L’électroporation de l’ARNm fournit une expression rapide, efficace et contrôlée spatialement et temporellement de multiples protéines dans le système modèle aviaire. Cette méthode permet une expression plus large et plus rapide des protéines fluorescentes que l’étiquetage obtenu par électroporation standard de l’ADN. L’électroporation facilite l’ouverture transitoire des pores de la membrane plasmatique qui servent de conduits pour le transfert de charges utiles génétiques comme l’ARN et l’ADN dans les cellules de nombreux organismes modèles.
Pour les expériences initiales travaillent avec des embryons qui sont âgés de plus d’un jour car ils sont plus durs et plus résistants aux manipulations externes comme l’électroporation. Au stade de développement embryonnaire approprié, casser délicatement et verser le contenu de l’œuf de caille dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Utilisez une pipette de transfert pour enlever la majorité de l’albumen épais.
Utilisez un tissu de laboratoire pour essuyer doucement la surface du joug pour enlever le reste de l’albumen épais autour de l’embryon pour s’assurer que l’embryon collera fermement à l’anneau de papier. Déposer le papier filtre précoupé sur l’embryon et utiliser des ciseaux pour couper en douceur autour du périmètre de l’embryon. Utilisez une pipette Pasteur pour superposer le SPP sous l’embryon à l’aide de cours d’eau doux pour évacuer tout joug collé au tissu.
Tirez lentement l’anneau de papier embryonnaire à un angle oblique vers le haut et hors du joug. Placer le papier dans une boîte de Pétri remplie de PBS pour un nettoyage plus tard. Une fois que la majeure partie du joug a été enlevée, placez le côté ventral embryonnaire vers le haut dans une boîte de Petri de 35 millimètres recouverte d’un mélange semi-solide d’agar et d’albumen.
Préparer la chambre d’électroporation en connectant l’électrode noire en la remplissant de PBS et en plaçant l’embryon à l’intérieur. Utilisez un microcapillaire en verre pour injecter un bolus de 200 nanolitres d’ARNm dans la cavité entre l’épiblaste et la membrane vitelline couvrant la région désirée. Et puis utiliser l’électrode rouge pour électroporer l’embryon.
Remettre l’embryon électroporé sur le mélange agar-albumen et incuber à 38 degrés Celsius jusqu’au stade de développement souhaité. Pour l’imagerie des protéines fluorescentes codées par électroporation, observez tous les embryons électroporés sous un stéréoscope disséqué fluorescent pour sélectionner l’embryon électroporé le plus sain et le meilleur pour les expériences d’imagerie dynamique. Continuez d’incuber les autres embryons électroplaqués et les embryons non électroplaqués dans un incubateur distinct.
Rincez brièvement l’embryon sélectionné avec du PBS pour enlever les bulles qui pourraient s’être formées sur le côté dorsale de l’embryon pendant l’électroporation. Placez l’embryon nettoyé directement dans un plat d’imagerie contenant une fine couche d’environ 150 microlitres d’albumen-agar en prenant soin de ne pas générer de bulles sur la surface dorsale de l’embryon. Ajouter un petit morceau de papier de soie enroulé humide le long des bords intérieurs du plat d’imagerie.
Sceller le plat avec du film de paraffine pour minimiser l’évaporation pendant l’imagerie et l’incubation. Déplacez le plat rapidement au stade préchauré d’un microscope confocal et utilisez le canal brightfield pour localiser le colorant coloré dans l’embryon. Réglez le logiciel d’imagerie à l’objectif désiré, miroir dichroïque, et spectres d’émission, et allumez un laser approprié.
Prenez soin que les cellules resteront dans la vision de l’image pour l’ensemble du film. Utilisez une résolution d’imagerie suffisamment élevée et assurez-vous que les conditions d’imagerie ne causeront pas de phototoxicité. Cliquez en direct dans le logiciel d’imagerie et ajustez la puissance laser à un réglage qui convient à l’intensité de fluorescence en fonction de chaque puissance laser au microscope.
Commencez à imaginer l’embryon à l’aide d’une puissance laser de 1 % et d’un gain de 800, augmentant lentement la puissance du laser de 1 % par incréments jusqu’à ce que des pixels saturés soient vus. Lorsque des pixels saturés sont observés, diminuez légèrement la puissance du laser jusqu’à ce qu’aucun pixel saturé ne puisse être visualisé. Imagez l’embryon toutes les trois à cinq minutes pour vérifier la migration des cellules individuelles à travers différents points de temps à l’aide de cinq micromètres Z-stacks de toute la zone électroplaquée avec un peu d’espace supplémentaire vers le bas de la pile Z au cas où l’embryon s’enfonce dans le lit agarose pendant la séance d’imagerie.
Pour observer la vitesse à laquelle les cellules se déplacent, vérifiez les premiers points de temps du premier film. Si les cellules se déplacent à un rythme rapide, envisagez d’élargir le zoom de la zone imageée ou d’imagerie d’une autre région. Lorsque toute la région électroplaquée de l’embryon a été photographiée, image dans la région non plaquée du même embryon pour déterminer les niveaux d’autofluorescence.
Pour déterminer combien de temps l’ARNm transfecté peut être traduit en protéines fluorescentes après avoir confirmé l’électroporation du gène d’intérêt sur le microscope stéréo, placez l’embryon sur une étape préchauffée du microscope confocal inversé et utilisez le laser de 405 nanomètres avec une puissance laser de 70 %, 100 itérations et une vitesse de balayage de quatre à photobleach la majeure partie de la fluorescence cellulaire du gène électroplaqué à une variété de points de temps. Continuer à incuber les embryons sur la scène à 36 degrés Celsius après le blanchiment photo, en prenant soin de prêter attention aux cellules qui se divisent activement dans la région photobleached qui ne sont généralement vus que chez les embryons en bonne santé et indiquent ainsi que l’électroporation n’a pas nui aux cellules embryonnaires. Obtenez des images de la pile Z post-eau de Javel de la région électroplaquée pour une durée désirée à intervalles réguliers de trois à cinq minutes.
S’assurer que les conditions d’imagerie n’affectent pas de façon délétératoire la survie de l’embryon en même temps que les embryons électroplaqués qui ne sont pas photobleached pour servir de contrôle pour l’imagerie. Pour quantifier les résultats de photobleaching pour la désintégration de l’ARNm après électroporation, utilisez ImageJ pour mesurer l’intensité de fluorescence d’un cercle de 7,5 micromètres au centre de la zone électroplaquée de chaque cellule pour suivre la fluorescence cellulaire sur chaque intervalle de trois à cinq minutes. Lorsque toutes les cellules de la région photobleached qui ne subissent pas de mitose et ont été complètement photobleached ont été mesurées, tracer l’intensité de fluorescence au fil du temps après l’eau de Javel à chacun des points de temps de l’embryon a été photobleached.
Bien que l’électroporation de l’ADN entraîne une fluorescence plus brillante dans certaines cellules électroplaquées, l’efficacité de l’électroporation de l’ADN est visiblement plus faible par rapport aux protéines fluorescentes codées par l’ARNm largement exprimées. Lorsqu’on compare la co-électroporation de l’ADN et de l’ARNm dans le même embryon, l’ADN exprimant l’efficacité des protéines fluorescentes est également significativement et constamment moins efficace que celui de l’ARNm exprimant la protéine fluorescente. La quantification de tous les embryons électroplaqués avec seulement de l’ARNm, de l’ADN ou une combinaison des deux, révèle que l’ARNm transfecte environ 75 % des cellules d’une région donnée, tandis que l’ADN ne transfecte qu’environ 25 % des cellules.
L’ARNm transfecté devrait conduire à une production de protéines plus rapide par rapport à l’ADN transfecté puisque l’ARNm peut être immédiatement reconnu par les machines de traduction cytosoliques. Bien que la co-électroporation de plusieurs AND se soit déjà révélé relativement inefficace, la co-électroporation de quatre ARNM dans cette expérience a entraîné une efficacité de transfection de 87 % des quatre ARNM dans toutes les régions électroplaquées. Bien que le photobleaching réduise d’abord l’intensité de fluorescence dans les cellules photobleached d’environ 95%, certaines cellules restent qui récupèrent leur capacité à diviser et exprimer des protéines fluorescentes peu de temps après l’électroporation.
Cette capacité diminue toutefois plus de cinq heures après électroporation. Prenez votre temps à optimiser les meilleures conditions d’imagerie et continuer à bricoler, même après avoir commencé le film étant prêt à faire des ajustements si nécessaire.
