Yazarlar hayvancılık için &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; tarafından destek kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programı hibe &quot;Embryomics&quot; tarafından ve ANR hibe &quot;tarafından, Michael Schubert ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 ve ANR-11-JSV2-002-01) fonları tarafından desteklenen ANR- Jean-François Nicolas ve Nadine Peyriéras 10-BLAN-121.801 Dev-Süreci &quot;. João Emanuel Carvalho bir FCT doktora bursu ile finanse edilmektedir (SFRH / BD / 86878/2012). Burada anlatılan vektörler talepleri yazarlara doğrudan ele alınabilir.

Araçların ve Reaktifler 1. Hazırlık <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pasteur pipet aktarın <ol><li> Farklı hızlarda bir alev üzerinde 230 mm uzunluğunda Pasteur pipetler çekerek, farklı uç çapları transfer Pasteur pipetler bir dizi oluşturun. Konik aspirasyon düzgün ve ince kontrolü için mümkün olduğunca uzun olduğundan emin olun. </li><li> Bir elmas çizici ile, dik pipet uzunluğu bir hat boyunca pipet çizmeyin. Her iki elinizle, künt kesim oluşturmak için kendi uzunluğuna pipet paralel çekin. Hızla alev lehçe ucu sızdırmazlık olmadan pipet. </li><li> , 200-400 mikron (mikron çapında 500 civarında) döllenmiş yumurta, 600 mikron döllenmemiş oosit için 300-400 mikron (çapı 150 mikron civarında): oosit / embriyo aşamasında olan ucunun çapı pipetle için Vary taranmış neurulae için. Ağız-izlenen aspirasyon tüpü ile kullanın pipetler bir çanak oosit / embriyo transferbaşka. </li></ol></li><li> Enjeksiyon iğneleri <ol><li> RNaz ücretsiz koşulları sağlamak için eldiven ile kılcal işleyin. OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, uzunluğu 10 mm boyutlarında olan Filament kılcal ile borosilikat camını kullanın. </li><li> Kılcal damarlar Malzeme Listesi&#39;nde tanımlanan ısıtma telli iğne çektirmenin türüne çekti, aşağıdaki ayarları kullanın: Isı 600, Velocity 80, Zaman 60, Basınç 200 veya 300. Aksi takdirde 50 çekin, şekil, hangi sağlamak Başarılı enjeksiyonlar için önemli, aşağıdaki özelliklere sahip olan, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, 4-8 um dış uç çapı 2 cm konik uzunluğu. NOT: İğneler yumurtlama sezonu öncesi çekti ve sezon boyunca kullanılır. </li></ol></li><li> % 5 Fenol Kırmızısı stok çözeltisi (4x) <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> 0.22 mikron filtre tüpünde, fenol kırmızı bir toz halinde 25 mg tartılır. </li><li> Için DNase- ve RNaz içermeyen su, 0.5 ml ilave ediliriçeren toz tüpü. </li><li> Çözelti filtre-sterilize ve enjeksiyon iğnesi tıkayabilecek kristallerin uzaklaştırılması için, oda sıcaklığında 18,000 x g&#39;de 3-5 dakika boyunca dönerler. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın veya -20 ° C&#39;de 250 ul alikotları saklayın. </li></ol></li><li> / Ml poli-lizin çözeltisi, 0.25 mg <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> Damıtılmış su, 20 ml poli-L-lisin, 5 mg eritin. -20 ° C&#39;de, 5 ml lik bir kısmı. </li><li> Poli-lisin-kaplanmış çanak oositlerin tekrarlanabilir ve sağlam yapışmasını sağlamak için sadece bir kez hemen çözülmüş kısım kullanın. </li></ol></li><li> mRNA sentezini <ol><li> Her yumurtlama sezonu öncesinde taze hazırlayın. </li><li> (37 ° C&#39;de, genellikle 2 saat süre ile,) uygun enzim ile ilgili DNA&#39;nın 5 ug linearize. Sindirim eksiksiz olduğunu kontrol etmek için, 20 dakika boyunca 150 W TBE tampon maddesi içinde bir% 1 agaroz TBE jeli üzerinde sindirim karışımı hacminin% 2 çalıştırın. </li><li> Linea Özü24: 1 fenol (pH 8.0): kloroform: 25 rized DNA izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 18.000 xg&#39;de 10 dakika ve sulu (üst) faz toplamak için Vortex. </li><li> 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g&#39;de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex. </li><li> 10: 300 doğrusallaştırılmış DNA: 3 M sodyum asetat (pH 5.2): -20 ° C de bir gece% 100 etanol 100 ile doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın çökeltilmesi. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 20 dk. % 70 etanol içinde durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 10 dk. RNase içermeyen su içinde, kuru ve tekrar süspansiyon 0.5 ug / ml bir son konsantrasyonda olsun. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir polimeraz ile bir mRNA sentez kiti kullanılarak doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın 1 ug yazıya. </li><li> 1 fenol (pH 4,7): 5 ile mRNA Özü kiti ile sağlanan kloroform ve amonyum asetat durdurma çözüm. </li><li> 20 saniye için Vortex, centrifuge 18,000 x g&#39;de 10 dakika ve sulu faz toplanır. </li><li> 24 ile tekrar ektraktlayınız: 1 kloroform: izoamil alkol. 20 saniye, santrifüj 10 18.000 x g&#39;de dakika ve sulu faz toplamak için Vortex. </li><li> Gece boyunca -20 ° C de, 100% izopropanol ile mRNA çökeltilmesi. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 20 dk. % 80 etanol içinde durulayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 18,000 x g&#39;de santrifüj 10 dk. Daha sonra tekrar askıda bırakılması zordur olacak gibi daha uzun bir süre, 5-10 dakika için oda sıcaklığında pelet kurumaya bırakın. En az 2 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar DNase- ve RNase-barındırmayan su içinde yeniden süspanse enjeksiyon karışımı içinde iyi bir son mRNA konsantrasyonunu sağlamak. </li><li> Transkripsiyon ürünün kalitesini ve boyutunu kontrol 20 dakika boyunca 150 W TBE tamponu bir RNaz ücretsiz% 1 agaroz-TBE jel üzerinde mRNA 0.5 ul çalıştırmak için. Mağaza -80 ° C &#39;de 2 ul alikotları. </li></ol></li><li> Poli-lizin kaplı tabaklar NOT: Poly-lizin coaTed yemekler enjeksiyon sırasında oosit hareketsiz hale getirmek için kullanılır. <ol><li> Her 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5) için, buzu çözülmüş 0.25 mg / ml poli-lisin çözeltisinin, 1 ml Petri kabı alt kapağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Her 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı (toplam 5), başka bir 35 mm&#39;lik hücre kültürü Petri çanağı içine 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi aktarın. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 0.25 mg / ml poli-lizin çözeltisi atın. </li><li> 2 saat süre ile, oda ısısında petri kaplarında kuru ters olsun. </li><li> Bir hafta maksimum kirlenmeyi önlemek için 4 ° C&#39;da bir plastik sargı sarılmış poli-lisin-kaplanmış yemekler saklayın. </li></ol></li><li> Agaroz kaplı yemekler NOT: Bu kültür enjekte edilen embriyolar için kullanılır. Agaroz enjekte edilen embriyolar için bir yastık sağlayan ve çanak dibine yapışmasını engeller. <ol><li> Yapay deniz suyu (ABY) 37-38 g / L comm kullanarak olunters ozmoz su içerisinde ercial tuzları + 0.25 mM NaHCO 3. </li><li> Bir mikrodalga fırında çözelti ısıtılarak 0.22 um filtreden ASW agaroz bir% 1 konsantrasyona çözülür. </li><li> Hızla çanak çok ince agaroz kaplama sağlamak amacıyla başka biri ile bir 35 mm Petri kabı, sıcak agaroz dökün. </li><li> Saran sarılmış agaroz kaplı yemekler bir hafta maksimum kirlenmesini önlemek için 4 ° C&#39;de sarın saklayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon iğne enjeksiyonu karışımı ve yükleme <ol><li> Yaklaşık 2 saat enjeksiyonları başlamadan önce, 1-1,8 mRNA ug / ul,% 15 gliserol,% 1.25 Fenol Red nihai konsantrasyonları ile 2 ul enjeksiyon RNase- içinde karışımı ve DNaz-ücretsiz su yapmak. NOT: Fenol Kırmızı renk enjeksiyon verimlilik ve başarıyla enjekte edilen embriyoların belirlenmesi izlenmesine olanak sağlar çözümü. Gliserol oosit içinde mRNA difüzyon yanadır. </li><li> Santrifüj 4 dk 18.000 xg&#39;dePelet kristaller. Buz üzerinde kullanıma kadar muhafaza edin. </li><li> 10 ul pipet ile, kristaller, topak haline edilmiş boru, alt kaçınarak enjeksiyon karışımı 0.5 ul toplar. </li><li> İğnenin büyük açılışında enjeksiyon karışımı 0.5 ul damla pipetleme (durumunda enjeksiyon sırasında bir tatili) en az iki enjeksiyon iğneleri dolduramaz. </li><li> Enjeksiyon karışımı buharlaşmasını önlemek için 4 ° C&#39;de altındaki sıvı bir depo kabı iğneler takın. Enjeksiyon karışımı yavaş yavaş kabarcıklar oluşumunu en aza indirmek için, en az 1 saat süre ile enjeksiyon iğnesinin ucunun tümünü olsun. </li><li> MRNA kalitesi bozulur, bundan sonra, üç ek kullanımları, en fazla -80 ° C&#39;de saklayın, ek enjeksiyon karışımı (veriler gösterilmemiştir). </li></ol></li></ol> Biyolojik Malzeme, Mikroenjeksiyon ve Embriyo Kültürü 2. Koleksiyonu <ol style="margin-left: 40px;"><li> Yumurta ve sperm toplama NOT: Theodosiou görünve ark. yumurtlama uyaran ve gamet toplama için ayrıntılı bir protokol için 12. <ol><li> 24 saat süre ile, 23 ° C&#39;de ASW Şok erkek ve dişi. </li><li> Çoğu yetişkin gün batımından sonra 1-2 saat doğacaktır, çünkü gün batımından önce bir iki saat, 19 ° C&#39;de ASW bireysel bardak içine yetişkin aktarın. </li><li> Filtrelenmiş ASW&#39;nin 35 mm Petri kapları durulayın ve onlara çanak dibine yapışmasını önlemek oosit kuru ters-üzdüm. </li><li> Yumurtlama üzerine, derhal 1.000 ul pipet ile sperm ve oosit toplamak. <ol><li> Sperm tutun ve iletişim gamet sağlığı için zararlı olduğu için oosit yetişkin amphioxus ayrı (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Dahası, sperm ve oosit hem dağılımı hareketlere neden olur, bu yetişkin şaşırtıcı önlemek ve dolayısıyla seyreltin. Mümkün olduğunca uzun süre aktif sperm tutmak için ve döllenme oranını optimize mümkün olduğunca konsantre olarak sperm toplamak için. </li></ol></li><li> Tutmak1.5 ml tüp buz üzerinde sperm. </li><li> Önceden durulanmış, 35 mm Petri kutularına süzüldü ASW oosit aktarın. </li><li> Transferi 100-500 enjeksiyonları gerçekleştirmek için başka bir 35 mm&#39;lik Petri kabı önceden çekti 300-400 mikron transferi Pasteur pipeti ile oocytes. </li><li> Sperm ve oosit kalitesi için ya da diğer deney için bir kontrol olarak kavramanın kalan döller. </li></ol></li><li> Oosit enjeksiyonu <ol><li> Yatay düzleme 50 ° açıyla mikromanipülatör enjeksiyon iğnesi takın. NOT: Birden fazla 50 ° açıları oosit iğne pozisyonda uygun bir izleme izin vermez iken daha az 50 ° açıları, çanak etrafında oosit itecektir. </li><li> 25X oküler floresan kesme kapsamında, süzüldü ASW içeren bir poli-lisin-kaplanmış tabağına 300-400 um aktarım Pasteur pipeti ile 30 oosit aktarın. </li><li> Taşımak için bir hat boyunca oosit yatırındüzenli bir şekilde ve üzerinden enjeksiyonu olmayan enjekte edilmiş oositlerde enjekte ayırt etmek üzere. Gelişmekte olan embriyolar deforme eğiliminde poli-lisin, oositlerin maruz kalma süresini en aza indirmek için çok az sayıda (30 oosit) enjekte edilir (veriler gösterilmemiştir). </li><li> Mümkün olduğunca saydam olarak oosit işlemek için karanlık alan aydınlatma kullanın. </li><li> Mikromanipülatör kaba hareket topuzu, bir oosit yakın enjeksiyon iğnesi getirmek. </li><li> Ince forseps ile ucu kavisli olması başlar düzeyde iğne açmak kesti. Enjektör ile darbe olarak, kırmızı enjeksiyon karışımı aslında iğnenin dışarı akan doğrulayın. </li><li> 200X büyütmede ve mikromanipülatör ince hareketi topuzu, hafifçe oosit çekirdek içinde bir iğne hareket. NOT: Çok yüzeysel takılırsa, enjekte çözüm oosit içinde kalmayacak. Çok takılırsa, oosit yok edilecek. </li><li> 120 msn Durat 1-3 darbeleri ile enjekteiyon ve 1-10 psi basınç. İğne yeterince iyi değilse, sabit basınçta sürekli akış ile enjekte. Enjeksiyon hacmi, tek bir oosit hacminin 1/3, 1/5 karşılık emin olun. </li><li> Enjeksiyonu takiben, oosit sızıntısını önlemek için hızla iğneyi çekin. </li><li> Enjekte çözüm oosit içinde kalır ve bir kaç saniye sonra, enjekte çözüm oosit yayılır doğrulayın. </li><li> Doğrultusunda bir sonraki oosit üzerine taşıyın. </li><li> Enjekte embriyolar için tararken arka plan floresan tahmin negatif kontrol olarak her dizinin bazı uninjected embriyolar tutun. </li></ol></li><li> Enjekte embriyolar ve embriyo kültürü Döllenme, seçim <ol><li> En kısa sürede bir dizi enjekte edildiği gibi oosit döller. Oosit kalitesi zamanla azalır gibi, enjekte ve 12 yumurtlama sonra 1 saat içinde oosit döller. </li><li> Sperm konsantrasyonu bağlı olarak, oosit sperm 1-5 damla ekleyin veçanak girdap. Not: fertilizasyon zarf hakkında 1 dk sonra embriyolar üzerine belirgin hale gelmelidir. </li><li> Oosit bir dizi enjekte edilirken, embriyolar, poli-lisin kaplı çanak ayırmak için izin verin. </li><li> Bir agaroz kaplı Petri kabı içine 600 mikron transferi Pasteur pipeti ile embriyolar transfer. Mümkünse 2 hücreli aşamada önce, eğer, en kısa sürede, poli-lisin kaplı tabak embriyolar çıkarın. Not: poli-lizin, uzun süre maruz kalması durumunda, embriyolar, çanağın tabanı dokunmadan yan düzleştirilmiş yoğun dolu blastulae, olma eğilimindedir. </li><li> 2-hücreli 4-hücreye aşamada, DSR filtreli bir floresan diseksiyon kapsamı ile seçin başarıyla enjekte embriyolar, yani, bir Fenol Kırmızı-türetilmiş kırmızı floresan sinyali sergilediği normal morfolojiye sahip olanlar. </li><li> İstenilen aşamada kadar 19 ° C&#39;de agaroz kaplı Petri kapları süzülür ASW kültür embriyolar tutunin vivo görüntüleme. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Weber, T., K&#246;ster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+tools+for+multicolor+imaging+in+zebrafish+larvae.">Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae.</a> Methods. 62, 279-291 (2013).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+the+message+clear:+visualizing+mRNA+localization.">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+as+a+tool+of+mechanical+delivery.">Microinjection as a tool of mechanical delivery.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).</li><li>Stepicheva, N. A., Song, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microinjections+of+sea+urchin+zygotes.">High throughput microinjections of sea urchin zygotes.</a> J. Vis. Exp. , e50841 (2014).</li><li>Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+and+tunicates+as+evolutionary+model+systems.">Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).</li><li>Bertrand, S., Escriva, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+amphioxus.">Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus.</a> Development. 138, 4819-4830 (2011).</li><li>Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+new+characters+after+whole+genome+duplications:+insights+from+amphioxus.">Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).</li><li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+the+tunicates.">Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates.</a> Development. 138, 2143-2152 (2011).</li><li>Yu, J. K., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordates+(amphioxus+or+lancelets):+a+model+for+understanding+the+evolution+of+chordate+characters.">Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Fuentes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+spawning+behavior+and+development+of+the+European+amphioxus+(Branchiostoma+lanceolatum).">Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum).</a> J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).</li><li>Li, G., Shu, Z., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-round+reproduction+and+induced+spawning+of+Chinese+amphioxus,+Branchiostoma+belcheri,+in+laboratory.">Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory.</a> PLoS One. 8, e75461 (2013).</li><li>Theodosiou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphioxus+spawning+behavior+in+an+artificial+seawater+facility.">Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility.</a> J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).</li><li>Holland, L. Z., Yu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cephalochordate+(amphioxus)+embryos:+procurement,+culture,+and+basic+methods.">Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods.</a> Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).</li><li>Holland, L. Z., Onai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+gene+function+in+amphioxus+embryos+by+microinjection+of+mRNAs+and+morpholino+oligonucleotides.">Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides.</a> Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).</li><li>Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+microinjection+method+for+unfertilized+eggs+of+Asian+amphioxus+Branchiostoma+belcheri.">An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri.</a> Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).</li><li>Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-targeted+green+fluorescent+protein+reliably+and+uniquely+marks+cells+through+apoptotic+death.">Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death.</a> Cytometry. 43, 273-278 (2001).</li><li>Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+nuclei+in+Aspergillus+oryzae+with+EGFP+and+analysis+of+the+number+of+nuclei+in+each+conidium+by+FACS.">Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).</li><li>Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+embryos+regulate+the+nuclear+localization+of+XMyoD.">Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD.</a> Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+preferred+nucleotide+sequences+around+the+translation+initiation+codon+in+eukaryote+genomes.">Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).</li><li>Deheyn, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+green+fluorescent+protein+(GFP)+in+amphioxus.">Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus.</a> Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).</li><li>Schubert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+acts+via+Hox1+to+establish+the+posterior+limit+of+the+pharynx+in+the+chordate+amphioxus.">Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus.</a> Development. 132, 61-73 (2005).</li><li>Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu makalede, B. enjeksiyonu için, ilk kez için, ayrıntılı ve yeniden üretilebilir bir protokol mevcut lanceolatum oositleri, burada, daha sonra B floridae 13,14 ve B belcheri 15, bu nedenle bu tür bir teknik tarif edilmiş olan üçüncü Amphioxus türdür. Önemli olarak, iletişim kuralı, aynı zamanda B floresan protein üretimi için uygun vektör sistemlerinin açıklamasını içerir Burada açıklanan in vitro koşullarda üretil...

Gelişimi sırasında, tek bir hücre, hücre bölünme ve hareketleri hem de içeren oldukça karmaşık bir işlem olarak, bütün bir organizma neden olur. Iyi hücre davranış dinamiklerini yatan biyolojik prensiplerini anlamak, gelişimsel biyologlar floresan tabanlı vivo görüntüleme teknikleri kullanmaya başlamıştır. Bu tür hücre membranları gibi hücre spesifik bölmeleri, ya floresan boyalar ile muameleler ile spesifiklik eksikliği ve doku penetrasyonu 1 engellenmektedir bir yaklaşım olarak etiketlenmiş olabilir, ya da floresan proteinleri 2 kodlayan eksojen mRNA&#39;ların embriyo özgü sokulmuştur. Farklı teknikler mRNA gibi eksojen bileşikler, etkili bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. Bunlar arasında, ancak mikroenjeksiyon, elektroporasyon, mikro parçacıklar, lipofeksiyon ve transdüksiyon 3,4 ile bombardıman, bunlarla sınırlı değildir. Bu yaklaşımların her bir egzojen bileşikleri sokmak için kullanılabilir, ancakgelişmekte olan embriyo, sadece mikroenjeksiyon, her hücrede 3 içine önceden tanımlanmış ve hassas miktarlarda uygulama sağlar. Mikroenjeksiyon teknikleri tüm önemli gelişim model sistemler için de tarif edilmiştir 4 (örneğin, meyve sinekleri, nematod kurtlar, zebra balığı, kurbağa, fareler) ve gelişim mekanizmalarına evrimini anlamak amacıyla karşılaştırmalı çalışmalar için kullanılanlar dahil olmak üzere, bazı alternatif modeller 4, olduğu gibi (örneğin, deniz lalesi, halkalı solucanlar, deniz kestaneleri, ascidian gömlekliler, Kafatassızlar Amphioxus). Birlikte gömlekliler ve kordalı filumunu kurmak omurgalılar ile, özellikle çok uygun modeller sefalokordatlar, omurgalılar evrimini ve omurgasız atadan 5-8 arası omurgalıların çeşitlendirilmesi çalışma. Kafatassızlar soyu çok erken kordalı evrimi sırasında ayrılmaktadır; ve üç cins bölünmüştür kaybolmamış sefalokordatlar, (Branchiostoma, Asymmetron ve Epigonichthys), omurgalılar benzer hem genel anatomi ve genom mimarisi 5-8 açısından. Şimdiye kadar tarif edilmiş sefalokordatlar yaklaşık 30 türün, beş embriyolojik ve geliştirme çalışmaları 6,9 için kullanılabilir: Asymmetron lucayanum (Bahama lancelet) Branchiostoma floridae (Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Avrupa Amphioxus), Branchiostoma belcheri (Çin Amphioxus) ve Branchiostoma japonicum (Japon Amphioxus). Bu türlerin üç olgun yetişkin (B lanceolatum, B. belcheri ve B japonicum) isteğe bağlı üreme mevsiminde 10,11 boyunca yumurtlamaya indüklenebilir. Buna ek olarak, en az bir B. lanceolatum verimli yumurtlama böylece ayrıca LABORATOR için bu özel Kafatassızlar türleri erişilebilir hale yapay deniz suyu 12 indüklenebilirDoğal deniz suyuna erişimi olmayan ler. B. kombinasyon, lanceolatum, mikroenjeksiyon gibi etkin bir dağıtım yöntemi ile embriyo için uygun ve güvenli erişim, şimdiye kadar 13-15, (b floridae ve B belcheri hem de) amphioxus içinde gelişmiş sadece uygulama tekniği, geliştirilmesini mümkün kılmaktadır soy tracing- ve dinamik hücre davranış tabanlı yaklaşımları içeren manipülatif teknikler, yeni paketi. MRNA etkin mikroenjeksiyon için bir protokol B floresan proteinleri ifade etmek için lanceolatum embriyo dolayısıyla geliştirilmiştir. Ayrıca, B. canlı görüntüleme için bir temel araç seti temin etmek lanceolatum embriyolar, vektör sistemleri zara bağlı ve floresan proteinleri nükleer ekspresyon izin veren geliştirilmiştir. Membran hedeflemesi için, gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) mCherry ve eGFP insan HRAS CAAX kutusu ve nükleer lokalizasyon oldu erimiş olduzebra balığı histon 2B (H2B) ekson (Şekil 1, ek İçerik 1) füzyon yoluyla elde edilmiştir. Ayrıca, protein dönüşümünü optimize etmek amacı ile, konstruktların Kozak dizilerini ve kodonlar değiştirilmiş ve B kullanılmak üzere uyarlanmış lanceolatum. Birlikte ele alındığında, burada sunulan enjeksiyon yöntemi ve ifade vektörleri özellikle son vivo görüntüleme teknikleri floresan tabanlı kullanarak analizler, sefalokordatlar için yeni deneysel yaklaşımlar üretilmesi için bir temel olarak hizmet verecek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Yukarıda ayrıntılı protokol B mikroenjeksiyonu için temel sağlar lanceolatum oositler ve dolayısıyla B geliştirilmesi dahil edilmek için mRNA lanceolatum embriyolar in vivo görüntüleme için floresan proteinleri kodlayan. Tekniği kesinlikle sağlam ve güvenilir olmasına rağmen, bu protokolü kullanarak başarılı enjeksiyonları oranı değişken (Tablo 1) kalır. Bu ilginç aslında çok olası bir açıklama oosit kavramaları aşırı de?...

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes at JoVE.com

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak. 