Nous sommes reconnaissants à Michael Feiss et Jean Sippy pour l&#39;orientation sur la création et la purification de phages. Nous remercions Michael Elowitz pour fournir le logiciel de reconnaissance cellulaire, Schnitzcell. Travail dans le laboratoire Golding est pris en charge par des subventions du National Institutes of Health (R01GM082837), la National Science Foundation (082.265, PFC: Centre de physique des cellules vivantes), la Fondation Welch (Grant Q-1759) et Human Frontier Science Programme (RGY 70/2008).

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Souches bactériennes, plasmides et de phages: Souche LE392 est supF. Il a été choisi de supprimer la mutation Sam7 dans le génome du phage (voir le tableau 1 pour plus de détails). Ainsi, lysogènes induits finira lyser et libérer des particules de phages, comme les cellules infectées volonté qui ont choisi la voie lytique. Lysogènes cellules sont cultivées à 30 ° C en raison de la présence de la température cI 857 sensible allèle dans le génome du phage. Après l&#39;induction de chaleur, Gpd-EYFP et de type sauvage Gpd sont co-exprimés à partir du génome de λ LZ1 et le plasmide pPlate * D respectivement. En conséquence, la capside du phage nouvellement créé LZ2 λ contient un mélange de Gpd-EYFP et protéines GPD. Ce phage mosaïque est structurellement stable et suffisamment pour permettre la détection fluorescente de phages individuels 5. pP RE - mCherry est un plasmide rapporteur utilisé pour détecter choix de la pathwa lysogèney. Le promoteur P RE est activée par CII lors de l&#39;établissement de la lysogénie 1,11. pP RE - mCherry 5 a été dérivé de pE-gfp 11 par le remplacement gfp avec mCherry 12. Pour plus de détails, voir nos travaux antérieurs 5. Paramètres Condition de croissance: Pendant l&#39;induction lysogène (section 1), tremblements légers à 180 rpm donne un rendement bon virus 13. L&#39;utilisation de glucose dans le milieu de croissance doit être évitée car le métabolisme du glucose génère acides produits métaboliques, et les particules lambda matures sont instables à pH acide 13. L&#39;addition de MgSO 4 vise à stabiliser la capside de phage 3. Pour phages porteurs de type sauvage cI (au lieu de cI 857), le lysogène peut être induite en utilisant le C altération de l&#39;ADN mitomycine agent 3. À l&#39;étape 1.3, l&#39;incubation à 37 ° C ne devrait normalement pas dépasser 90 minutes. Il est usef<html> ul pour vérifier la densité cellulaire par DO 600 toutes les 30 min. Pour un bon lysat, DO 600 tombe à environ 0,2 ou moins, et le reste de OD 600 est le résultat de débris cellulaires. Incubation trop long peut entraîner une baisse du rendement depuis le phage phage nouvellement créée peut commencer à injecter leur ADN dans les débris cellulaires. Pour obtenir une bande de phage visible (au moins 1 x 10 11 particules de phages) aux étapes 2.11 et 2.13, croître d&#39;au moins 500 ml de culture à l&#39;étape 1.2. L&#39;ajout de 0,2% de maltose dans le milieu de croissance dans les étapes 5.1 et 5.2 vise à induire l&#39;expression de l&#39;agneau, le récepteur de phage lambda adsorption 3,14. La dilution de 1000 fois au lieu de 100 fois dans l&#39;étape 5.2 vise à réduire le niveau de fond mCherry du journaliste pP RE plasmide - mCherry. À l&#39;étape d&#39;injection de 5,5 pour déclencher l&#39;ADN du phage, 35 ° C est choisie pour éviter l&#39;induction de l&#39;allèle sensible à la température cI857. Purification phage: jove_content &quot;&gt; Les étapes de purification de phages (étapes 2.1 à 2.11) peut être remplacé par d&#39;autres protocoles de purification 5, mais l&#39;ultracentrifugation finale par gradient de CsCl équilibre (étapes 2.12 et 2.13) est inévitable. rotors à godets oscillants sont nécessaires aux étapes 2.10 et 2.12 à assurer pointus bandes de phages visibles. Obtention d&#39;un stock de phages pur peut facilement prendre jusqu&#39;à une semaine, il est donc nécessaire de vérifier le titre du phage en cours de route pour s&#39;assurer que rien se passe mal pendant les étapes intermédiaires. Manipulation phage: Pendant toutes les procédures de purification dans la section 2, il est essentiel de traiter le lysat de phage doucement pour éviter le cisaillement des queues des têtes de phages phages. Au cours de l&#39;infection des cellules dans la section 5 (par exemple, les étapes 5.5 à 5.7), il est également essentiel pour éviter le cisaillement des particules de phage de la cellule infectée. Notez que si le phage est cisaillé à partir de la cellule infectée après l&#39;injection de l&#39;ADN, le résultat est un &quot;sombre&quot; infection, à savoir l&#39;enfection résultat sera observé dans l&#39;expérience, mais le phage infectant le seront pas. Pour minimiser ces problèmes, nous utilisons un embout de pipette large lors de la manipulation ou le mélange des phages phages / cellules. DAPI essai: La coloration du stock de phages avec du DAPI (section 4) est une méthode rapide et efficace pour vérifier la pureté du stock de phage. Il peut également être utilisé pour tester une possible dégradation d&#39;un stock de phages existant au fil du temps. Pour une pure souche, la co-localisation des signaux YFP et DAPI au microscope à fluorescence devrait être proche de 100%. On observe généralement que moins de 1% des spots YFP ne contiennent DAPI (représentant capsides, sans le génome viral), ce qui indique que ces particules n&#39;ont pas réussi à emballer l&#39;ADN viral, ou déjà injecté leur ADN ailleurs. Moins de 1% des spots ne contiennent DAPI YFP (correspondant à la non-fluorescents phages). Si ce n&#39;est pas le cas, les étapes 2,12 par 2,14 besoin d&#39;être répété dans oOMMANDE à purifier à nouveau. En ce qui concerne les paramètres d&#39;imagerie, la configuration de microscope à l&#39;étape 4.3 est pas aussi critique que dans la section 5, car aucun long terme imagerie des cellules vivantes est nécessaire ici. Toutefois, en gardant les paramètres de microscopie mêmes que dans la section 5 est utile si l&#39;on souhaite calibrer l&#39;intensité de fluorescence d&#39;une seule particule de phage. Si la dalle de PBS-agarose n&#39;est pas très propre, ou trop DAPI colorant est utilisé, quelques taches DAPI correspondant à l&#39;ADN de phage peuvent être entourés d&#39;un «halo». Si trop peu de colorant DAPI est utilisé, le signal provenant du canal DAPI peut être très faible. Système de microscope: Pour l&#39;imagerie dans la section 6, nous utilisons un microscope à épifluorescence commerciale inversée (Eclipse TE2000-E, Nikon) avec un objectif 100x (Plan Fluo, ouverture numérique de 1,40, immersion dans l&#39;huile) et standards des jeux de filtres (Nikon). La source lumineuse est une lampe à fluorescence avec Arc de commande de l&#39;intensité lumineuse. Les fonctions suivantes sont contrôlés par ordinateur: x, y et z potion; champ clair et volets fluorescence et de fluorescence choix de filtre. Une fonction d&#39;auto-focus est nécessaire. Dans le cas contraire, l&#39;accent peut facilement dériver pendant le film time-lapse (normalement 4 heures). La capacité d&#39;acquérir de multiples positions (x, y) à chaque point est utile, car elle permet de suivre l&#39;actualité des infections multiples en parallèle. En général, nous acquérir 8 positions de scène dans chaque film, à la suite jusqu&#39;à 100 événements d&#39;infection. La caméra que nous utilisons est une solution refroidie 512x512 CCD 16x16 pixel appareil photo um avec une plage dynamique de 16 bits (Cascade512, Photometrics). L&#39;acquisition est réalisée à l&#39;aide du logiciel MetaMorph (Molecular Devices). Le microscope doit être placé dans une chambre à température contrôlée, en alternative, la platine du microscope doit être entourée par une chambre à température contrôlée. Acquisition d&#39;image: Pour imagerie des cellules vivantes, il est essentiel d&#39;éviter toute exposition inutile de l&#39;échantillon, ce qui pourrait conduire à la décoloration et phototoxicity. Par conséquent, il est préférable de commencer par caractériser le système pour trouver une exposition optimale de la lumière qui permet la détection de fluorescence tout en ne conduisant pas à une croissance cellulaire excessive de blanchiment ou d&#39;inhibition. Pour obtenir une bonne image de fluorescence, jouer avec l&#39;intensité lumineuse d&#39;excitation, le temps d&#39;exposition et de gain de la caméra. Dans les étapes 6.2 à 6.3, l&#39;intervalle de 10 min est choisie de cadre dans le but de réduire l&#39;exposition de la lumière. Dans chaque image, un seul de mise au point d&#39;image est nécessaire à contraste de phase (pour la reconnaissance des cellules) et les canaux fluorescents (pour déterminer le devenir des cellules). Dans le premier point de temps, cependant, de multiples z-position des images à travers le canal YFP sont nécessaires pour capturer tous les phages infectant sur la surface cellulaire. Le temps d&#39;exposition YFP dans le cadre initial peut également besoin d&#39;être supérieure à celle utilisée pour le film time-lapse dans les délais ultérieurs. Analyse d&#39;images: Très soigneusement compter les particules de phage dans la surface de la cellule à l&#39;étape 7,1. Commeindiqué ci-dessus, nous prenons une série de z-piles à travers le canal YFP à l&#39;étape 6.2. Toutefois, cela peut encore laisser des particules de phages fluorescentes out-of-focus, qui contestent le décompte. La longueur de la cellule dans le délai initial est mesuré à l&#39;aide du logiciel Metamorph. La longueur de la cellule peut également être mesurée par ImageJ ou d&#39;autres outils logiciels. En outre, une maison automatisée construite programme Matlab peut être très utile pour obtenir des informations telles que le changement de fluorescence au cours du temps le long lignées cellulaires.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Chloroforme </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> Tampon SM </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Aiguille </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Cassette de dialyse </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Lame de microscope </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-clair, tube de </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-clair, tube de </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Réfractomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Microscope à épifluorescence </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Réactifs et matériel.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

Le système comprend des bactériophages (phages) lambda et de la bactérie E. coli a longtemps servi de paradigme pour 1,2 détermination cellulaire destin. Suite à l&#39;infection simultanée de la cellule par un certain nombre de phages, l&#39;une des deux voies est choisi: lytique (virulente) ou lysogène (en sommeil) 3,4. Nous avons récemment développé une méthode de fluorescence étiquetage phages individuels, et ont été en mesure d&#39;examiner la décision après l&#39;infection en temps réel sous le microscope, au niveau des phages et les cellules individuelles 5. Nous décrivons ici la procédure complète pour réaliser les expériences d&#39;infection décrits dans nos travaux antérieurs 5. Cela comprend la création de phages fluorescentes, l&#39;infection des cellules, imagerie sous le microscope et l&#39;analyse des données. Le phage fluorescent est un «hybrides», co-exprimant les versions de type sauvage et YFP-fusion de la protéine de capside GPD. Un lysat de phage brut est d&#39;abord obtenue en induisant un lysogène de l&#39;(GPD-EYFP Enhancées Yellow Fluorescent Protein) phage, hébergeant un plasmide de type sauvage exprimant GPD. Une série d&#39;étapes de purification sont ensuite réalisée, suivie par DAPI-étiquetage et l&#39;imagerie au microscope. Ceci est fait afin de vérifier l&#39;uniformité, l&#39;efficacité empaquetage de l&#39;ADN, signal de fluorescence et de la stabilité structurelle du stock de phages. L&#39;adsorption initiale de phages à des bactéries est effectuée sur la glace, puis suivie par une courte incubation à 35 ° C pour déclencher l&#39;injection d&#39;ADN viral 6. Le phage / bactérie mélange est ensuite déplacé vers la surface d&#39;une plaque de gélose nutritive mince, recouverte d&#39;une lamelle couvre-objet imagé et sous un microscope à épifluorescence. Le processus post-infection est suivie pendant 4 heures, à 10 min d&#39;intervalle. Positions à plusieurs étages sont suivis tels que ~ 100 infections cellulaires peuvent être retrouvées dans une seule expérience. A chaque point de position et de temps, les images sont acquises dans le contraste de phase et les canaux rouge et vert fluo. L&#39;image en contraste de phase est utilisé ultérieurement pour automatiser les celreconnaissance l tandis que les canaux fluorescents sont utilisés pour caractériser l&#39;issue infection: la production de nouveaux phages fluorescent (vert), suivie par la lyse cellulaire, ou l&#39;expression de facteurs lysogénie (rouge), suivie par une croissance cellulaire a repris et la division. Les acquis time-lapse films sont traités en utilisant une combinaison de méthodes manuelles et automatisées. Les résultats d&#39;analyse de données pour l&#39;identification des paramètres des infections pour chaque événement infection (par exemple le nombre et les positions d&#39;infecter les phages) ainsi que les résultats infection (lyse / lysogénie). D&#39;autres paramètres peuvent être extraites si désiré.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d&#39;une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l&#39;infection des<em&gt; E. coli</em&gt; Les bactéries, à l&#39;issue infection sous le microscope et l&#39;analyse des résultats d&#39;infection.

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.0K vues.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d'une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l'infection des E. coli Les bactéries, à l'issue infection sous le microscope et l'analyse des résultats d'infection.