Les auteurs tiennent à souligner l&#39;appui par le &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette» pour l&#39;élevage. Ce travail a été soutenu par des fonds de l&#39;ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 et ANR-11-JSV2-002-01) à Michael Schubert, par la subvention de l&#39;Union européenne FP6 &quot;Embryomics» et par la subvention de l&#39;ANR &quot;ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process &quot;à Jean-François Nicolas et Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho est financé par une bourse de doctorat FCT (SFRH / BD / 86878/2012). Les demandes pour les vecteurs décrits ici peuvent être adressées directement aux auteurs.

1. Préparation des instruments et réactifs <ol style="margin-left: 40px;"><li> Transfert pipettes Pasteur <ol><li> Générer une série de pipettes transfert de Pasteur avec différents diamètres de pointe en tirant de longues pipettes Pasteur 230 mm dessus d&#39;une flamme à des vitesses différentes. Assurez-vous que le cône est aussi longtemps que possible pour le contrôle lisse et fine d&#39;aspiration. </li><li> Avec une pointe en diamant, rayer la pipette le long d&#39;une ligne perpendiculaire à la longueur de la pipette. Avec les deux mains, tirez la pipette parallèlement à sa longueur pour générer une coupe au carré. Rapidement flamme polish la pipette sans se sceller la pointe. </li><li> Varier le diamètre de la pointe avec le stade des ovocytes / embryons à pipette: 300-400 um pour les ovocytes non fécondés (environ 150 m de diamètre), 600 um pour les œufs fécondés (environ 500 m de diamètre), 200 à 400 um pour neurulas hachurée. Utilisez pipettes avec un tube d&#39;aspiration bouche-surveillé de transférer les ovocytes / embryons d&#39;un platà l&#39;autre. </li></ol></li><li> Les aiguilles d&#39;injection <ol><li> Manipuler les capillaires avec des gants pour assurer des conditions RNase-free. Utilisez le verre borosilicate avec des capillaires à incandescence avec des dimensions de 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, longueur 10 mm. </li><li> Si capillaires sont tirés sur le type de chauffage à filament aiguille extracteur décrit dans la liste des matières, utilisez les paramètres suivants: chaleur 600, Pull 50, Velocity 80, Temps 60, 200 ou 300. Pression Sinon, se assurer que la forme, qui est crucial pour injections réussies, est comme le montre la figure 2 avec les propriétés suivantes: 4-8 pm de diamètre de pointe extérieure, 2 cm de longueur conique. NOTE: Aiguilles peut être tiré avant la saison de frai et utilisé pendant toute la saison. </li></ol></li><li> Solution rouge de phénol boursier 5% (4x) <ol><li> Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai. </li><li> Dans un tube de 0,22 um-filtration, peser 25 mg de phénol poudre rouge. </li><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;eau DNase et RNase àle tube contenant la poudre. </li><li> Spin pendant 3-5 min à 18 000 xg à température ambiante pour filtrer stériliser la solution et enlever les cristaux qui pourraient obstruer l&#39;aiguille d&#39;injection. </li><li> Conserver à 4 ° C ou stocker des aliquotes de 250 ul à -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg de solution de poly-lysine / ml <ol><li> Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai. </li><li> Dissoudre 5 mg de poly-L-lysine dans 20 ml d&#39;eau distillée. Magasin aliquotes de 5 ml à -20 ° C. </li><li> Utiliser un aliquot décongelé immédiatement et une seule fois pour assurer une adhérence robuste et reproductible des ovocytes à l&#39;antenne poly-lysine. </li></ol></li><li> la synthèse d&#39;ARNm <ol><li> Préparer une solution fraîche avant chaque saison de frai. </li><li> Linéariser 5 ug d&#39;ADN d&#39;intérêt avec l&#39;enzyme appropriée (généralement pendant 2 heures, à 37 ° C). Pour vérifier l&#39;exhaustivité de la digestion, de fonctionner de 2% en volume du mélange de digestion sur un gel agarose-TBE 1% dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min. </li><li> Extraire la lineaADN risé avec 25: 24: 1 de phénol (pH 8,0): chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifugeuse 10 min à 18 000 xg et récupérer la phase aqueuse (supérieure). </li><li> Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse. </li><li> Précipiter l&#39;ADN linéarisé avec 100: 10: 300 ADN linéarisé: 3 M d&#39;acétate de sodium (pH 5,2): 100% d&#39;éthanol pendant une nuit à -20 ° C. </li><li> Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez sécher et remettre en suspension dans l&#39;eau sans RNase à une concentration finale de 0,5 ug / ul. </li><li> On transcrit 1 ug d&#39;ADN linéarisé en utilisant un kit de synthèse d&#39;ARNm avec la polymerase appropriée, selon les instructions du fabricant. </li><li> Extraire l&#39;ARNm de 5: 1 de phénol (pH 4,7): une solution d&#39;arrêt de chloroforme et d&#39;acétate d&#39;ammonium fourni avec le kit. </li><li> Vortex pendant 20 secondes, CEntrifuge 10 min à 18 000 xg et recueillir la phase aqueuse. </li><li> Extraire de nouveau la phase aqueuse avec 24: 1 de chloroforme: alcool isoamylique. Vortex pendant 20 secondes, centrifuger 10 min à 18000 xg et recueillir la phase aqueuse. </li><li> Précipiter l&#39;ARNm avec 100% d&#39;isopropanol pendant la nuit à -20 ° C. </li><li> Centrifugeuse 20 min à 18 000 g à 4 ° C. Rincer à 80% d&#39;éthanol. </li><li> Centrifuger 10 min à 18 000 xg à 4 ° C. Laissez le culot sec à la température ambiante pendant plus de 5-10 min comme il sera alors difficile de remettre en suspension. Remettre en suspension dans l&#39;eau DNase et RNase à une concentration finale d&#39;au moins 2 pg / pl pour assurer une concentration d&#39;ARNm finale décent dans le mélange d&#39;injection. </li><li> Pour vérifier la qualité et la taille du produit de transcription, exécutez 0,5 pi de l&#39;ARNm sur un 1% agarose-TBE gel sans RNase dans un tampon TBE à 150 W pendant 20 min. Magasin 2 aliquotes à -80 ° C. </li></ol></li><li> Plats Poly-lysine REMARQUE: Poly-lysine coated plats sont utilisés pour immobiliser les ovocytes pendant l&#39;injection. <ol><li> Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), couvrir le fond de la boîte de Pétri avec 1 ml de la solution décongelée ml 0,25 mg / poly-lysine. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Pour chaque culture cellulaire boîte de Pétri de 35 mm (5 au total), transférer la solution de poly-lysine 0,25 mg / ml dans un autre 35 mm de culture cellulaire boîte de Pétri. Incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Jeter le ml solution à 0,25 mg / poly-lysine. </li><li> Que les boîtes de Pétri à sec, à l&#39;envers à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Stocker les plats de poly-lysine enveloppé dans une enveloppe en plastique à 4 ° C pour éviter la contamination pour une semaine maximum. </li></ol></li><li> plats d&#39;agarose revêtues NOTE: Ils sont utilisés pour la culture injecté embryons. L&#39;agarose fournit un coussin pour les embryons injectés et les empêche de coller au fond de la boîte. <ol><li> Assurez-eau de mer artificielle (ASW) en utilisant 37-38 g / L commsels erciales + 0,25 mM NaHCO 3 dans l&#39;eau d&#39;osmose inverse. </li><li> Dissoudre l&#39;agarose à une concentration de 1% à 0,22 um ASW-filtré par chauffage de la solution dans un four micro-ondes. </li><li> Rapidement verser la solution d&#39;agarose chaude d&#39;un 35 mm boîte de Petri dans l&#39;autre afin d&#39;assurer un revêtement très mince agarose du plat. </li><li> Conserver les plats d&#39;agarose revêtues enveloppés dans Saran Wrap à 4 ° C pour éviter la contamination pendant une semaine maximum. </li></ol></li><li> mélange d&#39;injection et le chargement des aiguilles d&#39;injection <ol><li> Environ 2 heures avant de commencer les injections, faire un mélange d&#39;injection en 2 ul dans RNase et de l&#39;eau DNase avec des concentrations finales de 1 à 1,8 pg / pl de l&#39;ARNm, 15% de glycérol, 1,25% de rouge de phénol. REMARQUE: Les couleurs de rouge de phénol, la solution, ce qui permet le suivi de l&#39;efficacité d&#39;injection, et l&#39;identification des embryons injectés avec succès. Glycérol favorise la diffusion de l&#39;ARNm dans le ovocyte. </li><li> Centrifugeuse 4 min à 18 000 xg pourcristaux granulés. Garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Avec une pipette 10 ul, 0,5 ul de recueillir le mélange par injection, en évitant le fond du tube, où les cristaux ont été granulés. </li><li> Remblai d&#39;au moins deux aiguilles d&#39;injection (en cas une pauses pendant l&#39;injection) par pipetage la baisse de 0,5 pi de mélange d&#39;injection à la grande ouverture de l&#39;aiguille. </li><li> Installer les aiguilles dans un récipient de stockage de liquide au fond à 4 ° C pour éviter l&#39;évaporation du mélange d&#39;injection. Laissez le mélange d&#39;injection voyager lentement à la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection pendant au moins 1 heure pour minimiser la création de bulles. </li><li> Magasin mélange d&#39;injection supplémentaire à -80 ° C pendant un maximum de trois utilisations supplémentaires, après quoi détériore la qualité de l&#39;ARNm (données non présentées). </li></ol></li></ol> 2. Collecte de matériel biologique, microinjection et culture d&#39;embryons <ol style="margin-left: 40px;"><li> collecte des ovocytes et de sperme NOTE: Voir Theodosiouet al. 12 pour un protocole détaillé pour induire la ponte et pour la collecte des gamètes. <ol><li> les mâles et les femelles de choc dans ASW à 23 ° C pendant 24 heures. </li><li> Une à deux heures avant le coucher du soleil, transférer les adultes dans des coupes individuelles en ASW à 19 ° C, car la plupart des adultes frayer 1-2 heures après le coucher du soleil. </li><li> Rincer 35 mm boîtes de Pétri dans ASW filtrée et les laisser à l&#39;envers sec pour éviter les ovocytes de coller au fond du plat. </li><li> Après la ponte, de recueillir le sperme et ovocytes immédiatement avec une pipette de 1 000 pi. <ol><li> Gardez sperme et ovocytes séparer de amphioxus adultes car le contact est nuisible pour la santé des gamètes (données non présentées). </li><li> En outre, éviter de surprendre les adultes, ce qui conduit à des mouvements qui dissipent, et donc diluer, des spermatozoïdes et ovocytes. Pour garder le sperme actif aussi longtemps que possible et d&#39;optimiser le taux de fécondation, de recueillir le sperme aussi concentré que possible. </li></ol></li><li> Gardersperme sur de la glace dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Transfert ovocytes en filtrée ASW dans les 35 mm boîtes de Pétri pré-rincé. </li><li> Transfert 100-500 ovocytes avec un précédemment tiré 300-400 um transfert pipette Pasteur à un autre 35 mm boîte de Petri pour effectuer les injections. </li><li> Engrais le reste de l&#39;embrayage en tant que témoin pour les spermatozoïdes et la qualité de l&#39;ovocyte ou pour d&#39;autres expériences. </li></ol></li><li> injection des ovocytes <ol><li> Installer l&#39;aiguille d&#39;injection sur le micromanipulateur à un angle 50 ° par rapport au plan horizontal. REMARQUE: Angles de moins de 50 ° vont pousser les ovocytes autour sur le plat, tandis que des angles de plus de 50 ° ne permettra pas un suivi approprié de la position de l&#39;aiguille par rapport à l&#39;ovocyte. </li><li> Sous un microscope à dissection fluorescent avec 25X oculaires, transférer 30 ovocytes avec le 300-400 um transfert pipette Pasteur sur un plat poly-lysine contenant filtrée ASW. </li><li> Déposez les ovocytes long d&#39;une ligne à transporterinjections sur une manière ordonnée et pour distinguer injectés à partir d&#39;ovocytes non-injecté. Injecter un petit nombre (30 ovocytes) pour réduire au minimum le temps d&#39;exposition des ovocytes à la poly-lysine, ce qui tend à déformer les embryons en développement (données non présentées). </li><li> Utiliser l&#39;éclairage à fond noir pour rendre les ovocytes translucide comme possible. </li><li> Avec le mouvement de la molette grossière micromanipulateur, amener l&#39;aiguille d&#39;injection à proximité d&#39;un ovocyte. </li><li> Avec une pince fine, ouvrir l&#39;aiguille au niveau où la pointe commence à être courbé. Par pulsation avec l&#39;injecteur, vérifier que mélange d&#39;injection est en fait rouge se écoulant hors de l&#39;aiguille. </li><li> Au grossissement de 200x et avec le mouvement bouton fine de la micromanipulateur, déplacez doucement l&#39;aiguille d&#39;injection dans le noyau de l&#39;ovocyte. NOTE: Se il est inséré trop superficielle, la solution injectée ne sera pas rester à l&#39;intérieur de l&#39;ovocyte. Se il est inséré trop loin, l&#39;ovocyte sera détruit. </li><li> Injecter avec 1-3 impulsions de 120 ms Durations et 1-10 psi de pression. Si l&#39;aiguille est assez fine, injecter à débit continu à pression constante. Assurez-vous que le volume d&#39;injection correspond à 1/5 à 1/3 du volume d&#39;un seul ovocyte. </li><li> Après l&#39;injection, retirez l&#39;aiguille rapidement pour éviter les fuites de l&#39;ovocyte. </li><li> Vérifiez que la solution injectée reste dans l&#39;ovocyte et qui après quelques secondes, la solution injectée se répand dans l&#39;ovocyte. </li><li> Passez à la prochaine ovocyte en ligne. </li><li> Gardez quelques embryons non-injecté de chaque série comme contrôle négatif pour estimer la fluorescence de fond lors de la numérisation pour les embryons injectés. </li></ol></li><li> La fertilisation, la sélection des embryons injectés et de la culture de l&#39;embryon <ol><li> Fécondation des ovocytes dès qu&#39;une série a été injectée. Comme la qualité des ovocytes diminue avec le temps, injecter et féconder les ovocytes dans les 1 h 12 après le frai. </li><li> Selon la concentration du sperme, ajouter 5/1 gouttes de sperme et d&#39;ovocytestourbillonner le plat. NOTE: L&#39;enveloppe de fertilisation devrait être apparent sur les embryons après environ 1 min. </li><li> Autoriser les embryons se détacher de l&#39;antenne poly-lysine, tout en injectant une autre série d&#39;ovocytes. </li><li> Transférer les embryons avec le 600 um transfert pipette Pasteur dans une boîte de Pétri agarose revêtues. Retirez les embryons de le plat poly-lysine dès que possible, si possible avant le stade 2 cellules. NOTE: En cas d&#39;exposition prolongée à la poly-lysine, les embryons ont tendance à devenir blastulas densément-emballés, aplati sur le côté touchant le fond du plat. </li><li> Au stade 2 cellules à 4 cellules, sélectionnez avec une portée de dissection fluorescente avec filtre DSR les embryons succès injectées, ce est à dire, ceux qui ont une morphologie normale qui présentent un signal rouge fluorescent rouge de phénol dérivés. </li><li> Garder les embryons en culture in filtrée ASW en boîtes de Pétri agarose revêtu à 19 ° C jusqu&#39;à ce que la scène souhaitée pourdans l&#39;imagerie in vivo. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dans cet article, nous présentons, pour la première fois, un protocole détaillé et reproductible pour l&#39;injection de B. ovocytes lanceolatum, qui, après B. floridae 13,14 et B. belcheri 15, est donc la troisième espèce de amphioxus, pour lesquels une telle technique a été décrite. Fait important, le protocole décrit ici comprend également la description des systèmes de vecteurs adaptés pour la production de protéines fluorescentes dans B. l...

Pendant le développement, une seule cellule donne naissance à un organisme entier dans un processus très complexe qui implique les deux divisions et les mouvements cellulaires. Pour mieux comprendre les principes biologiques sous-jacents la dynamique du comportement cellulaire, biologie du développement ont commencé à utiliser des techniques d&#39;imagerie in vivo par fluorescence. Compartiments spécifiques des cellules, telles que les membranes cellulaires, peuvent soit être marquées par des traitements avec des colorants fluorescents, une approche entravée par le manque de spécificité et de la pénétration du tissu 1, ou par l&#39;introduction spécifique dans l&#39;embryon d&#39;ARNm exogène codant pour les protéines fluorescentes deux. Différentes techniques peuvent être utilisées pour la prestation efficace de composés exogènes, tels que les ARNm. Ceux-ci comprennent, mais ne sont pas limités à, la micro-injection, l&#39;électroporation, le bombardement avec des microparticules, la lipofection et 3,4 transduction. Bien que toutes ces approches peut être utilisé pour introduire des composés exogènes dans unle développement embryonnaire, la micro-injection ne permet l&#39;application de quantités prédéfinies et précis dans chaque cellule 3. techniques de microinjection ont été décrits pour tous les principaux systèmes de modèle de développement 4 (par exemple, les mouches des fruits, des vers nématodes, de poisson zèbre, grenouilles, souris) ainsi que pour certains autres modèles 4, y compris ceux utilisés pour des études comparatives visant à comprendre l&#39;évolution des mécanismes de développement (par exemple, les anémones de mer, vers annélides, les oursins, tuniciers d&#39;ascidies, l&#39;amphioxus de céphalochordé). Céphalochordés, qui, avec les tuniciers et les vertébrés établissent le phylum des chordés, sont particulièrement bien adaptés modèles pour étudier l&#39;évolution des chordés et la diversification des vertébrés d&#39;un ancêtre invertébrés 5-8. La lignée de céphalochordé divergé très tôt pendant l&#39;évolution des chordés; et céphalochordés existantes, qui sont subdivisés en trois genres (Branchiostoma, Asymmetron et Epigonichthys), ressemblent vertébrés à la fois en termes d&#39;anatomie et de l&#39;architecture globale du génome 5-8. Sur les 30 espèces de céphalochordés qui ont été décrites à ce jour, cinq sont disponibles pour des études embryologiques et de développement 6,9: Asymmetron lucayanum (le lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (le amphioxus Floride), Branchiostoma lanceolatum (l&#39;amphioxus européenne), Branchiostoma belcheri (le amphioxus chinoise) et Branchiostoma japonicum (le amphioxus japonais). Adultes mûrs de trois de ces espèces (B. lanceolatum, B. belcheri et B. japonicum) peuvent être induits à pondre à la demande au cours de la saison de reproduction 10,11. En outre, au moins pour B. lanceolatum, frai efficace peut aussi être induite dans l&#39;eau de mer artificielle 12, ce qui rend cette espèce de céphalochordé particuliers accessible pour laborators qui ne ont pas accès à l&#39;eau de mer naturelle. La combinaison, dans B. lanceolatum, d&#39;un accès pratique et fiable pour les embryons avec une méthode de livraison efficace, tels que la micro-injection, jusqu&#39;à présent, la seule technique de livraison développé en amphioxus (à la fois B. et B. floridae belcheri) 13-15, va permettre le développement d&#39;un nouvelle gamme de techniques de manipulation, y compris la lignée tracing- et les approches de comportement de cellules dynamique. Un protocole pour la micro-injection d&#39;ARNm efficace pour exprimer des protéines fluorescentes dans le B. lanceolatum embryon a donc été développé. En outre, de fournir un ensemble d&#39;outils de base pour l&#39;imagerie en direct de B. embryons lanceolatum, systèmes de vecteurs ont été développés qui permettent associée à la membrane nucléaire et l&#39;expression de protéines fluorescentes. Pour le ciblage de la membrane, le renforcement de la protéine fluorescente verte (eGFP) a été fusionnée à la boîte de CAAX HRAS humaine et localisation nucléaire de mCherry et eGFP étaitobtenu par fusion à l&#39;exon poisson zèbre histone 2B (H2B) (figure 1, fichier supplémentaire 1). En outre, dans le but d&#39;optimiser la traduction des protéines, des séquences de Kozak et des codons des constructions ont été modifiées et adaptées à l&#39;utilisation dans B. lanceolatum. Pris ensemble, la méthode d&#39;injection et des vecteurs d&#39;expression présentés ici serviront de base pour la génération de nouvelles approches expérimentales pour céphalochordés, notamment en utilisant les analyses par fluorescence les dernières techniques d&#39;imagerie in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Le protocole détaillé ci-dessus constitue la base de la micro-injection de B. ovocytes lanceolatum et donc pour l&#39;introduction dans le développement B. embryons de lanceolatum d&#39;ARNm codant pour des protéines fluorescentes pour l&#39;imagerie in vivo. Bien que la technique est certainement robuste et fiable, le taux d&#39;injections réussies utilisant ce protocole reste variable (tableau 1). L&#39;explication très probable pour ce fait intriguan...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Nous rapportons ici l&#39;expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l&#39;injection d&#39;ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l&#39;imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes.

L&#39;expression de protéines fluorescentes en<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Par injection dans l&#39;ARNm non fécondés ovocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K vues.  Institut Pasteur.  Nous rapportons ici l'expression robuste et efficace de protéines fluorescentes après l'injection d'ARNm dans des ovocytes non fécondés de Branchiostoma lanceolatum. Le développement de la technique de micro-injection dans ce chordés basale ouvrira la voie à grande portée des innovations techniques dans ce système de modèle émergent, y compris l'imagerie in vivo et les manipulations spécifiques de gènes. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Recherche

Biologie du développement

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Transfert de gènes dans l&#39;organe de poulet Auditory par<em&gt; Dans Ovo</em&gt; Micro-électroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluorescence étiquetage des Microtubules et des centrosomes protéines dans les tissus intestinaux Ex Vivo et 3D In Vitro intestinale organoïdes

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Immunolocalisation fluorescente des protéines arabinogalactan et des pectines dans la paroi cellulaire des tissus végétaux

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Séparation des cellules folliculaires et des ovocytes dans les follicules ovariens du poisson zèbre

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...