacteriophage K1E (10 9 unités formant des plages / ml (PFU / ml)) sur le centre de la ligne. Incuber la plaque O / N à 37 ° C. </li><li> Le lendemain, examiner la plaque de lyse intermédiaire de bactériophages. </li></ol> 5. Évaluation de la gravité de la maladie <ol><li> Évaluer la gravité de la maladie de chaque animal 4 - 5 fois par jour en utilisant le système de notation en sept points présenté dans le tableau 1. </li><li> Si un score de animales ≥3 sur 7, abattre immédiatement l&#39;animal à minimiser la souffrance. Notez l&#39;animal mort. </li></ol> 6. Euthanasie de rats nouveau-nés et la collecte de sang <ol><li> Tirez doucement l&#39;animal dans une main, l&#39;exposition de la tête et du cou. Désinfecter le cou de l&#39;animal en l&#39;essuyant avec un tampon imbibé d&#39;alcool. Désinfecter une grande paire de ciseaux en utilisant 70% d&#39;éthanol, avant de rincer dans du PBS stérile pour éliminer les traces de l&#39;éthanol. </li><li> Tirez doucement l&#39;animal directement au-dessus d&#39;une boîte de Pétri. Décapiter le nouveau-né à l&#39;aide Surgi forteciseaux ques, assurant que le sang coule dans la boîte de Pétri. Eviter le contact avec la tête pour éviter la contamination du sang avec la flore de la peau. </li><li> Immédiatement recueillir le sang à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile et mélanger avec le sel de sodium de l&#39;héparine à une concentration de 20 à 50 unités / ml dans un tube à centrifuger de 0,5 ml. </li><li> Déterminer le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques d&#39;agar de MacConkey. Déterminer le nombre de E. viable coli K1 en testant la sensibilité des bactéries viables à K1E bactériophage. </li></ol> 7. Dissection <ol><li> Après la décapitation du rat nouveau-né, dans des conditions aseptiques pour exciser et de recueillir des tissus d&#39;intérêt. Laver tous les instruments (voir figure 1) à 70% d&#39;éthanol et PBS stérile. </li><li> Nettoyez le bord de dissection et mouiller l&#39;abdomen complètement avec 70% d&#39;éthanol. Placez le cadavre sur son dos et fixer à la carte de dissection par (i) épinglant la patte arrière gauche dela table d&#39;opération avec une aiguille stérile, (ii) l&#39;étirement du corps et l&#39;épinglage la patte avant droite de la table d&#39;opération, (iii) épinglant la patte arrière droite et gauche patte de la table d&#39;opération. </li><li> Tirez la peau le long du côté gauche de l&#39;abdomen inférieur à l&#39;aide de pinces, puis couper le long du côté gauche du cadavre de l&#39;abdomen inférieur du sternum à l&#39;aide de petits ciseaux de dissection. </li><li> Étendre l&#39;excision à travers le sternum, puis sur le côté de la main droite du cadavre du sternum au bas de l&#39;abdomen à l&#39;aide de pinces et de petits ciseaux de dissection, assurant qu&#39;aucun des structures sous-jacentes sont endommagés. </li><li> Enfin, tirez doucement sur le volet de la peau de la poitrine à l&#39;abdomen inférieur en utilisant l&#39;iris pinces à dissection courbes pour exposer le péritoine. </li><li> Soulevez doucement le péritoine avec une pince et couper verticalement pour exposer les organes internes, assurant qu&#39;aucun des organes sous-jacents sont endommagés. </li></ol> 8. Collectele tube digestif <ol><li> Identifier l&#39;estomac, l&#39;intestin grêle, caecum, le côlon et le système lymphatique mésentérique. </li><li> Retirez l&#39;estomac par sectionnant doucement de chaque côté, puis le placer dans un bijou contenant 1,6 ml de PBS stérile à l&#39;aide de pinces stériles. </li><li> Transect le côlon au rectum. Retirez soigneusement la totalité de la masse intestinale du cadavre en utilisant une pince de dissection et les placer dans une boîte de Pétri stérile. Assurez-vous que cela est fait doucement afin que la structure intestinale et structures lymphatiques mésentériques ne se séparent pas. </li></ol> 9. La séparation du tube digestif et du système lymphatique mésentérique (Figure 2) <ol><li> Verser 30 ml de PBS stérile dans la boîte de Pétri, en assurant le tractus gastro-intestinal est complètement immergé. </li><li> Identifier la masse centrale du système lymphatique mésentérique, et pincer à l&#39;aide de fines pinces à dissection. Identifier la partie la plus proximale de l&#39;intestin grêle, et pincer à l&#39;aide de fines pinces à dissection. </li><li> Tirez doucement sur le central de masse de système lymphatique mésentérique et l&#39;intestin grêle distal dans des directions opposées jusqu&#39;à ce que les deux tissus sont totalement séparées l&#39;une de l&#39;autre. Effectuez ce processus avec soin pour veiller à ce que les petits intestins ne sont pas tendus, car cela empêche la collection reproductible proximale, moyenne et régions distales. Placez le système lymphatique mésentérique dans 300 à 500 pi de PBS stérile et placer sur la glace. </li></ol> 10. Le sectionnement du tube digestif <ol><li> Transect le tractus gastro-intestinal à la caecum de séparer l&#39;intestin grêle du côlon. </li><li> Placez le côlon dans 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace. </li><li> Recueillir les tissus représentatifs des régions proximale, intermédiaire et distale de l&#39;intestin grêle. Aligner l&#39;intestin grêle de la mi-parcours. </li><li> Puis, (i) collectionne les 2 derniers cm de tissu avant de le caecum que l&#39;intestin grêle distal, (ii) de recueillir le tissu 5-7 cm au-dessus du point médian comme l&#39;intestin grêle proximal, et(Iii) recueillir le tissu du 3 - 5 cm au-dessous du point médian que l&#39;intestin grêle milieu. </li></ol> 11. Collecte du foie <ol><li> Identifier les trois lobes du foie de rat après l&#39;enlèvement de l&#39;estomac. </li><li> Tirez lobes loin de la cavité abdominale à l&#39;aide de fines pinces à dissection. </li><li> Retirer le foie par couper les ligaments fixation à l&#39;aide de ciseaux fins. Placer le foie dans 300 à 500 pi de PBS stérile et placer sur la glace. </li></ol> 12. La collecte de Spleen <ol><li> Identifier la rate. </li><li> Tirez rate loin de l&#39;estomac et utiliser des ciseaux fins à couper le ligament gastro. </li><li> Placez la rate dans 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace. </li></ol> 13. La collecte des reins <ol><li> Identifier les reins qui deviendront visibles à l&#39;arrière de la cavité abdominale lors de l&#39;enlèvement de l&#39;appareil gastro-intestinal et d&#39;autres organes. </li><li> Uretères coupées et des ligaments attachés uchanter des ciseaux fins de dissection et enlever les reins à l&#39;aide de pinces fines. Retirer les glandes surrénales et toute matière grasse (si encore attaché) à l&#39;aide de pinces fines et des ciseaux de dissection. </li><li> Placez les deux reins à 300-500 pi de PBS stérile et placer sur la glace. </li></ol> 14. Collecte du cerveau <ol><li> Après décapitation, maintenir la tête en position verticale en utilisant des pinces courbes. Pincez la peau sur le dessus de la tête en utilisant longitudinalement une autre série de pinces courbes, et faire une incision à l&#39;aide des ciseaux fins de dissection. Couper en restant près de la peau du cou, de nouveau longitudinalement avec des ciseaux fins de dissection. </li><li> Tirez la peau dans une direction vers l&#39;extérieur à l&#39;aide de pinces fines des deux côtés de révéler le crâne et supprimer lambeaux de peau à l&#39;aide de ciseaux fins de dissection. Placez ciseaux fins de dissection en ouverture de la moelle et faire une incision le long du crâne vers la tribune. </li><li> Tirez sur les deux sections du crâne dans une direction vers l&#39;extérieur à l&#39;aide de pinces fines. Couper pour supprimer les segments du crâne. </li><li&gt; Supprimer cerveau à l&#39;aide de larges pinces, en utilisant un mouvement vers le haut de l&#39;excavation de l&#39;ouverture de la moelle vers la tribune. Laver le cerveau dans du PBS deux fois pour enlever tout le sang de la procédure de décapitation. </li></ol> 15. Traitement des tissus et homogénéisation <ol><li> Pour les expériences nécessitant des comptages de viabilité ou l&#39;extraction d&#39;ADN, place des tissus dans des tubes contenant du PBS stérile. Déterminer immédiatement le nombre de bactéries viables par dilution en série dans du PBS et placage sur des plaques de gélose de Mac Conkey, ou conserver à -20 ° C avec 20% de glycérol pour le court terme. Pour l&#39;extraction de l&#39;ADN, des tissus de conserver à -20 ° C. </li><li> Pour les expériences nécessitant l&#39;extraction d&#39;ARN, place des tissus dans des volumes appropriés de solution RNAlater (10 pi par 1 mg de tissu), puis stocker immédiatement à -20 ° C pour le court terme ou à -80 ° C stockage à long terme. </li><li> Pour les expériences nécessitant toner, posez tissus dans 10 ml de solution Methacarn (60% méthanol, 30% de chloroforme et de l&#39;acide acétique à 10%), puis stocker unet RT (20-25 ° C) pendant jusqu&#39;à 3 semaines. </li><li> Calculer le poids du tissu par comparaison des poids des tubes avant et après addition de tissus. Homogénéiser les tissus à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur. Laver une fois l&#39;homogénéisateur dans 70% d&#39;éthanol et deux fois dans du PBS stérile entre l&#39;homogénéisation de chaque échantillon. REMARQUE: Methacarn fixation est souhaitable pour la fixation des échantillons intestinaux afin de préserver les structures de défense des muqueuses liée mucine; formol fixation peut être utilisé pour les tissus systémiques. </li></ol>

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	<li>Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+meningitis+in+the+newborn:+a+prospective+study+of+mortality+and+morbidity.">Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity.</a> 23 (5), 218-225 (1999).</li><li>Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+diagnosis,+and+antimicrobial+treatment+of+acute+bacterial+meningitis.">Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).</li><li>Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queir&#243;s, F., Nova, C. V., Lucena, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+newborn+bacterial+meningitis+and+sepsis+during+the+pregnancy+period+for+public+health+care+system+participants+in+Salvador,+Bahia,+Brazil.">Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil.</a> J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).</li><li>Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+the+newborn:+basic+mechanisms+and+clinical+correlates.">Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).</li><li>Robbins, J. B., et al., Med, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K1+capsular+polysaccharide+associated+with+neonatal+meningitis.">Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis.</a> N. Eng. J. 290 (22), 1216-1220 (1974).</li><li>Korhonen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hemolysin+production,+and+receptor+recognition+of+Escherichia+coli+strains+associated+with+neonatal+sepsis+and+meningitis.">hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis.</a> Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).</li><li>Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysialic+acid+in+the+plasticity+of+the+developing+and+adult+vertebrate+nervous+system.">Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).</li><li>Koedel, U., Pfister, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+experimental+bacterial+meningitis.">Models of experimental bacterial meningitis.</a> Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).</li><li>Tunkel, A. R., Scheld, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+pathophysiology+of+bacterial+meningiits.">Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits.</a> Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+K1+capsule+is+the+critical+determinant+in+the+development+of+Escherichia+coli+meningitis+in+the+rat.">The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).</li><li>Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+Escherichia+coli+share+common+virulence+factor+profiles,+serotypes+and+phylogeny+with+other+extraintestinal+E.+coli.">Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli.</a> Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).</li><li>Sarff, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Escherichia+coli+K1+in+healthy+and+diseased+newborns.">Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns.</a> Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).</li><li>Schiffer, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review:+relation+between+invasiveness+and+the+K1+capsular+polysaccharide+of+Escherichia+coli.">A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli.</a> Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).</li><li>Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+infant+intestinal+microbiota.">Development of the human infant intestinal microbiota.</a> PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).</li><li>Nassif, X., Bourdoulous, S., Eug&#232;ne, E., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+extracellular+pathogens+cross+the+blood-brain+barrier.">How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier.</a> Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).</li><li>Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+infant+rat+as+a+model+of+bacterial+meningitis.">The infant rat as a model of bacterial meningitis.</a> J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).</li><li>Birchenough, G. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+innate+defenses+in+the+neonatal+gastrointestinal+tract+in+response+to+colonization+by+neuropathogenic+Escherichia+coli.">Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).</li><li>Ganz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensins:+antimicrobial+peptides+of+innate+immunity.">Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).</li><li>Bevins, C. L., Salzman, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells,+antimicrobial+peptides+and+maintenance+of+intestinal+homeostasis.">Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).</li><li>Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+influenzae+meningitis+in+infant+rats+after+intranasal+inoculation.">Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation.</a> J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).</li><li>Bortolussi, R., Ferrieri, P., Bj&#246;rkst&#233;n, B., Quie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsular+K1+polysaccharide+of+Escherichia+coli:+relationship+to+virulence+in+newborn+rats+and+resistance+to+phagocytosis.">Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis.</a> Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).</li><li>Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+neonatal+Escherichia+coli+meningitis:+induction+of+bacteremia+and+meningitis+in+infant+rats+fed+E.+coli+K1.">Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1.</a> Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).</li><li>Pluschke, G., Mercer, A., Kuse&#263;ek, B., Pohl, A., Achtman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+bacteremia+in+newborn+rats+by+Escherichia+coli+K1+is+correlated+with+only+certain+O+(lipopolysaccharide)+antigen+types.">Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types.</a> Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+capsule-selective+endosialidase+E+minimizes+changes+in+organ+gene+expression+induced+by+experimental+systemic+infection+with+Escherichia+coli+K1.">Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+polysialyl+capsule+during+blood-to-brain+transit+of+neuropathogenic+Escherichia+coli+K1.">Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1.</a> Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+cure+of+systemic+Escherichia+coli+K1+infection+by+modification+of+the+bacterial+phenotype.">Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).</li><li>Achtman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+widespread+bacterial+clones+among+Escherichia+coli+K1+isolates.">Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates.</a> Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).</li><li>Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+experimental+Escherichia+coli.+infection+with+recombinant+bacteriophage-derived+capsule+depolymerase.">Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).</li><li>Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacteriophages+specific+for+the+K1+polysaccharide+antigen+of+Escherichia+coli.">Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Le modèle animal décrit ici se fonde sur des travaux antérieurs qui vise à reproduire les principales caractéristiques des infections survenant naturellement chez l&#39;homme. Rats nouveau-nés ont été initialement utilisées pour étudier la méningite infantile dus à H. influenzae de type b-dire l&#39;espèce remplit les critères clés pour un modèle robuste de l&#39;infection. Ainsi, le portail d&#39;entrée de l&#39;agent pathogène devrait refléter celle de l&#39;infection naturelle de l&#39;homme et donner reproductible monter à la pathologie semblable d&#39;une durée suffisante pour permettre une intervention thérapeutique. Les techniques utilisées ne doit pas limiter l&#39;application de la procédure et ne devraient pas contribuer à la maladie résultat 20. Le modèle de H. influenzae méningite chez les rats nourrissons développés par Moxon et collègues répond à ces critères 20; l&#39;infection naturelle se produit après la colonisation des muqueuses des voies respiratoires supérieures et cette caractéristique importante a été reproduit dans les rats nouveau-nés par des non-traumatiquetic instillation des bactéries sur les membranes des voies nasales. Fait important, la nature dépendant de l&#39;âge de l&#39;infection a été reproduit dans le modèle. Le même groupe étaient également les premiers à développer un modèle non-invasive de E. coli K1 NBM chez le rat nouveau-né 22. Chiots Sprague-Dawley exempts d&#39;agents pathogènes ont été colonisés par l&#39;alimentation 10 août au 10 oct bactéries à travers un tube gastrique par voie orale; l&#39;inoculum est donc considérablement plus élevée que celle employée par nous. La colonisation par les trois souches K1 examinés, C94 (O7: K1: H), EC3 (O1: K1: H) et LH (O75: K1: H3), a eu lieu dans une proportion relativement élevée (48-74%) de K1 animaux nourris, mais l&#39;incidence de la bactériémie, la méningite et la mortalité étaient variables et significativement plus faible que les taux de la colonisation. La nature clonale de E. coli K1 infection expérimentale a été établi plus tard 23 et il est maintenant évident que seule O18: K1 et, dans une moindre mesure, O7: K1 sérotypes sont capablesà provoquer systématiquement une infection systémique. Pour cette raison, ces enquêtes de la pathogenèse de neuropathogène E. coli K1 étaient basées sur l&#39;utilisation de la O18 virulence accrue: K1 souche A192PP. Une comparaison de E. coli K1 alimentation de rats nouveau-nés grâce à une sonde gastrique, tel qu&#39;il est utilisé par Glode et ses collègues 22, et une méthode d&#39;alimentation des gouttelettes comme employé par le groupe Achtman 23 a révélé un nombre excessif de décès à l&#39;aide de la première méthode, presque certainement en raison de dommages aux surfaces muqueuses par la sonde gastrique. Comme les taux de colonisation sont comparables à ces deux méthodes, il est recommandé d&#39;utiliser la méthode moins invasive de nourrir les bactéries à l&#39;aide d&#39;une pipette avec une pointe stérile, tel que décrit dans la présente communication. E. coli A192PP de souche utilisée dans nos études est O18: K1. Il est de plus un dérivé de la souche virulente de E. clinique coli A192 qui a été initialement récupéré à partir d&#39;un patient atteint de septicémie 27 </sup&gt;. La virulence accrue de la souche a été obtenue par passage en série par 26 rats nouveau-nés. La souche provoque une gravité de la maladie dépendant de l&#39;âge, de la bactériémie et 100% de mortalité lorsqu&#39;ils sont administrés à des animaux âgés 2 jours 28. En revanche, âgés de 9 jours les animaux sont complètement résistants à la maladie. K1-spécifique du bactériophage lytique peut être utilisé pour distinguer E. coli K1 autre de E. souches coli 29. Dans cette étude, la sensibilité des bactéries viables à K1E bactériophage doit être utilisé pour (i) vérifier la pureté de la E. suspensions coli K1 prêts à être donnés aux animaux, et (ii) de différencier E. coli K1 des autres coliformes afin de calculer la viabilité dans les écouvillons péri-anales, du sang et des échantillons de tissus. Si la colonie est E. coli K1, elle sera susceptible de bactériophage K1E lyse, et la croissance bactérienne est inhibée au niveau du site d&#39;inoculation bactériophage. Si la colonie est pas E. coli K1, il sera brésistant à KIE lyse bactériophage e, et il devrait y avoir une zone de croissance bactérienne au site d&#39;inoculation bactériophage. Il convient de garder à l&#39;esprit que les modèles animaux ne peuvent pas refléter toutes les caractéristiques de la maladie naturelle. Le modèle actuel peut être modifié de manière à examiner les caractéristiques de virulence de bactéries autres que E. neuropathogènes coli A192PP et des variations dans la taille de l&#39;inoculum coloniser peuvent être logés. Les applications futures de la technique pourraient inclure l&#39;évaluation des médicaments a grand besoin de traiter la maladie et de découvrir les détails de la réponse de l&#39;hôte à la colonisation et l&#39;invasion des tissus. La méthode décrite ici est simple mais efficace. Portées simples de 10 - 12 chiots ont été employés comme groupes d&#39;essai ou de contrôle et cette approche dans litière assure un degré élevé de reproductibilité et de la validité statistique. Il est impératif que les chiots sont retournés à leur mère naturelle dès que possible après tout procedure et portées ne doivent pas comprendre pourquoi les animaux soumis à différentes interventions. Il est important que l&#39;inoculum nourris être réchauffé sinon les chiots rejeter la culture offert. Les chiots se développent rapidement une microflore complexe et dans les deux jours de la naissance, le tractus gastro-intestinal est colonisée avec un large éventail de bactéries du phylum établi que les microbes les plus abondants chez le nourrisson et adulte intestin. Les chiots qui ne sont pas nourris E. coli A192PP ne portent pas E. coli K1 dans le tractus gastro-intestinal 17 et ainsi de détermination des taux de colonisation est relativement simple. Cependant, la méthode à base de Neus qPCR pour la détection de la colonisation E. coli K1 est beaucoup plus sensible que les méthodes de culture traditionnelles et est fortement recommandé 17.

Infections bactériennes systémiques sont une menace majeure pour le bien-être et la survie du nouveau-né; nouveau-nés prématurés sont particulièrement vulnérables. Méningite bactérienne néonatale (NBM), souvent associée à une septicémie bactérienne, continue d&#39;être une source importante de mortalité et de morbidité au cours des premières semaines de vie et le problème est aggravé par l&#39;évolution continue de la résistance aux médicaments de première ligne antibactériennes 1,2. Un cas de NBM est une urgence médicale qui porte un fardeau médical, social et économique élevé 3; par conséquent, il ya un besoin urgent de nouvelles thérapies et, en particulier, de nouvelles stratégies prophylactiques pour réduire le fardeau de l&#39;infection. Certaines fonctionnalités de NBM sont rares: dans le monde développé, Escherichia coli et streptocoques du groupe B sont responsables de la grande majorité des cas et la capacité de ces souches à obtenir NBM est presque toujours associée à la présence d&#39;un polysaccharide de protection capsule qui permet à l&#39;agent pathogène de se soustraire à la reconnaissance immunitaire traite 4. Une très forte proportion (80 - 85%) de neuroinvasive E. coli exprimer la capsule K1 5,6, un polymère d&#39;acide sialique α-2,8-lié qui est structurellement identique à accueillir des modulateurs de la plasticité neuronale 7. L&#39;évaluation de nouvelles thérapeutiques et prophylactiques pour NBM et bactériémie associée et la septicémie en tirerait un avantage d&#39;un modèle animal robuste de l&#39;infection qui imite les caractéristiques principales de la maladie dans le nouveau-né humain, en particulier l&#39;âge-dépendance et une voie naturelle de l&#39;infection . Une large gamme de modèles pour la méningite bactériennes Gram-positives et Gram-négatives sont disponibles 8,9 et ceux-ci ont considérablement élargi nos connaissances sur la pathogenèse, la physiopathologie et les options de traitement de ces infections. Ainsi, des infections expérimentales chez le rat, la souris, le lapin et le singe ont été utilisées pour étudier à la fois dans la méningite neonate et l&#39;adulte. Cependant, nombre de ces modèles utilisent l&#39;injection directe intracisternale ou sous-cutanée de bactéries pour l&#39;initiation de l&#39;infection, ce qui crée une pathogenèse artificiel en court-circuitant les processus naturels de diffusion à partir du site de colonisation. Dans certains cas, ces méthodes d&#39;inoculation ont conduit à des changements importants dans la pathologie; par exemple, l&#39;administration sous-cutanée de E. souches coli K1 abrogés l&#39;âge-dépendance associée à l&#39;infection naturelle, la production de la bactériémie et l&#39;invasion du système nerveux central (SNC) dans les deux nouveau-nés et les adultes 10. Prédisposition à E. coli NBM dépend essentiellement de la transmission verticale de l&#39;agent causal de la mère à l&#39;enfant à ou peu après la naissance 11. D&#39;origine maternelle E. bactérie E. coli K1 colonisent le tractus gastro-néonatale (GI) 11-13, qui est stérile à la naissance, mais acquiert un microbiote complexe 14 rapidement. Dans les nouveau-nés colonisés, E. coliK1 bactéries ont la capacité de translocation de la lumière intestinale dans la circulation systémique avant de pénétrer dans le SNC à travers la barrière sang-cerveau ou de barrières de liquide céphalo-rachidien, le sang 9,15. La conception des modèles robustes de l&#39;infection expérimentale devrait prendre ces détails en compte. Bien que les souris ont été largement utilisés pour l&#39;étude de certaines formes de méningite bactérienne 8, ils ne sont pas adaptés pour les études de l&#39;infection néonatale: ils sont submergés par une infection systémique et ne montrent pas la caractéristique forte de dépendance des personnes âgées de 16 nouveau-nés humains. En outre, α-défensines, des peptides clés du tractus gastro-intestinal assurant une protection contre l&#39;invasion systémique par E. coli K1 17, sont fortement exprimés dans les cellules de Paneth et des neutrophiles chez les humains et les rats mais pas chez les souris 18. Il est un remarquable degré de duplication, de redondance et de l&#39;hétérogénéité dans défensines de la souris et les gènes cryptidin connexes ne trouve pas dans d&#39;autres uneimals 19. Le rat nouveau-né a été initialement utilisée par Moxon et ses collègues 20 pour étudier la pathogenèse de la méningite à Haemophilus influenzae après inoculation intranasale, reproduisant le site naturel de la colonisation de ce pathogène néonatal chez l&#39;homme, et par la suite adapté pour fonction de l&#39;âge E. coli K1 bactériémie et la méningite. Bortolussi et al. 21 salarié injection intrapéritonéale de l&#39;inoculum bactérien pour déclencher l&#39;infection mais l&#39;étude clé de Glode et ses collaborateurs 22 utilisé alimentation gastrique orale parallèle la voie naturelle d&#39;infection après GI colonisation. Comme le tube gastrique peut endommager les surfaces muqueuses, la procédure a été affinée afin d&#39;inclure l&#39;alimentation de l&#39;inoculum pour les nouveau-nés 23. Ici, la méthode de GI colonisation et les procédures de suivi de l&#39;infection chez les bébés rats sensibles sont décrits voies; en outre, les applications thérapeutiques et préventifs du modèle sont discutées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1042">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother)</td>
			<td>Harlan, UK</td>
			<td>www.harlan.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K1 A192PP</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriophage K1E</td>
			<td>Taylor lab</td>
			<td>www.ucl.ac.uk</td>
			<td>Mushtaq et al. 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>G5516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0337</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0405</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey Agar</td>
			<td>Oxoid, UK</td>
			<td>www.oxoid.com</td>
			<td>CM0007</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P4417</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>E7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>84020 
			Prepare 20-50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Solution</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>R0901 
			10&#181;l/mg tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>320099</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>C2432</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>322415</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton-tipped swabs</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>11542483</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcotip Swabs</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
			<td>www.scientificlabs.co.uk</td>
			<td>SWA1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma, UK</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
			<td>P5856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL Universal Tube</td>
			<td>AlphaLaboratories, UK</td>
			<td>www.alphalabs.co.uk</td>
			<td>CW3890</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1405-1500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>I1415-1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1&#181;l calibrated loops</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-0112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-shaped spreaders</td>
			<td>StarLab, UK</td>
			<td>www.starlab.co.uk</td>
			<td>E1412-1005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>10594175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12780036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight with blunt tips</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12391369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps watchmaker&#39;s curved with very fine points&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12740926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors straight with very fine points</td>
			<td>Fisher Scientific, UK</td>
			<td>www.fisher.co.uk</td>
			<td>12972055</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Scissors</td>
			<td>VWR, UK</td>
			<td>www.vwr.com</td>
			<td>USBE4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Syringe Needles</td>
			<td>Greiner Bio-One Ltd</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
			<td>N2525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers</td>
			<td>PerkinElmer, UK</td>
			<td>www.perkinelmer.co.uk</td>
			<td>L60000BB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unitemp Incubator</td>
			<td>B&#38;T, UK</td>
			<td></td>
			<td>OP958</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron shaking incubator</td>
			<td>INFORS HT, UK</td>
			<td>www.infors-ht.com</td>
			<td>AJ118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Turrax T-10 homogenizer</td>
			<td>IKA Werke</td>
			<td>www.ika.com</td>
			<td>0003737000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive model of neuropathogenic escherichia coli infection in the neonatal rat

Enquête sur les interactions entre l&#39;hôte et des produits animaux bactérie pathogène n&#39;a de sens que si le modèle d&#39;infection employée reprend les principales caractéristiques de l&#39;infection naturelle. Ce protocole décrit les procédures pour la mise en place et l&#39;évaluation de l&#39;infection systémique en raison de neuropathogène K1 Escherichia coli chez le rat nouveau-né. La colonisation du tractus gastro-intestinal conduit à la diffusion de l&#39;agent pathogène le long du parcours gut-lymphe-sang-cerveau de l&#39;infection et le modèle affiche une forte dépendance des personnes âgées. Une souche de E. coli O18: K1 avec virulence accrue pour le rat nouveau-né produit des taux exceptionnellement élevés de colonisation, une translocation vers le compartiment de sang et de l&#39;invasion des méninges suivant transit à travers le plexus choroïde. Comme dans l&#39;hôte humain, la pénétration du système nerveux central est accompagnée d&#39;une inflammation locale et un résultat invariablement mortelle. Le modèle est d&#39;une utilité avérée pour les études du mécanismede la pathogenèse, pour l&#39;évaluation des interventions thérapeutiques et pour l&#39;évaluation de la virulence bactérienne.

Le E. coli K1 modèle d&#39;infection systémique décrit ici reprend la plupart des caractéristiques de l&#39;infection naturelle chez l&#39;homme. Les bactéries sont ingérées, coloniser le tractus gastro-intestinal, la translocation dans le compartiment de sang via les ganglions lymphatiques mésentériques, avant l&#39;établissement de la maladie spécifique d&#39;un organe à une inflammation associée du cerveau 24. Surtout, le modèle affiche une forte dépendance des personnes âgées; comme le montre la figure 3, deux jours d&#39;âge (P2) de jeunes rats sont très sensibles à la maladie invasive, mais sur une période de sept jours, les animaux deviennent de plus en plus réfractaires à l&#39;infection, mais pas à 17 la colonisation du tube digestif. Après transit à partir du site de colonisation gastro-intestinal pour le compartiment sang, les bactéries peuvent être visualisés dans des échantillons de sang par microscopie de fluorescence (figure 4) avant d&#39;entrer dans le système nerveux central essentiellement au plexus choroïde 25. Chez certains animaux, il ya une vaste invasion d&#39;autres organes majeurs tels quepoumons, la rate et les reins 25. Le nombre de bactéries dans les tissus peuvent varier considérablement entre les petits individuelles 25, mais lorsque la charge microbienne est marqué comme présent ou absent, il ya un degré élevé de reproductibilité à l&#39;égard de l&#39;invasion organe. Avec une portée de 12 chiots en une seule cohorte de test, les calculs de puissance en utilisant G Software Puissance * déterminé que la taille de cet échantillon correspond à une probabilité de trouver un effet basé sur la survie en utilisant six animaux de la cohorte et&gt; 99% de probabilité si tout 98,6% douze sont pris en considération. Le modèle est donc adapté à l&#39;évaluation de nouveaux agents spécialement conçus pour le traitement des infections bactériennes et néonatale a été utilisé dans le mode opératoire pour évaluer le potentiel thérapeutique de la capsule dépolymérase EndoE qui supprime sélectivement la capsule K1 de la surface bactérienne 24-26. Il peut également être utilisé pour étudier les interactions hôte-bactérie qui ont un impact sur le pathogenesis de E. neuropathogens coli; dans ce contexte, il a été utilisé pour les études de E. coli A192PP colonisation et la diffusion. Il a été démontré que E. cellules coli A192PP persistent dans le tractus gastro-intestinal de P2, P5 et P9 chiots en grand nombre; aspects temporels de la colonisation dans ces trois groupes étaient très similaires (Figure 5) et reflète la capacité de la bactérie à reproduire et maintenir la densité de la population dans l&#39;intestin. La virulence de la souche clinique A192 a été renforcée par le passage en série chez les rats nouveau-nés afin d&#39;assurer que peu ou pas de redondance de l&#39;utilisation des animaux. E. coli A192 colonisé P2 rats nouveau-nés avec 100% d&#39;efficacité, a suscité une bactériémie chez 35% des animaux et a produit un effet létal à 25% 27. Le A192PP dérivé des passages colonise le tractus gastro-intestinal, produit bactériémie et provoque la létalité dans tous les petits P2. Ainsi, le modèle peut être utilisé pour étudier la virulence de différentes K1 souches en ce qui concerne leur capacité à envahir les autres systèmes d&#39;organes du système nerveux central et sur le site de colonisation. Dans ce contexte, Pluschke et collaborateurs 23 ont utilisé un modèle d&#39;infection chez le rat nouveau-nés afin de déterminer la capacité de 95 E. coli K1 souches d&#39;origine humaine pour provoquer une bactériémie après la colonisation intestinale; ils ont observé de grandes variations dans l&#39;efficacité de la colonisation et à la fois la capacité invasive, qui sous-tend la nature clonale de E. coli K1 neuropathogens. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" width="600" /> Figure 1. Matériaux pour la collecte de tissus: (A) balance, (b) des tubes pré-pesées contenant des milieux nécessaires, (C) le fonctionnement table, règle et aiguilles à cerner l&#39;animal, (D) 70% (v / v) de l&#39;éthanol et du PBS pour stériliser l&#39;équipement de collecte de tissu, <strong&gt; (E) Kit de collecte de tissus, y compris une grande paire de ciseaux pour la décapitation et ciseaux et des pinces et les lames de différentes tailles et formes, (F) la glace pour conserver les tissus, (G) 70% (v / v) d&#39;éthanol pour la stérilisation la table d&#39;opération et ses environs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" width="600" /> Figure 2. La séparation du tractus gastro-intestinal et le système lymphatique mésentérique. (A) Saisissez la masse centrale du système lymphatique mésentérique avec de fines pinces à dissection. (B) Saisissez la partie proximale de l&#39;intestin grêle, et tirer dans des directions opposées. (C) Le tractus gastro-intestinal et le système lymphatique mésentérique sera entièrement indépendante sure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. La survie des bébés rats nouveau-nés âgés de deux jours (P2) à neuf jours (P9) après l&#39;administration orale de E. coli A192PP, illustrant la forte dépendance des personnes âgées de l&#39;infection systémique. Chaque groupe représente 24 nouveau-nés. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4. images de fluorescence de E. cellules coli A192PP dans un frottis sanguin d&#39;un chiot de P2 infectés après administration orale de bactéries. L&#39;antigène lipopolysaccharide O à la surface bactérienne était stained avec un anticorps polyclonal de lapin anti-O18 et second anticorps conjugué à Alexa546 de chèvre anti-lapin. La capsule K1 a été visualisée avec un réactif EndoE-GFP. Pratiquement toutes les bactéries détectées dans des échantillons de sang affichées à la capsule de protection K1. Les images ont été capturées par le Dr Andrea Zelmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52018/52018fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52018/52018fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5. E. coli A192PP colonisation intestinale après l&#39;administration de l&#39;inoculum bactérien de l&#39;ADN. On a extrait de l&#39;intestin entier et E. coli K1 unités formant colonie / g (UFC / g) de tissu déterminé par la réaction quantitative en chaîne par polymérase (PCR quantitative) ciblant le gène polysialyltransférase (Neus) comme décrit ailleurs 17 </sup&gt;. LOD: limite de détection. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Caractéristique </td><td> Sain </td><td> Malsain </td></tr><tr><td> Couleur de la peau </td><td> Rose </td><td> Pale / Jaune </td></tr><tr><td> Agilité (réflexe de redressement) </td><td> Pup inverse immédiatement sur le placement en arrière </td><td> Difficulté à inverser placement vers l&#39;arrière (&gt; 3 sec) ou ne peut pas atteindre </td></tr><tr><td> Une légère pression sur l&#39;abdomen </td><td> Pas de son </td><td> Son agitation </td></tr><tr><td> Estomac ligne / de lait </td><td> Visible et blanc </td><td> Non visible </td></tr><tr><td> Température </td><td> Chaud </td><td> Relativement froid * </td></tr><tr><td> Poids </td><td> Gain de 1,5-2 g par jour </td><td> Pas de prise de poids ou perte de poids </td></tr><tr><td> Comportement lorsqu&#39;il est placé dans une cage </td><td> L&#39;évolution vers la mère et commence feeding </td><td> Impossible de déplacer vers la mère et montre la difficulté à téter </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Sept points système de notation: Les trois premiers scores énumérés sont généralement les premiers signes observés. * Les nouveau-nés atteints d&#39;une infection systémique expérience élevé la température du corps (&gt; 2 ° C). Cependant, en raison du manque de souplesse des animaux pour atteindre leur mère à maintenir la température du corps, les animaux malades peuvent être séparés de la litière et sentir le froid de la main nue.

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Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Ici, un procédé est décrit pour la mise en place d&#39;une infection systémique chez le rat nouveau-né avec des cultures d&#39;Escherichia coli K1. Cette procédure non invasive permettant la colonisation du tractus gastro-intestinal, de la translocation de l&#39;agent pathogène dans la circulation systémique, et l&#39;invasion du système nerveux central chez le plexus choroïde.

Modèle non-invasive de neuropathogènes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Maladies infectieuses chez le rat nouveau-né

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

non-invasive-model-neuropathogenic-escherichia-coli-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

10.8K vues.  University College London.  Ici, un procédé est décrit pour la mise en place d'une infection systémique chez le rat nouveau-né avec des cultures d'Escherichia coli K1. Cette procédure non invasive permettant la colonisation du tractus gastro-intestinal, de la translocation de l'agent pathogène dans la circulation systémique, et l'invasion du système nerveux central chez le plexus choroïde. 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Recherche

Immunologie et infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

L&#39;imagerie non invasive de la candidose disséminée chez les larves poisson zèbre

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasive d&#39;imagerie optique du système vasculaire lymphatique d&#39;une souris

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. pylori-induced gastric inflammation by activating several innate leukocytes including neutrophils, monocytes, and mast cells. The immunogenic and immunomodulatory properties of HP-NAP make it a potential diagnostic and vaccine candidate for H. pylori and a new drug candidate for cancer therapy. In order to obtain substantial quantities of purified HP-NAP used for its clinical applications, an efficient method to purify this protein with high yield and purity needs to be established.
In this protocol, we have described a method for one-step negative chromatographic purification of recombinant HP-NAP overexpressed in Escherichia coli (E. coli) by using diethylaminoethyl (DEAE) ion-exchange resins (e.g., Sephadex) in batch mode. Recombinant HP-NAP constitutes nearly 70% of the total protein in E. coli and is almost fully recovered in the soluble fraction upon cell lysis at pH 9.0. Under the optimal condition at pH 8.0, the majority of HP-NAP is recovered in the unbound fraction while the endogenous proteins from E. coli are efficiently removed by the resin.
This purification method using negative mode batch chromatography with DEAE ion-exchange resins yields functional HP-NAP from E. coli in its native form with high yield and purity. The purified HP-NAP could be further utilized for the prevention, treatment, and prognosis of H. pylori-associated diseases as well as cancer therapy.

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

A high yield method for one-step negative purification of recombinant Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) overexpressed in Escherichia coli by using diethylaminoethyl resins in batch mode is described. HP-NAP purified by this method is beneficial for the development of vaccines, drugs, or diagnostics for H. pylori-associated diseases.

Une étape négative de purification chromatographique<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En mode batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...