La quantité d’informations provenant d’une seule expérience est énorme. Nous pouvons détecter la présence de ces polymères de la paroi cellulaire et savoir exactement comment ils sont répartis dans les cellules et les tissus, et même déterminer leur abondance. Cette méthode est conçue de telle sorte qu’elle puisse être appliquée à presque n’importe quel type de tissu végétaux de n’importe quelle espèce que l’on peut vouloir analyser.
L’immunolocalisation dans les tissus végétaux implique beaucoup de travail méticuleux, difficile à expliquer sans réellement voir ce qui se passe. Avant de recueillir l’échantillon de tissu végétal, remplissez un flacon de verre avec suffisamment de solution fixative froide pour submerger complètement tous les échantillons. Sélectionnez ensuite les tissus végétaux à analyser et coupez les échantillons à une taille maximale de 16 millimètres carrés.
Plongez immédiatement les échantillons dans la solution fixative. Le glutaraldehyde et le formaldéhyde sont tous deux d’excellents fixatifs, mais les deux sont dangereux et doivent être manipulés dans le capot d’écoulement. Transférer le flacon dans une chambre à vide et appliquer lentement le vide.
Lorsque la pression atteint 60 kilos de pascals négatifs, le matériau flottant dans le flacon commence à couler vers le bas. Maintenir la pression dans la chambre à pas plus de 80 kilos de pascals négatifs. Le processus de naufrage peut prendre jusqu’à deux heures.
Après que les échantillons ont été dans la chambre à vide pendant deux heures, relâchez lentement le vide. Sceller le flacon de verre et le réfrigérer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après la fixation de nuit, jetez tous les échantillons qui n’ont pas coulé au fond du flacon.
Lavez les échantillons restants avec 25 millimolar PBS pendant 10 minutes, puis lavez-les dans un tampon PIPES de 25 millimaux pendant 20 minutes. Il est extrêmement important d’enlever tous les échantillons flottants parce qu’il est très probable que le fixatif n’a pas pénétré l’échantillon. Déshydrater les échantillons dans une série d’éthanol, en immergeant les échantillons pendant 20 minutes à chaque concentration d’éthanol.
Pour parcourir les échantillons, ajoutez des concentrations croissantes de résine blanche LR dans l’éthanol, en commençant par une partie de résine à trois parties d’éthanol. À chaque concentration, incuber pendant 24 heures à quatre degrés Celsius. Remplacez la résine blanche LR par de la résine fraîche et incubez les échantillons pendant 12 heures supplémentaires à quatre degrés Celsius.
Préparer les capsules de gélatine d’intégration, en sélectionnant des capsules légèrement plus grandes que les échantillons afin que les échantillons puissent être complètement enfermés dans la résine. Étiquetez les étiquettes de papier avec un crayon parce que l’encre contaminera la résine. Appliquer une goutte de résine blanche LR fraîche au fond de chaque capsule.
Placer un échantillon dans chaque capsule, puis remplir les capsules à pleine capacité avec de la résine fraîche. Mettre le bouchon sur la capsule et presser doucement pour le sceller. Pour polymériser la résine, guérir les capsules à 58 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient complètement durcies vers 24 à 48 heures.
Après avoir épluché la capsule de gélatine de la résine blanche LR, placez le bloc de résine sous le microscope stéréo. À l’aide d’une lame de rasoir tranchante, coupez le bloc blanc LR à un angle de 45 degrés par rapport à l’échantillon. Faites pivoter l’échantillon et faites une deuxième coupe à un angle de 90 degrés par rapport à la première.
Continuer à couper dans le même modèle pour former une pyramide avec l’apex de la pyramide directement au-dessus de la zone d’intérêt de l’échantillon, puis commencer à enlever les fines tranches perpendiculaires à l’axe principal jusqu’à ce que la surface de coupe atteint l’échantillon. Idéalement, l’échantillon cible doit être enfermé dans une forme trapézoïde. Placez le bloc de résine taillé dans l’ultra microtome.
Ajustez l’angle entre le bord du couteau et le bloc de résine. Couper les sections du bloc avec une épaisseur comprise entre 200 et 700 nanomètres. Utilisez une boucle métallique pour soulever soigneusement certaines sections échantillonnées de la microtome.
Placez-les dans une goutte d’eau déionisée distillée sur une toboggan en verre. Évaporer l’eau en plaçant la toboggan sur une plaque chaude à 50 degrés Celsius, puis ajouter une goutte de tache aux sections. Après 30 secondes, rincer la tache et observer la toboggan au microscope pour vérifier l’état général de la section et que la structure de la plante désirée est visible.
Préparez une glissière de réaction propre en plaçant une goutte d’eau déionisée distillée dans chaque puits de la glissière. Transférez une ou deux sections d’échantillon à chaque goutte d’eau. Placez la glissade dans une boîte de Pétri carrée de 10 centimètres, couvrez-la et laissez-la sécher à 50 degrés Celsius.
Pour préparer une chambre d’incubation pour les glissières de réaction, placez des serviettes en papier amorties au fond d’une boîte de pointes de pipette et enveloppez la boîte avec du papier d’aluminium. Transférer les diapositives de la boîte à la chambre d’incubation. Pipette 50 microlitres de solution de blocage dans chaque puits.
Après avoir incubé la lame pendant 10 minutes, retirez la solution de blocage, puis lavez tous les puits deux fois avec du PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Après avoir préparé les principales solutions d’anticorps décrites dans le manuscrit, effectuez un lavage final des puits avec de l’eau déionisée distillée pendant cinq minutes. Pipette la solution d’anticorps primaire dans les puits de réaction, puis pipette la solution de blocage dans les puits de contrôle.
Fermer la chambre d’incubation. Laisser reposer pendant deux heures à température ambiante, puis réfrigérer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez une solution de 1% de l’anticorps secondaire dans la solution de blocage.
Environ 40 microlitres par puits seront nécessaires. Couvrir la solution de papier d’aluminium. Lavez les puits de la glissière de réaction deux fois avec du PBS et une fois avec de l’eau déionisée distillée pendant 10 minutes à chaque fois.
Assurez-vous qu’aucune solution de blocage ou dépôts ne reste dans les puits. Pipette la solution d’anticorps secondaire dans tous les puits. Incuber les glissières dans l’obscurité à température ambiante pendant trois à quatre heures.
Encore une fois, lavez les puits de la glissière de réaction deux fois avec PBS et une fois avec de l’eau déionisée distillée, puis ajoutez une goutte de calcofluor blanc à chaque puits. Sans lavage, ajouter une goutte de milieu de montage à chaque puits et couvrir chaque puits d’un coverslip. Observez les sections de l’échantillon dans la diapositive de réaction à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Pour chaque observation, utilisez un filtre UV pour détecter les parois cellulaires tachées par le Calcofluor et un filtre FITC pour détecter l’immunolocalisation. Pour une meilleure visualisation des résultats, utilisez ImageJ ou un programme similaire d’analyse d’image pour fusionner chaque image de filtre UV avec l’image correspondante du filtre FITC. En identifiant la localisation d’épitopes spécifiques, le protocole permet de caractériser la composition de la paroi cellulaire.
Par exemple, 1, 5-arabinan est abondant dans la paroi cellulaire de l’anthère en développement quercus suber. Les homogalacturonans à peine estérifiés se trouvent généralement à l’extrémité racine de l’embryon quercus suber spécifier les propriétés mécaniques de l’organe. Les xylogalacturonans se trouvent dans les cellules dégénératrices, comme la cellule endosperme pendant les derniers stades de la maturation du gland quercus suber.
Les épitopes d’AGP reconnues par JIM13 ou JIM8 se trouvent sur des structures liées à la reproduction, telles que les lignées cellulaires liées à la microgametogenèse dans Arabidopsis thaliana et les papilles stigmatistiques et microbiennes de l’angiosperme basal Trithuria submersa. Les erreurs courantes dans la mise en œuvre de ce protocole sont généralement faciles à détecter et à identifier. Lorsque les lavages sont sautés ou que les puits de réaction sont autorisés à sécher, l’anticorps secondaire apparaît généralement sous forme de frottis.
Des agrégats de fluorochrome vert se formeront si l’anticorps primaire non lié n’est pas correctement emporté. Le pliage ou le détachement des sections est habituellement lié à une mauvaise adhérence due à l’utilisation de toboggans impurs ou d’un lavage agressif. La préparation de l’échantillon est également essentielle.
Les blocs de résine doivent être exempts de fissures avec un échantillon jaune pâle à brun clair clairement visible. Les échantillons incrustés de façon inefficace montreront des taches blanches poudreuse ou des zones. Garder la taille de l’échantillon sous huit millimètres est essentiel pour la pénétration de la solution fixative.
Les échantillons mal fixés apparaîtront brun foncé ou presque noirs. Une température excessive peut provoquer une fissure de la résine rendant impossible la sectionnement de l’échantillon. L’utilisation de techniques d’immunolocalisation ouvre plusieurs directions de recherche.
On peut suivre des techniques plus spécifiques telles que l’analyse biochimique de la paroi cellulaire ou même procéder à une approche moléculaire. Les résultats fournis par cette technique peuvent aider à comprendre la composition de la paroi cellulaire, une structure extrêmement complexe très difficile à analyser par simple analyse chimique.
